慢病毒载体概况lentiviral vectors fact

慢病毒和慢病毒载体

科：逆转录病毒科

属：慢病毒属

包膜大小：直径约80-120nm

基因组：锥形衣壳内的两个正义单链RNA（ssRNA）拷贝

风险级别：2

慢病毒特征

慢病毒（Lentivirus）（lente-，拉丁语为“慢”）是一组潜伏期较长的逆转录病毒。根据它们感染的脊椎动物宿主，它们被分为5个血清组：牛、马、猫、绵羊/山羊和灵长类。慢病毒的一些例子是人类(HIV)、猿猴(SIV)和猫科动物(FIV)免疫缺陷病毒。

慢病毒可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，并且可以整合到分裂和非分裂细胞中。病毒基因组在分裂过程中传递给子细胞，使其成为最有效的基因传递载体之一。

大多数慢病毒载体基于人类免疫缺陷病毒(HIV)，在本介绍中将使用它作为慢病毒载体的模型。

HIV病毒的结构

HIV的结构不同于其他逆转录病毒。HIV大致呈球形，直径约120nm。HIV由两个阳性ssRNA拷贝组成，这些拷贝编码9个基因，由一个包含2000个拷贝的p24蛋白的锥形衣壳包裹。ssRNA与核衣壳蛋白、p7和病毒粒子发育所需的酶紧密结合：逆转录酶(RT)、蛋白酶(PR)、核糖核酸酶和整合酶(IN)。由p17组成的基质围绕衣壳，确保病毒粒子的完整性。反过来，当新形成的病毒颗粒从细胞中发芽时，它又被一个由两层磷脂组成的包膜所包围，这些磷脂是从人类细胞膜上取出的。嵌入病毒包膜中的是来自宿主细胞的蛋白质和大约70个拷贝的复杂HIV蛋白（称为Env），它突出在病毒颗粒的表面。Env包括一个由3个gp120分子组成的帽和一个由3个gp41分子组成的茎，该茎将结构锚定到病毒包膜上。糖蛋白复合体使病毒能够附着在目标细胞上并与其融合，从而启动感染循环。

HIV-1病毒的基因组结构

HIV-1基因组包含9749bp。除了所有逆转录病毒共有的gap、pol和env基因外，HIV-1还包含：

病毒复制所必需的2个调节基因—tat和rev—，以及

4个辅助基因—vif、vpr、vpu和nef—，虽然对病毒的体外生长是不必要的，但却是体内复制和致病的关键。

HIV病毒的生命周期

HIV的生命周期始于病毒进入，这是HIV包膜与宿主靶细胞表面受体之间的多步相互作用。在进入的初始步骤中，HIV gp120蛋白与宿主靶细胞CD4受体结合，从而将HIV锚定在宿主细胞上。这种相互作用在HIV包膜中产生构象变化，刺激HIV与宿主细胞共受体结合；HIV使用的主要共同受体是CCR5和CXCR4。随后，病毒和宿主膜融合，病毒衣壳进入细胞，HIV核心溶解释放出两个拷贝的单链HIV RNA。下一步，逆转录，涉及到HIV逆转录酶(RT)将HIV ssRNA转化为双链DNA(dsDNA)。RT使用细胞核苷酸作为合成HIV DNA的构建原料。接下来，与其他HIV蛋白复合的HIV DNA在宿主细胞核内迁移。然后HIV整合酶(IN)催化HIV DNA整合到宿主DNA中。一旦HIV DNA整合到宿主基因组中，它就被称为前病毒DNA。HIV前病毒仍然是宿主DNA的一部分，并被细胞视为正常宿主细胞DNA。细胞酶将前病毒DNA转录成信使RNA(mRNA)和基因组RNA。前病毒DNA转录的控制涉及多种因素，包括HIV Tat蛋白和细胞调节剂。然后病毒mRNA从细胞核中输出到宿主细胞的细胞质中，在那里细胞酶将病毒mRNA翻译为病毒蛋白。较大的病毒蛋白需要切割成较小的功能蛋白，这一步骤由HIV蛋白酶(PR)执行。然后，HIV的多个组成部分被组装在一起，当HIV从细胞中萌芽时，会进行进一步加工以完成病毒的生命周期，最终产品由能够感染其他细胞的成熟HIV病毒粒子组成。

HIV的传播途径

HIV主要通过黏膜和非完整皮肤与病毒的直接接触传播。经皮暴露（如针刺、锐器伤）是临床和研究环境中的重要暴露途径。

HIV感染的阶段

急性感染的症状通常是非特异性的。有些人在感染后大约2到4周出现流感样症状，而其他人则没有症状。在此期间，HIV会迅速复制，破坏大量CD4+细胞，直到达到病毒设定点，即体内HIV病毒的相对稳定水平。

在临床潜伏期，病毒继续以非常低的水平繁殖，这也是这个阶段也被称为“无症状或慢性HIV感染”的原因。

在最后阶段，个体从慢性HIV感染发展为全面发展的AIDS（获得性免疫缺陷综合症）。AIDS患者由于免疫系统严重受损，易患多种机会性感染和与HIV相关的癌症。CD4+细胞计数低于200个/mm3，或出现一种或多种机会性感染，表明HIV+个体患有AIDS。

HIV的细胞趋向性和假型

HIV可以感染多种人类免疫细胞，如CD4+T细胞、巨噬细胞和小胶质细胞。病毒进入靶细胞是通过HIV的gp120与宿主细胞表面存在的CD4分子和趋化因子辅助受体（CCR5或CXCR4）之间的相互作用而实现的。下图显示了人体细胞（棕色）上的HIV颗粒（粉红色）。由于CD4是与天然HIV包膜糖蛋白结合的主要受体，慢病毒载体的趋向性受到很大限制。为了感染没有CD4表达的细胞，已经使用了其他异源包膜蛋白的假型。

水泡性口炎病毒糖蛋白G（VSV-G）允许将基因转移到广泛的细胞类型和物种中，常用于慢病毒载体的假型。尽管有利于研究目的，但在实验室工作人员接触VSV-G假型慢病毒载体时，这会增加感染风险，因为这些载体将能够靶向更大范围的细胞。

对于鼠细胞的转染，慢病毒载体可以用鼠亲嗜性包膜进行假型化，这将消除人类的暴露风险。

慢病毒载体的构建

慢病毒具有很高的突变和重组率，因此HIV在载体制造过程中通过重组产生自我复制的可能性是一个严重的安全问题。为了降低这种可能性：

必需基因被分离到不同的质粒中，并且4个病毒辅助基因（vif、vpr、vpu和nef）被删除。这样，就需要多个重组事件来重建具有复制能力的慢病毒（RCL）。生成慢病毒载体需要几个组件，包括：慢病毒骨架，又名转移载体质粒或慢病毒构建体：具有LTRs和包装信号Psi(Ψ)目的转基因：例如，克隆到主链中的cDNA、miRNA或shRNA辅助质粒：包装和包膜质粒，以及包装细胞系：病毒载体生产发生的“工厂”。带有转基因和辅助质粒的转移载体被瞬时转染到包装细胞系中，如HEK-293细胞，在那里它们被组装起来。

下表分别说明了这些组件：

慢病毒载体的世代

使用慢病毒载体进行基因转移也不能免除风险，因为病毒基因组材料可以整合到宿主DNA中。这可以通过导致这些基因的抑制或过度表达和插入突变来干扰宿主细胞基因的功能。随着技术的进步和生物安全风险的发现，设计了具有增强安全功能的新一代慢病毒载体。这些代在接下来分别描述，理解为“代越高，载体越安全”。在所有三代中，包膜基因通常是异源的，即来自不同的病毒，例如VSV-G（不是HIV基因）。

第一代：包括一个包装系统，除了包含在另一个载体中的env基因（通常是异源的）之外，所有的HIV基因都包含在包装系统中。

第二代：研究人员发现，在永生化细胞系中，HIV复制不需要4种HIV辅助基因—vif、vpr、vpu和nef—。这导致了第二代载体的工程化。在该系统中，去除了4个辅助基因，留下了gag和pol阅读框以及tat和rev基因。一般来说，具有野生型5'LTR的慢病毒载体需要第二代包装系统，因为它们需要tat激活。

第三代/自灭活(SIN)：在第三代载体中，3'LTR被修改，tat被剔除，rev在单独的质粒中提供。由于5'LTR中的HIV启动子依赖于tat，因此没有tat的载体需要将其野生型启动子替换为异源增强子/启动子以确保转录。这种启动子可以是病毒（如CMV）或细胞（如EF1-α）。

慢病毒载体世代汇总表

*形成RCL的风险不仅存在于慢病毒载体生产过程中，而且存在于涉及感染野生型HIV的材料的实验中。慢病毒载体与HIV之间的重组可导致产生安全性未知结果的新病毒。出于这个原因，涉及未经HIV筛查的人体材料的实验对实验室工作人员构成了更大的风险。

慢病毒载体的优缺点

慢病毒载体在实验室中的应用

环境稳定性和消毒

由于存在脂质包膜，慢病毒载体对干燥条件非常敏感。因此，理论上，慢病毒载体可以用酒精类消毒剂灭活，如70%的异丙醇或乙醇溶液。在实践中，酒精不适合对大量病毒载体进行消毒（例如溢出），因为酒精蒸发难以达到足够的接触时间。此外，酒精消毒剂对可能与慢病毒载体一起存在的有机物质（例如细胞、牛血清）的效力有限。

使用慢病毒载体时，2% Jodopax、次氯酸钠、碘和酚类消毒剂是首选的消毒方法。

遏制级别

尽管大多数慢病毒载体的母体病毒属于风险组3（例如HIV），但BSL-2或BSL-2+实践通常用于此类工作。BSL级别的最终确定将基于风险评估。

用慢病毒载体治疗的啮齿动物必须安置在ABSL2条件下，笼子上标有一张黄花卡片，说明慢病毒给药的日期、时间和剂量。动物护理人员不会在72小时内更换接受治疗的动物的笼子。之后，所有废物都应按照适当的程序作为生物危害物收集。

实验室中慢病毒载体的暴露途径

使用慢病毒载体时，肠胃外的暴露会造成实验室感染的最高风险。这通常是通过针刺、锐器割伤、不完整的皮肤污染、划痕等方式发生的。在进行接种时未能正确控制啮齿动物很可能导致工人自我接种。

在载体制备过程的某些步骤中接触病毒载体制剂的粘膜也会导致工人感染。充分使用生物安全柜和PPE可以防止这种风险。

暴露后预防

慢病毒载体可以在意外暴露的情况下感染实验室工作人员的细胞。尽管该载体可能无法复制，但它仍然能够一次性感染工人的细胞并将其遗传内容传递给这些细胞。将病毒遗传物质插入宿主细胞的基因会导致突变（插入突变），即使转基因显然是无害的（例如，GFP等细胞标记物）。此外，转基因致癌基因的过度表达或细胞肿瘤抑制基因的抑制也可导致肿瘤的发生发展。

所有处理慢病毒载体的首席研究员(PI)都必须拥有经批准的IBC方案，包括慢病毒工作的SOP以及在暴露时如何应对。所有实验室工作人员都必须接受有关慢病毒安全工作和应急响应的适当培训。当前管理职业暴露于基于HIV的病毒载体的指南依赖于使用针对预整合步骤的抗病毒药物，以防止插入突变。应在暴露后的前4小时内尽快进行暴露后预防(PEP)。其他抑制逆转录酶(RT)或HIV整合酶(IN)的抗病毒药物可用作PEP。