《Nature》子刊：测序成本降低12倍！新型cfDNA甲基化检测既节约成本又增强cfDNA信号

cfDNA（cell-free DNA）是液体活检中应用最广泛的分析指标，cfDNA甲基化技术因其在早期癌症检测中的实用性而备受关注。cfDNA甲基化已被证明不仅能够检测癌症，而且能够定位其起源组织 (TOO)。

尽管前景广阔，但基于 cfDNA 的癌症检测仍面临一些 重大挑战： 

1) 早期癌症患者血液中肿瘤 cfDNA 的比例可能非常低； 

2) 来自不同癌症类型的cfDNA 畸变的特征，亚型、阶段和病因是异质的； 

3) 与疾病和患者群体（年龄、性别、种族和合并症）的多样性相比，目前可用的样本量很小，特别是对于 泛癌检测 。 

传统的测序方法仅捕获所有肿瘤 cfDNA 片段的一小部分，可能导致假阴性。 

为了解决 cfDNA 在癌症检测方面面临的挑战 ，癌症早筛公司EarlyDiagnostics、加州大学洛杉矶分校研究人员领导的团队发表了一项研究， 用一种新的低成本方法cfMethyl-Seq对无细胞DNA（cfDNA）中的全基因组甲基化进行分析，可以在多种癌症背景下准确检测出早期癌症的存在和来源组织，展示了其在检测和定位癌症方面的能力 。 

原文由Mary L. Stackpole, Weihua Zeng, Shuo Li等发表在《nature communication》上，题目为 “Cost-effective methylome sequencing of cell-freeDNAforaccuratelydetectingand locatingcancer” 。

目前最常用的全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)太昂贵，难以在临床上进行广泛应用。 

所以，目前在癌症早筛领域急需一种新的方法： 

在能保证准确性的同时，还能廉价易于推广 。 cfMethyl-Seq方法 将测序空间缩小到CpG岛可以降低测序的总体成本，这些区域只占人类基因组的大约3%，研究团队发现他们的 测序成本降低了大约12倍 。 

针对cfMethyl-Seq方法对于CpG岛的富集技术，研究团队将其与 传统富集CpG区域的技术 —— 亚硫酸盐测序(RRBS)进行了比较。

与cfMethyl-Seq相比，RRBS只能从DNA的完整基因组区域，而不是从cfDNA富集CpG区域。 RRBS不适用于cfDNA，同时RRBS还缺少cfMethyl-Seq中的片段阻断步骤，导致库的制备效率较低。 

所以， cfMethyl-Seq方法可以更加节省成本 ，当然了该方法除了经济高效的cfDNA甲基化测序， 还能增加了cfDNA信号 ，执行四种 cfDNA 甲基化特征的计算方法（癌症特异性和组织特异性高甲基化和低甲基化标记），执行集成学习以检测和定位癌症，并确定了癌症的来源组织。  

图1：cfMethyl-Seq测定 

对于TOO的预测 ，研究团队通过使用结肠 (20)、肝脏 (53) 的134个实体瘤的RRBS 数据， 在10次运行中，平均获得了 30,474 个癌症特异性高甲基化和 33,890 个癌症特异性低甲基化标记用于癌症TOO预测.。 

这些标记被称为癌症 TOO 预测的癌症特异性甲基化标记 。 癌症 特异性和组织特异性高甲基化标记都富含启动子、5'-UTR、简单重复、H3K4me2、H3K4me3 和  H3K9ac，而低甲基化标记富含 Alu、LINE、SINE 重复和 H3K9me3。 

在 4 个器官部位（结肠、肝脏、肺、胃）中，所有四种单独标记类型的癌症特异性高甲基化的平均准确度为 80.0%标记物，癌症特异性低甲基化标记物为 83.6% ，组织特异性高甲基化标记物为 79.4%和 80.0%用于组织特异性低甲基化标记。 在四种标记类型中，低甲基化标记比高甲基化标记更能预测 TOO 预测。 

通过整合四种标记类型，该方法的TOO预测集成模型在所有阶段的平均准确率达到了 89.1% 。 

为了进行验证，研究团队先将 cfMethyl-Seq 应用于 408 名个体的 cfDNA 样本，其中包括 217 名患有结肠癌、肝癌、肺癌或胃癌的患者，以及 191 名未患癌症的个体 。 

研究人员还进行了跨批次验证、年龄匹配验证和独立验证，这样做的目的是防止研究中出现偏差， 结果表明：

癌症检测：

实现总体   敏感性为80.7%、特异性为 97.9%   、各个癌症类型的   敏感性范围从 75.9% 到 92.3%   ;  

定位肿瘤其起源组织 ：  

癌症全期和早期方面的肿瘤溯源准确率分别为89.1%和85.0%   。

图2：cfMethyl-Seq 应用于 408 名个体的特异性和敏感性数据 

不仅如此，研究团队还发现随着样本量的增加， cfMethyl-Seq 的检测的性能 (AUROC) 会随着使用的标记数量而增加 ：

通过每种癌症类型的200个癌症特异性高甲基化标记，可以达到 0.935 的 AUROC；

AUROC 的上升趋势在标记数达到 2000 个（AUROC = 0.961）后放缓；

当标记数接近 10,000 个（AUROC = 0.966）时 AUROC 趋于平稳。

图3：标记数量和训练样本大小对癌症检测性能的影响 

所以随着训练样本量的增加，该方法的检测能力不断提高 。 

尽管所有现有的癌症检测研究都受到训 练样本量的限制，但 cfMethyl-Seq 独特且经济高效地保留了癌症异常的全基因组表观遗传图谱，从而允许分类模型随着训练队列的增长学习和利用新的重要特征，如并将其范围扩展到其他癌症类型。 

因此，cfMethyl-Seq 可以真正促进癌症检测的大数据方法 。 

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