Nature子刊 | 西妥昔单抗耐药又一元凶浮出水面

引言

大部分结直肠癌（CRC）的发生和发展都依赖于EGFR/KRAS/BRAF/MAPK信号通路的异常活化。

而今，Anti-EGFR（西妥昔单抗）或者Anti-VEGF(贝伐珠单抗)与化疗联用都有效提高了CRC患者的治疗效果[1]。但KRAS的初始突变会导致CRC患者发生anti-EGFR治疗原发耐药；治疗过程中EGFR阻断的选择性压力也会使KRAS，EGFR，NARS，BRAF，MEK1等突变累积，造成获得性耐药，使治疗无效[2]。  

  已知anti-EGFR耐药性的机制有两种，一种是信号上游EGFR胞外段的突变而导致的直接耐药，另一种是下游信号的重新活化。后者的活化主要是KRAS，NRAS, BRAF的激活突变所介导的，我们将这些突变统称为eRAS/BRAF突变。但是我们对于下游MAPK信号所造成的耐药机制知之甚少。 ARID1A是SWI/SNF染色质重塑复合物的亚基，它作为一种表观遗传调控因子，在约5%的非高突变CRC患者中发生突变[3]。研究表明，ARID1A突变与肿瘤的进展转移，耐药性的发生，致癌信号通路（PI3K和MAPK）的活化有关。ARID1A的截断性突变可以降低SWI/SNF复合物的稳定性促进癌细胞生长[4]。 近日，来自基因泰克的团队发现ARID1A突变可引起转移性结直肠癌患者的西妥昔单抗耐药现象，并且发现其耐药机制可能与重新激活EGFR下游信号有关，为西妥昔单抗治疗决策提供了一个预测性生物标志物。该工作也发表在 Nature communications [5]。

在此之前，我们已知西妥昔单抗耐药的机制包括： ●  信号上游EGFR胞外段突变直接导致耐药性发生； ●  下游信号重新活化，这些活化主要通过KRAS，NRAS和BRAF的激活性突变介导我们将这些突变统称为(eRAS)/BRAF突变。 ● 维持ERK（MAPK）信号活化。通过MAP2K1和NF1突变以及KRAS，MET和ERBB2信号增强，但对激活MAPK造成耐药的机制知之甚少。 

本文在此基础上做了以下几项工作： ● 发掘出西妥昔单抗治疗选择性突变ARID1A突变并验证其与西妥昔单抗耐药的必然关系； ● 利用生物信息学技术发现ARID1A突变导致西妥昔单抗耐药的可能机制：通过诱导EGFR信号活化并与EGFR/MAPK信号功能冗余的方式导致耐药性产生。 以下附上正文详解： ARID1A突变导致 CRC患者西妥昔单抗耐药 

首先，为探索导致耐药性的治疗特异性突变，研究人员将354例转移性结直肠癌病人分为两组。一组为西妥昔单抗（anti-EGFR）联合化疗，另一组为贝伐珠单抗（anti-VGFR）联合化疗。研究人员分别收集患者治疗前，治疗中以及治疗后患者的循环游离DNA（cfDNA）进行测序，计算患者治疗前后相对等位基因突变频率（MAF）的变化，将治疗前后相对MAF增加25%的突变归为治疗选择性突变。 研究者最终在两组治疗中筛选出18个治疗后突变基因，其中KRAS和ARID1A的治疗相关突变在西妥昔单抗治疗组显著富集。（图2a）KRAS的获得性突变往往会与其原发性突变一起发生，在KRAS野生型（WT）中很少见，其导致西妥昔单抗耐药的现象也已有报道，研究者便将目光集中在鲜有研究的ARID1A突变上。研究表明，在西妥昔单抗治疗组中，7名发生ARID1A选择性突变的患者中有6名的ΔMAF大于50%，而发生KRAS选择性突变患者的ΔMAF大都集中在25%到50%。（图2b）研究者认为，ARID1A双等位基因的缺失可能会导致西妥昔单抗耐药。

图2：ARID1A突变为西妥昔单抗选择性突变 

接着研究人员对6名在西妥昔单抗治疗中产生获得性ARID1A突变的病例进行分析，发现有两名患者（SAARS和SAANSJ）的突变在治疗前就已发生，而3名患者（SAASGM，SAAAUP, SABSCZ）的突变在治疗前没有发生，剩下的一名患者（SAAANDA）有两种选择性突变。（图3）  

图3：两例患者的突变演化图谱 

之前的研究表明，CRC患者的固有ARID1A突变普遍与微卫星高度不稳定（MSI-H）和右侧肿瘤有关。而在西妥昔治疗组中，6名获得选择性ARID1A突变的病人中有4名诊断为左侧肿瘤合并微卫星稳定（MSS）。（图4）这表明获得性ARIDIA突变所导致的西妥昔单抗耐药与MSS/MSI-H和肿瘤偏侧性无关。

图4：具有治疗选择性ARID1A和KRAS突变的病患临床信息 

为了厘清ARID1A突变与西妥昔单抗耐药性的相关性，研究人员根据初始ARID1A突变状态和治疗方案将试验人群分为四组，他们发现，拥有初始ADID1A突变的结直肠癌病人接受西妥昔单抗治疗会显著缩短整体生存率（OS）。（图5）这无疑证明了之前的猜想。

图5：生存分析曲线 

至此，研究人员推断ARID1A突变可能会导致利用西妥昔单抗进行一线治疗的转移性结直肠癌病人产生耐药性。 鉴定ARIDIA突变样标志 

为了进一步探索ARID1A功能与西妥昔耐药性之间的关系，研究人员利用富集分析算法和TCGA数据库鉴定出了一种可以描述ARID1A突变或者功能缺陷时转录组图谱的ARID1A突变样标志。通过分析发现在ARID1A突变肿瘤中有8种显著上调和56种显著下调的基因。 每一个病例样本都会凭借这64种基因的表达情况，按照既定的算法得出ARID1A突变样标志评分。研究人员按照患者评分由小到大的顺序排列，得出了578位病例的64种基因表达谱，并将病患分成了Q1到Q4四个组份（Q4，突变样组；Q1-Q3，WT样组）（图6）。  

图6：CALGB/SWOG 80405中578例患者ARID1A突变样标志火山图 

无论在TCGA群体还是CALGB/SWOG 80405中，相比于ARID1A wt组，ARID1A 突变组的ARID1A突变样标志评分都有显著性提高,并且ARID1A突变更加富集于Q4人群中。（图7） 

图7：验证ARID1A突变与ARID1A突变样标志的一致性 ARID1A突变可能是通过部分诱导EGFR活化程序导致西妥昔单抗相对于贝伐单抗的预后较差 

ARID1A突变到底是通过何种方式导致西妥昔单抗耐药性的产生？ 针对这一问题，研究人员发现相比于SWI/SNF WT肿瘤，SWI/SNF突变肿瘤的ARIDA突变样标志评分显著性提高。这表明ARID1A突变样标志不仅在ARID1A突变中富集，也在影响SWI/SNF复合物完整性和功能的其他突变中富集。进一步分析ARID1A缺陷对于转录过程的影响，研究者发现EGFR信号通路高度活化标志和SWI/SNF活性损失标志都在拥有高ARID1A突变样标志评分的群体（Q4）中富集,（图8）表明ARID1A突变样标志不仅可以捕捉到与SWI/SNF功能损失相一致的转录基因表达变化，还能捕捉到活跃的EGFR信号和下游细胞增殖。研究人员认为， ARID1A 突变造成的西妥昔单抗耐药性可能与其诱导EGFR活化有关。  

图8：ARID1A突变样患者的致癌标志得分（GSVA scores）显著提高 ARID1A突变样标志 在西妥昔单抗耐药患者中富集 基于之前鉴定出的ARID1A突变样标志，研究人员设计了与图3a类似的试验，在162例eRAS/BRAF WT患者中，25例接受西妥昔单抗治疗的ARID1A突变样患者的OS显著缩短，与图5的结果相一致。（图9）  

图9：生存分析曲线 

在西妥昔单抗治疗组中，ARID1A突变样组的整体应答率（ORR）显著低于ARID1A野生样组（44% vs. 89%）,而在贝伐单抗治疗组却观察不到类似的实验结果。（图10）

图10：ARID1A突变样组/野生型样组对西妥昔单抗和贝伐单抗的应答情况 这一实验结论也在eRAS/BRAF PDX肿瘤模型中得以印证。(图11)  

图11：ARID1A突变样组/野生型组对244例西妥昔单抗治疗后PDX的应答情况 ARID1A突变可能 与EGFR/MAPK信号通路存在功能冗余 

最后研究者对于ARID1A突变与其他致癌突变的关系做了进一步研究，他们基于FoundationCore数据库中16931个结直肠癌和29757个肺癌样本，利用Select算法筛选出了与ARID1A突变显著性相互排斥和共存的23个基因突变。（图12a）不难看出，其中EGFR短突变体（EGFR SVs）与ARID1A突变的相互排斥程度最高（图12b）。

图12：CRC和肺癌患者中与ARID1A SV相互排斥或共存的基因 ( ME代表相互排斥，CO代表共存) 并且在5980例肺癌患者中，两种突变共存的发生比例仅有1.7%。（图13）

图13：5980个病例中ARID1A SV和EGFR SV共存情况

不仅如此，研究者还在肺癌患者中发现ARID1A突变与EGFR增强显著的相互排斥，在CRC患者中也有相互排斥的趋势。大部分EGFR SVs都可以导致EGFR信号的异常活化而促进肿瘤增殖。结合之前发现的ARID1A突变可导致EFGR信号通路高度活化，研究人员推断，ARID1A突变可能通过部分诱导EGFR转录程序来补偿突变的EGFR信号。

总结与展望

从研究思路来说，研究者们基于大量的病例样本，利用生物信息学技术，筛选出了18种anti-EGFR和anti-VEGF治疗的选择性突变，并且在其中筛选出了在西妥昔单抗治疗组倾向性富集的突变基因ARDIA。 而为了广泛地获取ARDIA突变下游的信号通路，研究人员还利用富集分析和TCGA数据库，开创性地鉴定了一种ARIDIA突变样标志，巧妙地将研究对象从ARID1A突变肿瘤拓展到所有具有ARID1A突变样表型的肿瘤。 在进行ARID1A突变耐药机制探索之时，研究者们还利用之前鉴定的ARIDIA突变样标志评分，发现了ARIDA/SWI/SNF复合物负性调节EGFR下游效应器的转录。不仅如此，还发现ARID1A突变与EGFR突变的高度排斥性，说明ARID1A突变可能与EGFR/MAPK信号通路存在功能冗余，提出了一种潜在的西妥昔单抗耐药机制。 总之，研究者们为西妥昔单抗治疗选择提供了一个预测性生物标志物，也对探索利用MAPK抑制剂治疗ARID1A突变CRC患者提供了逻辑基础。虽然对于机制的研究还不够深入，但也为西妥昔单抗耐药性机制的探索提供了新思路。在此基础上，科研人员可以着力于发掘ARID1A突变与下游MAPK信号活化的功能联系，为治疗策略的选择和开发增加依据。

参考文献

1. 1.     Saltz LB, Clarke S, Díaz-Rubio E,etc.. Bevacizumab in combination with oxaliplatin-based chemotherapy as first-line therapy in metastatic colorectal cancer: a randomized phase III study. J Clin Oncol. 2008 Apr 20;26(12):2013-9. doi: 10.1200/JCO.2007.14.9930. Erratum in: J Clin Oncol. 2008 Jun;26(18):3110. Erratum in: J Clin Oncol. 2009 Feb 1;27(4):653. PMID: 18421054.

2. 2.     Strickler JH, Loree JM, Ahronian LG,etc.. Genomic Landscape of Cell-Free DNA in Patients with Colorectal Cancer. Cancer Discov. 2018 Feb;8(2):164-173. doi: 10.1158/2159-8290.CD-17-1009. Epub 2017 Dec 1. PMID: 29196463; PMCID: PMC5809260.

3. 3.     Wong OGW, Li J, Cheung ANY. Targeting DNA Damage Response Pathway in Ovarian Clear Cell Carcinoma. Front Oncol. 2021 Oct 19;11:666815. doi: 10.3389/fonc.2021.666815. PMID: 34737943; PMCID: PMC8560708.

4. 4.     Zehir A, Benayed R, Shah RH,etc.. Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med. 2017 Jun;23(6):703-713. doi: 10.1038/nm.4333. Epub 2017 May 8. Erratum in: Nat Med. 2017 Aug 4;23 (8):1004. PMID: 28481359; PMCID: PMC5461196.

5. 5.     Johnson RM, Qu X, Lin CF,etc.. ARID1A mutations confer intrinsic and acquired resistance to cetuximab treatment in colorectal cancer. Nat Commun. 2022 Sep 19;13(1):5478. doi: 10.1038/s41467-022-33172-5. PMID: 36117191; PMCID: PMC9482920.