科研丨WR: 废水微生物影响河流附着生物的微生物多样性和重要生态功能

编译：微科盟小易，编辑：微科盟居居、江舜尧。

微科盟原创微文，欢迎转发转载，转载须注明来源《微生态》公众号。

导读  

污水处理厂的废水会影响受纳河流中的微生物群落。然而，相对于其他废水成分(如营养物质和微污染物)，人们对废水中微生物的作用知之甚少。因此，本研究旨在确定废水微生物对河流中附着生物微生物多样性和功能的影响。

我们使用了一种流动通道系统，在暴露于溪水和未过滤/超滤废水的混合物时培养附着生物。评估了水质对附着生物生物量、活性、对微污染物的耐受性以及微生物多样性的影响。

研究结果表明，废水微生物会定植于附着生物，并改变其群落组成，如导致绿弯菌门的丰度增加，硅藻和绿藻的丰度减少。营养化学计量的变化和碳基质矿化潜力的增加表明，这导致了生物群落向异养转变。暴露于未过滤废水(而非超滤废水)中的附着生物对微污染物的耐受性增加，这表明废水微生物是造成其耐受性增加的原因。

综上，本研究的结果强调了在研究废水对受纳水体的潜在影响时，需考虑废水微生物的作用。

图文摘要    

论文ID

原名：Wastewater microorganisms impact microbial diversity and important ecological functions of stream periphyton

译名：废水微生物影响河流附着生物的微生物多样性和重要生态功能

期刊：Water Research

IF：13.4

发表时间：2022.9.14

通讯作者：Ahmed Tlili

通讯作者单位：瑞士联邦水科学与技术研究所 

实验设计

结果与讨论

1 水体和附着生物中的微污染物 

正如我们预期所想，河道水中每种可量化物质的测量浓度随着废水比例的增加而增加(图1A)，这表明废水是河道中微污染物的主要来源。

结果还表明，对于30%和80%的废水比例，未过滤和超滤废水中微污染物浓度相似。这一发现证实超滤主要去除了废水中微生物，并没有改变废水中的微污染物组成和浓度。 

由于将影响与实际暴露浓度相联系很重要，我们还量化了附着生物中积累的微污染物(图1B)。我们发现，附着生物体和水中的微污染物浓度之间存在正相关关系(图S4A)，这表明附着生物体中积累了微污染物。然而，生物浓缩因子(BCFs)表明，积累量与被测物质相关，其中，BCFs是通过将附着生物中的浓度除以水中的浓度得出的。

除草剂敌草隆、DEET、异丙隆以及一些药物(如克拉霉素和利多卡因)的BCF值最高(图1C和表S6)，我们在之前使用相同实验系统和处理废水的研究中也观察到了这种现象。

生物累积的差异可以用化合物的物理化学性质的差异来解释，我们发现BCFs与对数转换辛醇/水分配系数(LogKow)呈正相关(图S4B)。PSII抑制剂(如除草剂敌草隆和异丙隆)相对较高的生物累积，也可能是由于主导附着生物的光营养生物体内存在特定的分子结合位点，如光合器中的蛋白质D1。

相反，其他物质(如人工甜味剂安赛蜜)的BCF值相对较低，这可能是因为它们在附着生物细胞内具有较高的生物转化率。

图1. 河道水和附着生物中的微污染物浓度。

共54种物质，包括4种人工甜味剂、2种缓蚀剂、22种杀虫剂、25种药物和咖啡因。(A)水样中的微污染物浓度/ng L-1；(B)附着生物样品中的微污染物浓度/ng mg-1；(C)生物浓缩因子：附着生物中的微污染物浓度与水中平均浓度之间的比值。

处理对应于0%(对照)、30%和80%的未过滤(WW)和超滤(UF)废水。数值为4个重复样品的平均值±SD。(原图2) 

2 附着生物表征 

本研究发现，废水(无论是否过滤)对大多数传统附着生物特征没有显著影响，即生物量、光合效率或初级和次级生产(表1)，这在之前也有报道。另一方面，暴露于80%未过滤和超滤废水的附着生物的基础呼吸显著增加，表明向异养的潜在转变。废水对营养物质化学计量的显著影响进一步支持了这一结论。

无论采用哪种处理方法，暴露于废水中的附着生物，与对照相比，其C:N和C:P摩尔比更低，其值更接近细菌而非藻类(表1)。例如，异养细菌细胞的C:P比约为45，而藻类的C:P比约为106。此外，细菌比藻类具有更高的吸收无机磷的能力。

因此，向异养的转变也可用附着生物细胞外基质营养成分的变化来解释，这可能是废水营养输入的结果。河道内水质的分析证实了这一点，添加80%未过滤和超滤废水处理组中的正磷酸盐、硝酸盐和溶解有机碳浓度(分别为1.6±0.2、7.3±1.7和5.7±0.6 mg L−1)高于对照组(0.5±0.05、4.9±0.7和2.5±0.3 mg L−1)。

根据异养生物矿化各类碳源进行呼吸作用的能力建立了群落水平生理活性(CLPPs)，其变化可反映废水对附着生物异养成分的影响(图2)。事实上，暴露于未过滤和超滤废水中的附着生物的呼吸特征有所不同，且沿PCA 1和PCA 2轴不同于对照组群落。PCA 1与河道中的废水比例明显相关，且随着废水比例增加，对所有碳基质的矿化潜力更高。

这些结果再次强调废水暴露有利于附着生物群落中异养活动的增加，这可能是废水排放物中的有机物和营养物质所致。有趣的是，暴露于超滤废水的生物群落与对照组之间的差异性不如暴露于未过滤废水的附着生物群落明显。

这表明，废水中的微生物在一定程度上促成了附着生物呼吸状况的改变，而这一点迄今为止从未被报道过。我们在此假设，与溪水中的微生物相比，废水微生物暴露于更高的多样性和碳源数量，因此可能为更丰富的底物发展出了更高的潜在矿化能力。

表1. 附着生物描述特征(平均值±标准差)。

小写字母表示处理组之间的差异显著性(a<b<c，Tukey检验，P<0.05)；0% (对照)、30%和80%废水(WW)和超滤废水(UF)。加粗值对应每个处理组与对照组之间的显著差异。

图2. 附着生物中异养生物群落水平生理活性(CLPP)的主成分分析(PCA)。

群落水平生理剖面是基于异养生物矿化各类碳源的能力所建立的，包括3种氨基酸、8种碳水化合物、2种羧酸和1种有机磺酸，以及没有外加碳源的对照(即测量基础呼吸作用)。(原图3) 

3 附着生物对微污染物的耐受性 

附着生物中微生物群落对污水处理厂微污染物的耐受性增加被认为是一个将微污染物与其他压力源的具体影响区分开来的指标。我们评估了附着生物对复杂微污染物混合物的耐受性，该混合物代表了废水中发现的微污染物(图S5和表S7)。

无论采用何种处理方法，均未观察到废水对附着生物在初级生产力和呼吸作用方面耐受性的影响，且在测定次级生产力时，由于没有抑制作用和重复之间的高可变性，未得到确定的结果(表2和图S6)。

与此形成鲜明对比的是，暴露于30%和80%未过滤废水的附着生物光合PSII产量的EC50值明显高于对照，这表明光营养生物群落对微污染物混合物的耐受性增加，我们之前的研究也表明了这一点。可能与PSII抑制剂的作用方式有关，它们与PSII复合体D1蛋白上的QB结合生态位相结合，从而阻断从QA到QB的电子传输。

有人认为，在暴露于此类抑制剂后，耐受性光养物种可以上调D1蛋白的表达，导致QB-PSII抑制剂复合物的丰度增加。因此，与敏感物种占主导地位的群落相比，以此类耐受物种为主的群落能够应对较高的暴露浓度，从而导致较高的EC50值。这与我们发现的除草剂PSII抑制剂(如敌草隆和异丙隆)的较高BCF一致。然而，正如应激诱导的群落敏感性概念所体现的那样，群落对微污染物的耐受性增加可能导致对其他应激源的敏感性增强，并改变生态功能，从而对生态系统功能产生负面影响。

无论潜在机制如何，本研究的一个重要见解是，废水超滤后，去除了99%以上的微生物，附着生物的耐受性没有增加(表2和图S6)。同样，Desiante等人报告了废水超滤后，附着生物失去了微污染物生物转化潜力，这是可潜在解释耐受性的机制之一。

总的来说，这些发现首次指出了废水微生物在群落对微污染物的耐受性方面发挥着主要作用。可以想象，这些微生物在被释放到溪流中之前，可能已经对污水处理厂中的微污染物产生了耐受性。

要了解它们是直接通过耐微污染物类群对附着生物的定植，还是间接通过改变群落内物种的相互作用来实现，还需要对附着生物以及废水和溪水中的微生物多样性进行全面表征。

表2. 5个处理组附着生物的耐受性测定(EC50值)。

括号中的值对应95%置信区间；

R值是30%WW、30%UF、80%WW和80%UF的EC50平均值除以每个终点的对照EC50的比值。n.d.表示由于没有抑制作用而未确定。加粗值表示处理组和对照组之间具有显著差异。 

4 附着生物和水体中的微生物多样性及分类丰度

4.1 溪流和废水群落对附着生物群落的相对贡献 

关于废水和溪流微生物(即源群落)对附着生物微生物组成(即汇群落)的相对贡献，人们知之甚少。为了解决这一知识缺口，我们使用微生物源跟踪工具FEAST，并分析了原核生物和真核生物的测序数据。我们的结果清楚地表明，废水对附着生物群落的贡献很大，且对原核生物的贡献高于真核生物(图3)。

例如，暴露于80%废水对附着生物中的原核生物和真核生物相对贡献比例分别达到79%和38%。这与我们在暴露于废水的附着生物中观察到的向异养转变相一致，因为附着生物中的原核生物主要为异养细菌。另一证据来自于未过滤废水和超滤废水中附着生物的比较：我们观察到，暴露于超滤废水的附着生物中废水群落的相对比例大幅降低(图3)。这导致，例如对于真核生物，暴露于30%和80%超滤废水的附着生物中废水群落比例≤5%，从而证实了废水微生物定植附着生物的能力。

与我们分析中所包含的来源特征不匹配的被分为未知来源。此类分析用于确定其他未知微生物源对通道的潜在污染。在我们的研究中，超滤不仅导致附着生物中溪流源生物群落的相对比例增加，还导致未知来源的比例增加。

未知来源比例相对较高的原因可能是Maiandros通道系统中存在微生物，更具体地说，对于超滤处理，微生物可能在膜背面定殖形成不同群落。与周围水体相比，附着生物群落的定植动态本身以及物种相互作用也可能导致不同的群落组装，从而可能导致未知来源的比例相对较高。这使得附着生物不同于溪流水中的游离微生物，对此，一些实地调查表明，下游细菌群落是上游和污水的混合物。

图3. 使用快速期望最大化微生物源跟踪(FEAST)分析不同水源对附着生物中的原核和真核生物的贡献比例。

确定每个河道群落(即附着生物群落)的每个源群落(即溪水、未过滤废水和超滤废水)的相对贡献。FEAST还报告了归因于其他来源(即未知来源)的潜在比例。(原图4)

4.2 废水和废水微生物对附着生物群落结构的影响

我们使用常用的α(即给定群落的分类丰富度和Shannon多样性指数)和β多样性(即几个微生物群落之间的结构差异)，进一步评估了废水对附着生物群落结构的影响。虽然真核生物的α多样性不受废水影响，但与对照组相比，暴露于80%废水的附着生物中原核生物的分类丰富度(Chao1)和Shannon多样性均下降，未过滤和超滤废水处理组之间没有显著差异(图4A)。

相反，废水导致所有处理组中原核和真核生物群落的β多样性明显分离(PERMANOVA，P=0.001，图5B)。事实上，暴露于未过滤和超滤废水中的附着生物群落不同，均不同于对照群落(两两PERMANOVA，P<0.05)。

一些现场和中试研究也报告了废水对附着生物群落结构的影响，并对α和β多样性进行了对比。这可能是由于不同的废水成分，例如营养物质、微污染物和微生物。虽然微污染物会对某些分类群的丰度产生负面影响，但营养物质会有利于其他分类群的生长。总体而言，这可能导致β多样性有差异的群落，但α多样性指数相似。

图4. 水中和附着生物中原核生物和真核生物的多样性。

该分析基于0%(对照)、30%和80%未过滤废水和超滤废水中生长的附着生物的16S rRNA(原核生物)和18S rRNA基因的下一代测序。

(A)α多样性；水样(N=12)和附着生物样品(N=4)的分类丰富度Chao1和Shannon多样性指数的箱线图；小写字母a>b>c>d>e表示显著差异(Tukey检验，P<0.05)。(B)β多样性；基于Bray-Curtis距离的原核生物和真核生物群落的非度量多维标度(NMDS)分析。为每种样本类型添加95%置信椭圆。(原图5)

4.3 废水微生物影响的附着生物类群鉴定 

通过比较暴露于未过滤和超滤废水中的附着生物群落以及对照群落，我们能分析废水微生物如何以及哪些微生物可能影响附着群落的最终组成。为此，我们应用微生物差异丰度测试来确定在相对丰度方面受到废水微生物正面或负面影响的附着生物中的原核生物和真核生物分类群。

该分析得到了129个原核生物类群和20个真核生物类群(表S8)，这些类群都相互关联(图S7)，随后被分为三组。 第一组为直接正面影响组，由98个原核生物和8个真核生物类群组成，这些类群通过超滤可从废水中去除，直接定植于暴露于未过滤废水的附着生物(图5)。

所有这些类群在暴露于未过滤废水的附着生物中的丰度都高于暴露于超滤废水的附着生物和对照组。因此，组成这一类群的生物可能是我们观察到的附着生物代谢变化和耐受性增加的潜在主要参与者。

例如，仅在该组中发现的两种原核生物门(Chlorobi和Firmicutes)(图5A)常在污水处理厂的出口和下游附着生物中检测到，以及用于处理城市污水的生物滤池中检测到。

原核生物门Chloroflexi的几个分类群也被归为这一组。Chloroflex是一门丝状细菌，具有广泛的代谢多样性，也称为光异养菌。该门在未过滤废水和暴露于该废水的附着生物中含量非常丰富，而在超滤废水中几乎未检测。因此，在暴露于超滤废水的附着生物中也未检测到(图S8A)。

这表明，这些光养细菌可能直接或间接地导致附着生物中光养生物对微污染物的耐受性增加。 第二组为间接正面影响组，包含13个原核生物和8个真核生物类群，这些分类群并非源自污水处理厂，但就附着生物的相对丰度而言，受到废水微生物的正面影响(图5)。

在原核生物类群中，有两个科(Mycobacteriaceae和Rhodospirillaceae)是该类群特有的。Rhodospirillaceae在中低阶溪流中更为丰富，正如我们研究中使用的Chriesbach河流一样。

研究还表明，Mycobacteriaceae可以在受人为活动影响的环境中增殖，例如污水处理厂。间接正面影响组还包含绿弯菌门(Chloroflexi)的物种，主要是同时在直接正面影响组中发现的Caldilineaceae(图5A)。

与参与污水处理厂强化生物除磷过程的其他微生物相比，Caldilineaceae可能对附着生物呼吸起到促进作用，因为已证明Caldilineaceae在底物利用方面具有不同的代谢潜力。 

废水微生物也对附着生物中几个类群的相对丰度产生负面影响，这些类群被归为第三类，即负面影响组。该类群由18个原核类群和4个真核类群组成，其中几个类群是负面影响组特有的(图5)。

例如 ，属于Cyanobacteria、Deinococcaceae、Methylobacteriaceae和Microbacteriaceae的几个原核生物类群(图5A)。研究表明，蓝细菌门对废水有不同的反应(即丰度增加或减少)。然而，我们还不知道有哪项研究调查了废水微生物对该门的具体影响。在之前的一项比较河流中城市污染梯度沿线群落组成的研究中，Deinococcae被报道与参考(未污染)地点的附着生物生长有关，表明其对废水成分的潜在敏感性。

负面影响组中存在的Methylobacteriaceae和Microbacteriaceae可通过其与微藻的关联来解释，微藻在数量上受到废水微生物的负面影响(即图S7B中的绿藻科)。最后，负面影响组还包含一个隶属于硅藻门的真核生物分类单元(即硅藻)，这与观察到的废水微生物对硅藻丰度的负面影响一致(图S8B)。

这些结果强调，在探究废水对河流生态系统的潜在影响以进行水质评估时，需要将废水微生物群落本身视为一种压力源，这可能会影响附着生物群落的最终组成。

到目前为止，这一方面研究较少，因为大多数研究要么着眼于整体废水毒性，要么着眼于其他废水成分，如营养物质和微污染物。本研究还指出了附着生物群落中物种相互作用的重要性，以及原核生物和真核生物之间的相互作用，这些相互作用存在于附着群落中的共存物种之间。例如，对硅藻-细菌相互作用的研究表明，藻类宿主和细菌之间存在高度物种特异性的相互依赖关系，因为每个硅藻物种都形成了一个组成不同的细菌群落。

图5. 使用DESeq2对原核生物(A)和真核生物(B)类群进行微生物差异丰度检测。

显示了每组的分类群总数。原核生物在门、纲和科水平，真核生物在门和纲水平上每个组分类群的重新划分。(原图6)

结论

综上所述，本研究证明废水微生物显著影响着附着生物群落。

具体来说，我们的结果表明，这些微生物能够定植附着生物并通过物种间的相互作用直接或间接改变其群落组成，从而导致呼吸特征的变化。作为河流食物网的基础，污水处理厂下游的水生生物群落的这种变化，对于较高的营养水平具有潜在的重大环境成本，可能会对淡水食物链的整体能量流产生影响。

此外，我们的结果还表明，水生生物群落对微污染物的耐受性受到污水处理厂释放的微生物的控制，而不是受河流中微污染物的影响。

这一发现强调了污染诱导的群落耐受(PICT)这一概念，耐受性的增加是由微污染物施加的选择压力直接造成的，应该在污水处理厂的背景下重新考虑，必须考虑高污染区室(如污水处理厂本身)中出现的选择压力。总体而言，本研究结果对污水处理厂管理也有重要影响。

废水中释放的微生物群落应被视为受纳河流的潜在压力源，类似于其他压力源，如营养物质、微污染物或温度升高。这反过来意味着，目前在污水处理厂实施的减少释放微生物负荷的措施不足以完全减少它们可能带来的生态危害。

打赏