​小儿肾结石或肾钙质沉着症患者单基因病因的患病率

Braun DA, Lawson JA, Gee HY, Halbritter J, Shril S, Tan W, Stein D, Wassner AJ, Ferguson MA, Gucev Z, Fisher B, Spaneas L, Varner J, Sayer JA, Milosevic D, Baum M, Tasic V, Hildebrandt F. Prevalence of Monogenic Causes in Pediatric Patients with Nephrolithiasis or Nephrocalcinosis. Clin J Am Soc Nephrol. 2016 Apr 7;11(4):664-72. doi: 10.2215/CJN.07540715. Epub 2016 Jan 19. PMID: 26787776; PMCID: PMC4822665.

小儿肾结石或肾钙质沉着症患者单基因病因的患病率

背景和目标

肾结石是一种普遍的疾病，在其一生中影响10%-15%的成年人。它与绞痛引起的高发病率有关，手术干预的必要性，有时进展为CKD。近年来，已经确定了肾结石和肾钙质沉着症的多种单基因原因。然而，儿童肾结石队列中每个单基因的患病率尚未得到广泛研究。

设计、设置、参与者和测量

为了确定可以通过30个已知肾结石/肾钙质沉着症基因之一的突变进行分子解释的病例的百分比，我们在143名<18岁的国际队列中进行了高通量外显子测序分析，其中肾结石（n = 123）或孤立性肾钙质沉着症（n = 20）。在7个月的时间里，美国和欧洲三家肾结石诊所的所有合格个体都接受了研究参与。

结果

我们在30个分析基因中的14个中检测到可能的致病突变，导致16.8%（143个中的24个）受影响的个体被分子诊断;在检测到的27个突变中，有12个以前没有被描述为致病（44.4%）。我们观察到，在我们的队列中，所有有婴儿期肾结石或肾钙质沉着症表现的个体在隐性而非显性单基因中都有致病突变。在晚年表现的个体中，显性基因的致病突变更为频繁。

结论

我们介绍了第一个专门检查肾结石/肾钙质沉着症单基因原因的儿科队列，并建议对具有肾结石或肾钙质沉着症早期表现的个体进行突变分析可能产生重要的治疗和预防措施。

关键词： 遗传性肾病， 肾结石， 高钙尿症， 肾钙质沉着症， 突变， 儿童， 欧洲， 外显子， 基因， 显性， 人类

介绍

在过去的几十年中，小儿肾结石和肾钙质沉着症（NL / NC）的发病率显着增加（ 1 ）。此外，由于绞痛发作，手术干预的必要性以及有时进展为CKD，这种情况与高发病率有关。肾结石 （NL） 和肾钙质沉着症 （NC） 具有公认的遗传性。在双胞胎研究中，遗传性占所有NL / NC患病率的近一半（ 2 ， 3 ）。根据在线孟德尔人遗传（OMIM）数据库，至少30个基因的突变可以通过常染色体隐性遗传，常染色体显性或X连锁传播引起NL / NC的单基因形式。最近，我们研究了166名患有NC或NL的成人和106名儿童，并在11.4%的成人和20.8%的早发病例中检测到致病突变（ 4 ）。这一结果证实了可遗传的NL / NC的显着发生，同时也表明NL / NC还有其他未确定的单基因原因。

为了确定早发型NL / NC（18岁之前发病）中单基因原因的患病率，我们分析了30个已知NL / NC致病基因的所有编码外显子和相邻剪接位点，这些基因具有确定的OMIM表型，该队列在三个肾结石诊所招募的143名儿童中至少发生一次NL或在18岁之前肾脏超声检查时存在NC。该患者队列与先前发表的队列没有患者重叠（4 ）。

材料和方法

研究队列

这项研究得到了波士顿儿童医院机构审查委员会的批准。研究纳入标准定义为：18岁前首次出现NL临床表现和/或肾脏超声检查出现NC。患有可能导致继发性肾结石病的疾病或药物的个体被排除在外。为避免选择偏倚，所有在有限时期（2014年2月至8月）内在三家肾结石诊所（波士顿儿童医院、斯科普里大学诊所和萨格勒布大学诊所）就诊的患者均接受了研究参与。没有记录拒绝研究参与的个体的确切百分比。在获得知情同意后，从143个人中收集了临床数据，谱系信息和DNA样本。所有个体都是在哈尔布里特等人的研究结束后招募的。（ 4 ），从而排除了两项研究之间的入组重叠。该队列由72名男性和71名女性参与者组成。在这些个体中，123例患有NL，20例患有基于肾脏超声的NC，3例患有NC的人也报告了NL。

突变分析

如前所述，使用基于条形码多重PCR的方法进行突变分析（ 5 ， 6 ）。我们为381个编码外显子和30个基因的相邻剪接位点设计了518个靶标特异性引物，这些基因是NL / NC的已知单基因原因（由OMIM定义; www.ncbi.nlm.nih.gov/omim ）。筛选的基因有：抗坏血酸10、总免疫吸附剂、紫锥细胞白细胞增多症、氧化还原酶链甘油三酯、氧化还原酶链6V1B1、钙细胞白血酸酶链细胞白血酸酶链 、SLC34A3、SLC3A1、SLC4A1、SLC7A9、SLC9A3R1、变频器和 XDH（ 补充表 1 和 2 ）。扩增子大小选择在250至300 bp之间（引物序列可从作者处获得）。使用条形码多重PCR（Fluidigm 48.48-接入阵列系统）允许一次在48个个体中并行扩增所有518个扩增子（ 5 ， 6 ）。随后，使用v2化学在光明MiSeq仪器上对合并的文库进行了测序。使用CLC基因组学工作台（CLC生物，丹麦奥胡斯）将序列读数与人类参考序列对齐（ 5 ）。在进一步评估之前，我们在dbSNP（版本138）数据库中排除了同义变体和具有次要等位基因频率>1%的变体。其余变体如前所述进行了验证（ 7 ）。简而言之，以前在NL / NC患者中描述的所有变异都被认为是可能引起疾病。新变异根据其对编码蛋白质的功能有害的可能性进行排名，考虑蛋白质截断和强制性剪接位点突变可能是引起疾病的原因。对于错义等位基因，考虑了系统发育中同源物之间的进化守恒，以及生物信息学预测程序（聚苯酚-2 [ 8 ]，SIFT [ 9 ]和突变[ 10 ]）。排除了健康对照队列（外显子组聚合联盟和外显子组变体服务器）中以纯合状态存在的所有变异。其余的变异通过桑格测序在原始患者DNA中得到证实。只要有亲本DNA，就进行分离分析。变异致病性的最终调用是由遗传学家与医生科学家一起进行的，他们了解临床表型和谱系结构。

覆盖范围统计

我们的中位测序覆盖率为每位个体194×，每个扩增子197×。如前所述，中位覆盖率值>20×足以排除高通量外显子测序中的假阴性结果（ 5 ， 6 ）。在这项研究中，143个个体中只有8个（5.7%）和518个扩增子中的37个（7.1%）的中位覆盖率<20×。该值是下一代测序的平均值;因此，该实验满足了必要的质量标准。

结果

我们检查了一个由143名早发性NL或NC个体组成的国际队列，发现30个基因中存在突变，如果突变，则导致NL / NC。我们在这30个基因中的14个中检测到突变，并建立了一个分子诊断，可能解释143个NL / NC不相关个体中的24个（16.8%）（ 表 1 和 2 ).在13个个体的9个隐性基因中检测到致病性突变：ATP6V1B1（一个个体），ATP6V0A4（一个个体），CLDN16（一个个体），CLDN19（一个个体），SLC3A1（三个个体），CYP24A1（两个个体），SLC12A1（一个个体），AGXT（一个个体）和OCRL（两个个体）（ 图 1 , 表 1 ).我们还在11个个体的5个显性基因中检测到致病性突变：ADCY10（两个个体），SLC4A1（一个个体），SLC9A3R1（一个个体），SLC34A1（五个个体）和VDR（两个个体）（ 图 1 , 表 2 ).

图 1. 在143名肾结石/肾钙质沉着症（NL / NC）患者中，有24名（16.8%）建立了分子诊断。显示肾结石 （NL） 或肾钙质沉着症 （NC） 的分子诊断以及隐性和显性遗传的分布的流程图。 一个 通过肾脏超声检查。 b “已解决”表示检测到两个隐性或一个显性突变，这些突变解释了NL或NC的疾病表型。

在基因中均未检测到致病性突变，钙2，化学文摘社，CLCN5，氟木斯克，胎儿乳腺激素药物20A，人类人类红细胞增多症，HNF4A，人类高抗性肝炎1，KCNJ1，SLC2A9，SLC22A12，SLC34A3，SLC7A9和XDH。 在检测到的27个突变中，12个（44.4%）是新的致病性变异，以前没有在人类致病突变数据库中报告过。在这项研究中，没有进行额外的功能研究来验证这些等位基因的致病性。

我们观察到，在疾病首次出现时<1岁的五个个体的婴儿亚组中，所有个体（五分之五）在隐性基因（ 图 2 ），包括 ATP6V0A4、单板电池 24A1、单板电池组 24A1、单板电池组 12A1 和铁氧乙烷。该年龄组中没有个体在显性基因（ 图 2 ).在19个>1年的个体的亚组中，19个个体中有8个（42.1%）具有隐性基因的致病性突变（ 图 2 ），包括 ATP6V1B1、中国注册工业协会 16、中国注册教育网 19、SLC3A1、塞浦路斯 24A1 或 OCRL。19人中其余11人（57.9%）在显性基因中存在致病性突变，包括ADYC10，SLC4A1，SLC9A3R1，SLC34A1或VDR ( 图 2 ).这些结果表明，在我们的队列中，疾病隐性病因在婴儿发病的NL / NC中更常见，而显性病因在此之后更常见。

图 2.

肾结石/肾钙质沉着症（NL / NC）的已确诊分子遗传原因的分布。分子诊断的个体数量按发病年龄和遗传性（隐性与显性）分组。请注意，在婴儿亚组中，隐性诊断更常见，而在发病>1年的患者中，显性诊断更常见。

讨论

小儿发病的NL和NC经常被忽视的临床疾病，使临床医生和家庭感到沮丧。近年来，已经确定了NL / NC的多种单基因原因（ 11-28 ），但儿童NL / NC队列中每个单基因突变的患病率尚未得到广泛研究。

在这里，我们在143名18岁之前NL或NC发病的个体的队列中进行了突变分析。我们对已知导致单基因NL / NC的30个基因的编码区域进行了测序，并在143个个体中的24个（16.8%）中发现了致病突变。这一百分比证实了Halbritter等人的发现，他们在单独的/非重叠的成人和儿科混合队列中确定了20.8%的儿童中NL / NC的单基因原因（ 4 ）。然而，这两项研究的受试者都是在三级护理中心的专门肾结石诊所招募的，大多数NL / NC儿童都在那里就诊。因此，该队列可能对严重病例有一定的偏倚，未来的研究可能表明，孤立的NL / NC中单基因原因的百分比低于本研究中观察到的百分比。

文献中报道的NL / NC的单基因原因非常异质（ 11-28 ）。这种异质性在我们的队列中很明显，其中致病突变分布在筛选的30个基因中的14个中。这一发现表明，如本研究所述，广泛的遗传筛查对于在早发性NL / NC的单基因病例中建立分子诊断是必要的。

我们分析了我们确定致病突变的个体的年龄分布。隐性单基因疾病通常比显性单基因疾病（4）更早在生命早期出现，我们的研究结果反映了NL / NC单基因原因的这一发现。如 中所示 图 2 ，在我们的队列中，所有具有NL / NC婴儿表现的个体都含有隐性而非显性单基因的致病突变。相比之下，显性单基因的致病突变更常在疾病在以后的个体中表现出来。

在隐性病例中，与复合杂合子（13个中的3个）突变相比，我们观察到纯合子（13个中的10个）数量惊人地高。因此，我们重新审查了所有各自的案件，以明确排除父母的血缘关系。然而，这些孩子中没有一个是故意由近亲结合产生的。因此，目前我们无法为这种现象提供令人满意的解释。

高通量突变分析的一个主要挑战是区分致病性突变和良性变异。我们区分了先前在NL / NC个体中描述的等位基因，因此可能是致病的，以及新的变异。只有当新变异体被蛋白质截断，影响高度保守的氨基酸残基，在生物信息学预测程序中被预测为具有破坏性，并且在健康对照个体中不存在纯合状态时，才被认为可能是疾病引起的。

基因SLC34A1最初被报道为常染色体显性疾病基因（ 23 ）。然而，多组后来质疑SLC34A1（ 29-31 ）中单个杂合等位基因的致病性。在这一点上，SLC34A1中单个杂合子等位基因的致病性，如本研究中在五个NL / NC个体中鉴定的那样，无法明确阐明。

遗传性被认为占NL / NC病例的近50%（ 2 ， 3 ）。Halbritter等人的研究表明，已知的NL / NC基因占成人发病NL / NC的11.4%和早发性NL / NC的20.8%（ 4 ）。这些百分比表明，还有更多NL / NC相关基因有待鉴定。单基因条件，特别是隐性条件，通常不被认为是遗传起源的，因为许多表现为散发病例，因为父母将是一个突变等位基因的健康杂合子携带者。然而，大约五分之一的NL / NC患者携带单基因突变，临床医生应该注意许多遗传性疾病的指标。这些指标的例子有：早发、家族患病率、家族性血缘关系、多发性或复发性结石以及NC。关于何时怀疑NL / NC遗传病的深入讨论超出了本出版物的范围，但是，其他小组已经对此进行了非常详细的审查（ 32 ）。

分子遗传学诊断对受影响的个体和未受影响的家庭成员都有广泛的影响。如中所述 表 1 和 2 ，对无症状亲属进行基因筛查可以识别携带相同致病突变的个体。由于通常不鼓励对单基因疾病患者的健康亲属进行分子遗传筛查，因此我们最初避免在健康亲属中进行突变分析。然而，在确定受影响个体的某些致病突变后，由此产生的知识可能对目前未受影响的家庭成员具有重要的预防意义。在这些情况下，我们建议受影响的个体开始讨论遗传咨询和/或突变分析，以治疗有风险的健康亲属（ 表 1 和 2 ).最终，突变分析产生的信息将指导临床医生监测个体的疾病发展，并在可能的情况下进行预防性治疗。

此外，共识指南推荐NL / NC的标准治疗，例如增加液体摄入量，限制钠摄入量，使用噻嗪类利尿剂治疗和柠檬酸钾治疗（33），这些可能不会直接解决特定分子诊断的病理生理学。例如，尽管标准措施可能解决与CLDN16突变相关的NC，但具有明确分子诊断的临床医生也将知道监测破伤风和癫痫发作，据报道，某些CLDN16突变（ 表 1 ).因此，我们建议“实际影响”（ 表 1 和 2 ）用于我们检测到可能致病突变的每个基因。 总之，我们已经表明，异质性基因阵列中的突变可以在16.8%的早发性NL / NC个体中鉴定出来，并且我们认为在这种情况下，特定的遗传诊断具有巨大的治疗计划个性化潜力。 因此，基因筛查应在NL或NC儿科患者的临床实践中实施，因为分子诊断的知识可能会改变预防和治疗的方法。

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