快报｜BCL2基因多态性对结核病易感性的影响

作者：何娟，刘盛元，郭旭君，张帆，Howard Eugene Takiff ，赵亚双

第一作者及单位：何娟，哈尔滨医科大学公共卫生学院流行病学教研室/深圳市南山区慢性病防治院结核病防治科

通信作者及单位：赵亚双，哈尔滨医科大学公共卫生学院流行病学教研室

Polymorphisms of the BCL2 gene associated with susceptibility to tuberculosis

He J，Liu S，Guo X，Zhang F，Takiff HE， Zhao Y.

Rev Inst Med Trop Sao Paulo，2022，64：e59.

doi: 10.1590/S1678-9946202264059. 

PMID: 36197420 

研究背景

结核病（Tuberculosis, TB）是一个严重的公共卫生问题，世界上约有四分之一的人感染了结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB），处于结核分枝杆菌潜伏感染状态（latent tuberculosis infection, LTBI），但只有5%～10%的感染者会发展成结核病。宿主感染结核分枝杆菌并引发结核病的机制目前仍不十分明确。除了环境因素，遗传因素也被认为发挥着重要作用。结核分枝杆菌是一种强传染性的胞内病原菌，在与宿主长期的协同进化中采取了一系列特殊的免疫逃逸和调控策略来达到对宿主的自适应。细胞凋亡被认为可阻止细胞内MTB的释放和感染的扩散，其过程受到多个基因的调控。在凋亡相关基因BCL2表达和结核分枝杆菌生存状态的动物实验和人群研究中，BCL2被认为是决定结核病易感性的关键因素。因此，本文对BCL2基因多态性与TB/LTBI风险的关联进行病例对照研究，探讨BCL2基因及其对应的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）位点变异对结核病发生、发展的影响。

研究方法

1. 研究对象的选择：共纳入130例菌阳肺结核患者（痰涂片或培养阳性）和279例菌阳肺结核患者的密切接触者。密切接触者纳入研究时均没有咳嗽、咳痰≥2周等肺结核疑似症状。279名接触者中有8名因样本基因分型的质量不合格被剔除，剩下271例纳入最终分析。所有参与者均由深圳市南山区慢性病防治院于2017年5月至2018年7月期间招募，并在婴儿期接种过卡介苗。依据世界卫生组织发布的指南，按照结核感染T细胞γ干扰素释放试验（Mycobacterium tuberculosis IFN-gamma release assay, TB-IGRA）的结果将接触者分为LTBI和未感染的健康对照组（health controls, HC）。LTBI的TB-IGRA结果为阳性，而HC为阴性。排除HIV感染、糖尿病、肿瘤患者，以及长期使用激素、器官移植等免疫功能低下者。 

2. 基因组DNA的提取：使用5 ml规格的EDTA-K2抗凝管采集研究对象2～5 ml静脉血，放置于-20℃低温冰箱保存。采用Qiagen血液基因组提取试剂盒进行抗凝血基因组DNA的提取。提取的DNA被稀释到50 ng/μl，用于进一步的基因分型。

3. SNP的筛选和基因分型：利用1000人基因组项目（1000 Genomes Project）数据和Haploview（4.2版）软件，按照次等位基因频率（minor allele frequency，MAF）≥ 0.05，r2 > 0.8的标准来筛选BCL2的标签SNPs，通过HaploReg v4.1对标签SNPs进行注释，尽量选择功能区SNPs，结合文献阅读找出研究热点的SNPs。用Illumina HumanOmniZhongHua-8 BeadChip进行基因分型。对5%的样本进行重复分析，以评估基因分型的可重复性和质量。为了排除可能的基因分型错误，我们将选定的SNPs生成基因型聚类图，并在GenomeStudio（2.0版）软件中进行检查。

研究结果

1. 研究对象基本特征: 在参加研究的409名受试者中，401名（98.04%）成功进行了基因分型，包括130名TB、108名LTBI和163名HC。三组的特征见表1。性别分布无明显差异，但结核病患者的年龄比LTBI和HC组小（P<0.05）。

表1 研究对象的人口学和临床特征

2. BCL2 SNPs与TB / LTBI易感性的遗传关联： 基因分型的可重复性为100%。10个BCL2 SNPs的基因型在163名HC中的分布完全符合Hardy Weinberg平衡（P>0.05）。我们发现5个SNPs与TB或LTBI显著相关（rs80030866、rs3744933、rs9955190、rs1801018和rs2551402，均为P<0.05）（表2）。然而，这些关联没有达到Bonferroni校正在统计学意义上的要求（10个SNPs独立比较，要求P<0.005 ）。对于rs80030866（A>G），与LTBI组相比，G等位基因在TB组的频率较低（OR=0.62，95%CI：0.42～0.91，P=0.015）（表2）。对于rs3744933（C>A），与HC组相比，TB组A等位基因的频率较高（OR=1.81，95%CI：1.05～3.12，P=0.031），而且AC基因型比CC基因型更常见（OR=2.014，95%CI：1.105～3.672，P=0.022）（表2）。与HC组相比，显性（OR=1.986，95%CI：1.099～3.587，P=0.023）或加性（OR=0.498，95%CI：0.273～0.907，P=0.023）遗传模型下，rs3744933 A等位基因与TB的关联仍然显著（表3）。对于rs9955190（A>G），与LTBI组相比，TB组的G等位基因频率较低（OR=0.58，95%CI: 0.38～0.88， P=0.011），而且TB组的GG基因型明显少于AA基因型（OR=0.165，95%CI：0.033～0.821，P=0.028）（表2）。对于rs1801018（A>G），与HC组相比，LTBI组的G等位基因频率更高（OR=1.97，95%CI：1.09～3.57，P=0.022）（表2）。对于rs2551402（A>C），与HC组相比，CC基因型在LTBI组中比AA基因型更常见（OR=2.166，95%CI：1.046～4.484，P=0.037）（表2），并且在隐性模型中显著（OR=1.960，95%CI：1.018～3.772，P=0.044）（表3）。

表2  TB、LTBI、HC三组遗传关联分析的阳性结果

注   —：等位基因或基因型频率＜0.03者在分析中已忽略；*：调整年龄和性别

表3 BCL2基因型与LTBI/TB之间基于遗传模型关联分析的阳性结果

注   —：等位基因或基因型频率＜0.03者在分析中已忽略；*：调整年龄和性别

3. 功效估计：分别用比值比（odds ratios, OR）等于2.0、3.0和4.0来估算研究功效，以确定研究的样本量是否足以发现关联。结果表明，在分析的SNP中，有8个SNP的功率接近80%，可以发现OR≥2的关联（表4）。然而，对于rs3744933和rs1801018位点，统计能力不足，需要更大的样本量来探索与结核病的可能关联。

表4 等位基因模型中不同OR值的研究功效

4. BCL2基因rs80030866和rs9955190的亚组分析：根据年龄、性别、痰涂片状态、肺部空洞的有无和治疗时长，对rs80030866和rs9955190进行了亚组分析。我们发现，对男性而言，TB和LTBI之间rs80030866（OR=0.545，95%CI：0.318～0.933，P=0.026）和rs9955190（OR=0.530，95%CI：0.299～0.942，P=0.029）的等位基因频率存在显著差异（表5）。此外，与治疗不超过6个月的患者相比，治疗6个月以上的患者rs80030866*GA+GG基因型较rs80030866*AA基因型不常见（OR=0.461，95%CI：0.221～0.959，P=0.037）。见表5。

表5 BCL2基因rs80030866和rs9955190亚组分析的关联统计

5. BCL2单倍型与TB/LTBI易感性之间的关系：用Haploview（4.2版）构建了两种BCL2单倍型，在rs80030866和rs9955190之间（D'=0.88，r2=0.51）以及rs12458289和rs2551402之间（D'=1.00，r2=0.56）观察到相对强烈的连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD）（图1）。rs80030866-rs9955190 AA单倍型在TB组比LTBI组更常见（P=0.018193），而GG单倍型在TB组比LTBI组（P=0.003391）或HC组（P=0.034859）都更少见（表6）。没有观察到rs12458289-rs2551402单倍型与结核病的显著关联。

表6 BCL2基因四个SNPs的单倍型分析

注  受试者中频率<0.05的单倍型没有进行评估

研究结论

BCL2基因多态性可能与中国汉族人群中LTBI和TB的易感性相关，其中rs80030866、rs9955190的G等位基因在LTBI中比在TB更常见，LTBI中rs2551402的CC基因型相比AA基因型更常见。在更大的队列研究中，这些关联可能会达到显著性。BCL2 SNPs或许可以作为区分潜伏和活动性结核感染的生物标志物。

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编辑：王   然   

审校：郭   萌

发布日期：2022-10-21

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