CGT前沿分享 | 细胞基因治疗病毒载体研究报告

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01、病毒载体：最常用的基因递送载体之一

1.1 病毒载体是通过改造病毒来递送基因的常用工具 

病毒载体是一种常用的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞进行感染的分子机制。病毒是一种由核酸分子和蛋白质构成的非细胞形态生物，能够携带基因进入受体细胞，经开发和改造后可用作CGT载体。由于病毒的多样性及宿主机体的高度复杂性，目前仅腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒和溶瘤病毒等少数种类可改造为CGT载体。经过改造且携带治疗性基因的病毒，即重组病毒载体。 通过改造后的病毒载体一般具有更好的安全性和更快的分子克隆速度，同时感染能力也得到了定向进化，从而具备了更快捷、更广谱的转导特性，以及更安全、更特异的感染特性。病毒载体可通过受体配体识别、细胞内吞等多种途径进入细胞，并完成目的基因递送。

1.2 病毒载体在基因治疗和细胞治疗产业有重要的地位

在基因和细胞治疗中，使用的载体可以分为病毒载体和非病毒载体；迄今为止，大多数基因疗法利用病毒载体来传递目标基因。据Samantha L. Ginn综述文章的统计，在1989-2017年间基因治疗的所有临床试验中，使用病毒载体的临床占总数的67.3%。根据《An Analysis Of The Gene Therapy Viral Vector Landscape》，目前常用的病毒载体包括腺相关病毒（AAV）、慢病毒（LV）、仙台病毒、腺病毒（AdV）、逆转录病毒和溶瘤病毒等，相比于腺病毒和逆转录病毒来说，慢病毒载体和AAV载体安全性较好，二者在临床试验中使用的数量也越来越多。非病毒载体主要有脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒，外泌体等。该类载体具有低免疫原型、低成本、易规模化生产等优点，但转染效率、细胞毒性、靶向性等问题还有待解决。

02、细胞治疗与基因治疗（CGT）高速发展，助力病毒载体生产行业爆发

病毒载体是细胞治疗与基因治疗的重要物料，而伴随着细胞治疗和基因治疗的高速发展，病毒载体生产行业正在迎来重大利好。

2.1 细胞治疗和基因治疗迎来高速发展期

CGT行业正准备进入快速发展阶段，2015-2020年临床试验数量复合年均增长率超60%。根据弗若斯特沙利文2021年发布的报告《中国细胞与基因治疗发展白皮书》，中国CGT临床试验数量爆发式增长，数量仅次于美国，结合国家利好政策的推动，CGT行业将进入快速发展阶段。自2015年开始，中国CGT疗法的临床试验数量快速增长。2015年至2020年间，中国累计开展了约250项CGT临床试验，已成为数量仅次于美国的地区，复合年均增长率超过60%，位列全球第一。截至2021年6月，中国正在开展的CGT临床试验约100项，涉及大小公司约80家。

CGT药物全球商业化进程持续加快，在研CGT临床试验项目已近2000项。在技术、资本和政策的驱动下，全球CGT行业快速升温，大量CGT药物研发进入临床阶段，并自2015年起呈现爆发式增长。根据 ASGCT（American Society of Gene＋Cell Therapy，美国权威的细胞和基因治疗协会）的数据，截至2020年底，全球累计在研CGT临床试验超过1,300项，到2022年第一季度末已达到1,986项。

CAR-T细胞治疗市场增速迅猛，中国市场规模于2030年有望增至289亿。根据弗若斯特沙利文的数据，全球CAR-T细胞治疗市场从2017年的0.1亿美元增长到2020年的11亿美元，预计未来几年将加速增长，2021年至2024年复合年均增长率或可达到53.0%。预计2030年市场将进一步增长至218亿美元，2024年至2030年复合年均增长率为22.1%。2021年中国首款CAR-T药物获批上市，预计市场规模约为2亿元人民币。未来，在癌症患者增加、政策优惠和患者负担能力提高的推动下，预计2024年和2030年市场规模将分别进一步增长至53亿元和289亿元，2024年至2030年CAGR将达到32.6%。

根据弗若斯特沙利文的统计，全球CGT行业市场规模自2016年开始飞速增长，预计中国CGT行业市场规模在政策利好及研发投入增长的背景下也将快速扩增。2025年全球整体市场规模或可到305亿美元（复合年均增长率71%），中国整体市场规模达29.5亿美元（复合年均增长率276%）。

2016年至2020年，全球CGT市场规模从0.5亿美元增至20.8亿美元，复合年均增长率约为153%。根据弗若斯特沙利文咨询预测，未来CGT市场规模仍保持快速增长趋势，预计于2025年全球整体市场规模为305.4亿美元，2020年至2025年（估计）全球CGT市场复合年均增长率约为71%。

2016年至2020年，中国CGT市场规模从0.02亿美元增至0.03亿美元，复合年均增长率约为12%。根据弗若斯特沙利文咨询预测，预测未来中国CGT市场规模仍保持快速增长趋势，于2025年整体市场规模为25.9亿美元，2020年至2025年（估计）中国CGT市场复合年均增长率约为276%。

2.2 病毒载体的生产对CDMO产业依赖度高

病毒载体的生产是细胞与基因治疗CDMO市场最为关键的细分领域之一。根据《纽约时报》的报道，病毒载体的生产占CGT研发投入1/3以上的费用。随着市场对于创新和优化的需求持续增加，会使得基因治疗和细胞治疗的分工更为细化，从而推动药企和生物科技寻求更为专业的CRO和CDMO服务以降低成本。

CGT公司约八成为初创公司，与基础研究转化联系紧密，依赖CDMO提供产业化服务。根据 ARM 报告、弗若斯特沙利文分析，截至2020年12月31日，全球约500家CGT公司中，79.1%为初创公司；截至2021年7月20日，在中国CDE有产品临床试验公示的48家CGT公司中，75.0%为初创公司。CGT初创新药企业在药物开发、临床申报至商业化生产过程中，由于受到工艺开发能力、GMP 生产经验、临床申报相关法规知识的限制，更多依赖专业的CRO和CDMO。据和元生物招股书的数据，基因治疗外包渗透率超过65%，远超传统生物制剂的35%。

03、当前使用最广泛的两种病毒载体：腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV）

腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV）是当前使用最广泛的两种病毒载体，其中AAV常用于基因治疗，LV常用于细胞治疗。LV基因组长度为9kB，有更强的嗜性，能够感染非分裂细胞，同时在安全性上较逆转录病毒（RV）更安全；AAV基因组长度为 4.8kB，其宿主范围极为广泛，长时程基因表达，治疗效果持久，同时其免疫原性极低，肝毒性低，但包装容量小，感染到表达的时间比较长。

3.1 腺相关病毒载体∶基因治疗的万金油，广泛用于体内或全身基因治疗

3.1.1 腺病毒载体1965年被发现，1995年第一次用于人类疾病治疗

腺相关病毒（AAV）最早于1965年首次在实验室的腺病毒制剂中被发现，随后科学家对其进行了多角度的研究。1982年成功完成了AAV2基因组的克隆以及测序工作。1995年，AAV载体首次用于治疗人类的囊性纤维化病。进入21世纪后，科研人员发现了更多不同的AAV血清型家族，丰富了AAV载体的选择范围。2008年，科研人员在治疗菜伯氏先天性黑蒙症时利用了基于AAV载体的基因疗法，获得了良好的成果。2012年，第一个基于AAV用于治疗脂蛋白脂酶缺乏症LPLD的基因治疗药物Glybera获得了欧洲药品管理局EMA的批准。5年后，治疗由RPE65基因突变导致的遗传性视网膜疾病的AAV基因治疗产品Luxturna获得美国食品药品管理局FDA的批准。

3.1.2 腺相关病毒是一种安全性较高的细小病毒，通过整合到人类基因组中实现长期潜伏

AAV属于细小病毒科依赖性细小病毒属，它由一个直径约26nm的二十面体蛋白质衣壳和一个约4.8kb的单链DNA基因组组成，该基因组可以是正义链也可以是反义链。病毒衣壳由VP1、VP2和VP3三种亚基构成，三种亚基的比例为1∶1∶10，共60份拷贝。目前的普遍共识是AAV病毒不会引起人类疾病，安全性非常高。

AAV 病毒的基因组两侧有两个T型末端反向重复序列（ITRs），它们主要担任病毒复制起点和包装信号的角色。基因组主要由rep基因和cap基因构成，其中rep基因负责编码病毒复制所需的四种蛋白质Rep78，Rep68，Rep52和Rep40（按分子量命名），cap基因通过不同起始密码子的选择性剪接和翻译实现三种衣壳亚基的编码。除此之外，负责编码装配激活蛋白（AAP）的第三个基因被编码在cap序列的不同阅读框中。

在人类细胞中，AAV基因组可以整合到一个被称为AAVS1的基因组位点从而实现长期潜伏。这一现象的部分原因是AAVS1位点的序列和ITR的序列有很大的相似性，位点的插入同样需要rep基因编码蛋白的活性，缺乏rep基因的重组AAV载体的基因组整合效率会大大降低。

纯化后的AAV病毒载体可以用于侵染细胞，侵染细胞时，AAV与细胞表面特异性受体结合，激活胞内信号通路，进而触发AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞，在核内体、高尔基体等细胞器的协助下进入细胞核，随后病毒裂解，其单链DNA需复制成为双链DNA后表达目的基因。

3.1.3 AAV载体改造策略∶分型发现、设计及修饰

当前用于AAV不同分型病毒发现的方法主要有四类∶

进化筛选∶模拟自然进化的机制，在衣壳蛋白中引入大量随机突变，然后在选择压力下筛选出具有特定生物性质和特征的衣壳。

定向设计∶将特定多肽序列嫁接在衣壳表面，让它们可以与特定细胞表面的受体相结合。

发现天然AAV∶筛选天然存在的AAV病毒，如已经发现的有AAVrh.10、猪AAV等。

计算机模拟设计∶使用计算机算法进行模拟，根据不同的分型特性进行重组。

为了将野生型AAV变成适合体内基因递送的重组型AAV载体，研究人员对其进行了一系列的遗传改造。重组型AAV载体的病毒衣壳依然沿用野生型AAV的序列与构造，如完全剔除了rep基因和cap基因，仅仅保留有了负责引导病毒载体基因组复制和包装的ITRs序列。与野生型AAV相比，这种改造在很大程度上提高了AAV载体的装载量并极大程度上降低了体内免疫原性和毒性。与AAV载体复制和装配相关的rep、cap基因元件以及腺病毒辅助基因元件被分别克隆到其它质粒载体上，这样的设计允许利用多质粒瞬转系统大量制备科研或者临床级别的重组AAV载体产品。

值得注意的是，重组AAV载体基因组的最大装载量不超过5kb，要求研究人员必须仔细设计有效载荷，不仅要考虑治疗性转基因序列，还要考虑基因表达所需的调控元件，例如启动子和多聚腺苷化信号等。

3.1.4 AAV载体的优势与面临的挑战

AAV载体具有器官靶向性、安全性高以及长效性等优点，但同时存在包装容量小、感染到表达的时间比较长等缺点。

重组的AAV2血清型病毒载体仍然处于主流位置。从2003-2019年的144项披露了AAV病毒衣壳数据的临床试验中分析发现，重组的AAV2血清型仍然处于主流位置，并且具有最多的安全性和有效性证据，截至2019年末已经有超过40项使用AAV2病毒载体的临床试验完成全部流程。

利用组织特异性启动子实现组织特异性表达成为新趋势。从104项披露了启动子数据的临床试验中分析发现，像CBA、CAG和CMV等泛表达类的启动子依然受到研究者的广泛青睐，而在2015-2019年间，超过25项临床试验使用了组织特异性启动子来实现特定组织的表达，例如白蛋白启动子和突触蛋白启动子等。

AAV载体同样也面临着一些问题∶

1.人体预存免疫影响疗效∶据流行病学统计，40-80%的人体内携带针对AAV的抗体。这可能导致AAV作为基因疗法载体在未递送转基因时就被免疫系统摧毁，降低转基因的表达水平。解决这一难题的策略包括使用从非人灵长类中分离的AAV衣壳，AAV载体的理性设计与定向进化。

2.需要继续优化AAV载体的组织特异性来提高靶向性：几乎所有天然AAV衣壳蛋白都能够在肝脏中引发有效的转基因表达其中，AAV8和AAV9衣壳蛋白能够靶向身体中的多种肌肉类型；AAV9和AAVrh.10能够穿越血脑屏障。通过载体设计优化得到更多组织特异性更佳的AAV载体也是当前的研究方向之一。

3.AAV载体的容量较小，只有约4.7kb∶对于很多较大的基因，需要选择其截断的功能区域。如递送FVIII时去除了其B-domain；递送DMD基因时仅选择了micro-DMD基因。

3.1.5 基于AAV载体的基因治疗临床试验数量猛增

截至2022年6月，在ClinicalTrials.gov上登记了239项以AAV为载体的基因治疗临床试验。2016年至2022年6月，临床以AAV为载体的基因治疗试验数量增长迅猛，从2016年的不足10个增至2018年11月的145个，再到2022年6月进一步提升至239个。尽管临床试验中所用最多的是基于AAV2血清型的载体，但是新的血清型如AAV8、AAV9也在不断被用于临床试验。大多临床试验通过进行I/II期合并临床试验以加速研发进程。以AAV为载体的基因治疗主要靶向眼、肝、肌肉和脑部，其中尤以靶向眼部疾病的临床试验数量为多，占比约21%。

3.1.6 AAV载体生产方式主要有三种，基于Sf9细胞的杆状病毒表达载体系统是实现大规模生产的重要方法

在AAV载体的生产中，目前主流的方法主要有三种∶1、基于HEK293细胞的三质粒转染系统；2、哺乳动物稳定细胞系；3、基于夜蛾昆虫细胞（Sf9）的杆状病毒表达载体系统。

1.HEK293三质粒共转染工艺的方法是研究级与临床前使用的AAV载体的主要生产方式；HEK293三质粒转染中的质粒分别有∶含ITRs和目的基因的顺式质粒、含rep和cap基因的反式质粒、提供E2a/b、E4和VARNA基因的Ad辅助质粒三种质粒，共转染HEK293细胞（表达Ela和Elb基因）来生产AAV载体。此方法中细胞通常以半贴壁的方式培养，在转染后2-3天达到最高生产力，随着时间的推移失去活力。

2.哺乳动物稳定细胞系：上世纪90年代，Clark等人将rep/cap和AAV载体基因组克隆到表达质粒中，并使其稳定感染Hela细胞，首次建立了基于Hela的生产细胞系。近来开发的混合rAAV/rAd载体，将转基因载体和腺病毒元件同时递送，从而使稳定整合的AAV基因在Hela细胞系中获得rep-cap的高表达。稳定细胞系生产可以消除常规生产中的外来辅助污染物（如外源性病毒、质粒污染物等）。但是稳转株内的基因产物可能组装成杂质，造成潜在的安全隐患。

3.杆状病毒/Sf9系统是在锥体夜蛾昆虫细胞（Sf9）中使用杆状病毒表达载体（BEV）来生产AAV病毒载体。该方法是利用携带AAV载体基因组的BEV感染Sf9细胞。由于杆状病毒具有辅助功能，BEV系统与Sf9细胞系结合可以稳定表达，用于高滴度的大规模载体生产。

3.2 慢病毒载体∶体外基因修饰细胞治疗（含CAR-T疗法）最常用的载体

3.2.1 慢病毒载体是基因治疗和CAR-T细胞治疗的重要物料

慢病毒载体（LVs）是传递遗传物质最常用的转移载体之一，也是改造造血细胞以纠正原发性免疫缺陷、血红蛋白病和白血病的首选载体。慢病毒载体也被广泛用于修改T细胞以通过免疫疗法治疗癌症（如嵌合抗原受体T细胞疗法，CAR-T）。在基因组编辑中，LV被用来传递序列特异性设计核酸酶和DNA模板。

3.2.2 LVs载体的前身是HIV-1，具有免疫原性低、安全性高等多重优点

慢病毒（Lentivirus）载体是一种单链RNA病毒，是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的CGT载体，能够感染分裂和非分裂细胞。慢病毒可以将外源片段随机插入细胞基因组，因此可以在体内长期表达目的基因，同时慢病毒载体具有表达时间长、安全性高等优点，是重要的基因操作工具。

慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA， 回到细胞浆中， 表达目的蛋白或产生小 RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。

3.2.3 四质粒共转染工艺是LV载体生产的最常用方式，稳定转染生产细胞系可能是未来工业大规模连续过程的理想系统

HIV维持生存的基本基因包括gag、pol和env基因；gag编码结构蛋白，pol编码逆转录酶和整合酶，env编码病毒包膜糖蛋白。LV的构建基于野生型HIV-1病毒。为了避免有复制能力病毒（RCV）的产生，在构建HIV-1型病毒载体时一般将HIV-1基因组分装于几个质粒载体中，再共转染细胞，然后获得只有一次感染能力而无复制能力的HIV-1载体颗粒。

四质粒共转染工艺（第三代系统）是目前用于研发和临床的最多的系统。该系统由1个包含目的基因的表达质粒、2个包装质粒、1个包膜蛋白质粒，共4个质粒组成。包装构建体在此系统中被进一步拆分，gag-pro-pol和rev基因被分离在两个独立的质粒中。包膜蛋白质粒使用水疱性口炎病毒的糖蛋白G基因（VSV-G）替代了病毒原有的env基因。应用了VSV-G包膜的假构型慢病毒载体，扩大了载体的靶细胞嗜性范围，同时也增加了载体的稳定性。

四质粒包装系统，极大地降低了产生具有复制能力慢病毒的可能性，而VSV-G蛋白的使用也降低了这种重组的可能性。更新的第四代系统通过密码子优化，对rev蛋白（促进晚期基因转录的因子）的需求也被取消。但是滴度较低，应用尚少。

稳定包装细胞系提供了可重复的和可扩展的生产过程，同时降低了成本，且由于降低了病毒表达载体之间的重组概率，生产的安全性也得到了提升。其可扩展性还可以适应无血清悬浮培养体系。所以在慢病毒生产中稳定包装细胞系的应用是要优于瞬时转染系统的，虽然建立慢病毒生产稳定细胞系也存在诸多困难，特别是一些病毒蛋白对细胞具有显著毒性，但这依然是行业未来发展的一个重要方向。

04、病毒载体相关产业监管日趋完善，多项利好政策密集出台

4.1 病毒载体生产受药监局与卫健委监管，从准入、研发、注册、生产到上市的全流程具有完整的规范标准，准入门槛高

病毒载体生产所在的CGT研发和生产外包服务行业属于国家发改委颁布的《产业结构调整指导目录（2019年本）》中规定的鼓励类产业；行业主管部门包括国家药品监督管理局、国家卫生健康委员会等。

病毒载体生产所处的CGT研发与生产外包服务行业，虽然NMPA暂无明确监管规定，但NMPA关于CGT和整体医药行业的监管对于本行业有重要影响。在《中华人民共和国药品管理法》框架下，NMPA制定了《药品生产质量管理规范》等一系列规定，规范了国内药物非临床、临床试验和生产工作；同时针对CGT，要求符合《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》等相关规定。

行业准入管理机制

《中华人民共和国药品管理法》规定，药品生产企业依据药物总体研发策略进行实验室研究、非临床研究和临床研究等开发药物；并按照《药品注册管理办法》等相关要求对所研究的药物进行注册。

研发需要按照药品管理法进行

通过对候选药物进行实验室研究和动物试验等临床前研究，观察其生物活性和初步安全性。完成临床前研究后，按照《中华人民共和国药品管理法》等相关规定，进行新药临床试验申请或药物生物等效性试验备案。

药品注册机制

国家药品监督管理局药品审评中心负责药物临床试验申请、药品上市许可申请、补充申请和境外生产药品再注册申请等的审评。药品审评单位根据药品注册申报资料、核查结果、检验结果等，对药品的安全性、有效性和质量可控性等进行综合审评，综合审评结论通过的，批准药品上市，发给药品注册批件。

生产质量管理制度需要遵守GMP标准

从事药品生产活动应当遵守《药品生产质量管理规范》（GMP），建立健全药品生产质量管理体系，保证药品生产全过程持续符合法定要求。2019年12月1日施行的《中华人民共和国药品管理法》取消了GMP的强制认证，改为动态检查GMP执行情况，加强了事中及事后监管。

药品上市许可持有人制度

国家对药品管理实行药品上市许可持有人制度（MAH）。药品上市许可持有人系指取得药品注册证书的企业或者药品研制机构，可以自行生产药品，也可以委托药品生产企业生产。

4.2 近三年与病毒载体相关的法规密集发布，促进行业规范化发展

4.3 国家药监局与药物评审中心2020年以来，对病毒载体及其相关的基因治疗、细胞治疗行业密集发布多份行业法规，病毒载体生产行业快速走向规范化发展道路。

4.4 政策鼓励，多份政府重要发展规范鼓励病毒载体相关产业发展

病毒载体及其相关的细胞治疗、基因治疗等产业在“十三五”，“十四五”计划中均受到重点鼓励，并被发改委，知识产权局以及上海市政府等多个政府部门的发展规划中列为重点鼓励产业。

参考文献：兴业证券经济与金融研究院. 病毒载体——CGT关键原料，关注外包生产，2022.

2022年细胞治疗研发图鉴大海报