是伴有结晶尿的高尿酸血症，而不是无症状的高尿酸血症，驱动慢性肾脏病的进展

Sellmayr M, Hernandez Petzsche MR, Ma Q, Krüger N, Liapis H, Brink A, Lenz B, Angelotti ML, Gnemmi V, Kuppe C, Kim H, Bindels EMJ, Tajti F, Saez-Rodriguez J, Lech M, Kramann R, Romagnani P, Anders HJ, Steiger S. Only Hyperuricemia with Crystalluria, but not Asymptomatic Hyperuricemia, Drives Progression of Chronic Kidney Disease. J Am Soc Nephrol. 2020 Dec;31(12):2773-2792. doi: 10.1681/ASN.2020040523. Epub 2020 Sep 16. PMID: 32938648; PMCID: PMC7790211.

只有伴有结晶尿的高尿酸血症，而不是无症状的高尿酸血症，驱动慢性肾脏病的进展

由于缺乏具有临床相关尿酸 （UA） 水平的动物模型，无症状性高尿酸血症在 CKD 进展中的作用尚不清楚。一种新的小鼠模型显示，持续性无症状性高尿酸血症（约15mg / dl）不会引起CKD，也不会加速进展，除非UA在酸性肾小管液中结晶。结晶最初引起肾小管损伤、炎症和间质纤维化，随后肉芽肿性间质性肾炎伴周围促炎性 M1 样巨噬细胞浸润。调节M1样巨噬细胞表型，但不调节JAK / STAT抑制，可减轻肉芽肿性肾炎。

背景

无症状性高尿酸血症或尿酸 （UA） 晶体在 CKD 进展中的作用尚不清楚。解释 UA 沉积与 CKD 进展之间联系的假设包括 ：（1） 无症状性高尿酸血症不会促进 CKD 进展，除非 UA 在肾脏中结晶;（2）UA晶体肉芽肿可能由于预先存在的CKD而形成;（3）促炎肉芽肿相关的M1样巨噬细胞可能驱动UA晶体诱导的CKD进展。

方法

MALDI-FTICR质谱、免疫组化、3D共聚焦显微镜和流式细胞术用于表征高尿酸血症和慢性UA晶体肾病伴肉芽肿性肾炎的新型小鼠模型。介入性研究探讨了晶体诱导的炎症和巨噬细胞在进行性CKD病理学中的作用。

结果

单独无症状的高尿酸血症不会引起 CKD 或驱动马兜铃酸 I 诱导的 CKD 的进展。只有尿酸化引起的高尿酸血症伴 UA 结晶尿症才引起肾小管梗阻、炎症和间质纤维化。UA晶体肉芽肿被促炎性M1样巨噬细胞包围，在慢性UA晶体肾病的这一过程后期发展，并导致预先存在的CKD的进展。用腺苷抑制M1样巨噬细胞减弱肉芽肿性肾炎和GFR进行性下降。相反，用托伐菌素抑制JAK / STAT炎症途径不是肾保护性的。

结论

无症状性高尿酸血症不影响 CKD 进展，除非 UA 在肾脏中结晶。UA 晶体肉芽肿在慢性 UA 晶体肾病晚期发展，并导致 CKD 进展，因为 UA 晶体会引发 M1 样巨噬细胞相关的间质炎症和纤维化。靶向促炎巨噬细胞，但不靶向 JAK/STAT 信号传导，可减弱肉芽肿性间质性肾炎。

CKD是一个全球公共卫生问题，发病率和死亡率很高。1由于尿酸 （UA） 清除率随着 CKD 的进展而下降，因此 CKD 通常伴有严重的高尿酸血症 （HU）。2–5HU还与许多合并症有关，例如代谢综合征、高血压和心血管疾病，但因果关系仍不确定。6,7特别是，无症状 HU 是否有助于 CKD 的进展仍然是一个有争议的话题。8,9到目前为止，HU仅在涉及以晶体形式存在的UA的疾病（例如痛风性关节炎，急性尿酸盐肾病和尿石症）中具有已证实的致病作用。10–13在肾脏中，低尿pH值促进UA晶体的沉淀，这发生在某些饮食或遗传综合征中，但通常不会发生CKD。14,15在诊断性肾活检样本或尸检中，偶尔可在 CKD 肾脏中观察到被肉芽肿样巨噬细胞浸润包围的髓质 UA 晶体沉积物，10这引发了一个关于持续性 HU、UA 结晶尿症和 CKD 之间因果关系的先有鸡还是先有蛋的两难境地。16–20许多小型的单中心研究支持无症状 HU 导致 CKD 的概念，21–25在这种情况下，UA晶体诱导的肾损伤和促炎性M1样巨噬细胞的相关浸润是可能的病理机制。26–28然而，几项功能强大、多中心、随机、对照试验没有发现降低尿酸盐的疗法可以延缓CKD的进展。29–33;因此，无症状 HU 在 CKD 进展中的作用仍存在争议。34

检测无症状 HU、UA 结晶尿中毒和 CKD 进展之间的因果关系需要相应的动物模型，其血清 UA 水平在临床相关范围内，而该范围迄今尚不存在。我们假设（1）无症状的HU不会促进CKD进展，除非UA在肾脏中结晶;（2）UA晶体肉芽肿可能由于先前存在的CKD而形成;（3）促炎肉芽肿相关的M1样巨噬细胞可能驱动UA晶体诱导的CKD进展。

方法

动物研究

所有动物实验均由地区政府当局根据欧盟保护用于科学目的的动物指令（2010/63 /EU）批准（参考编号：ROB-55.2-2532.Vet_02-15-189）或克拉科夫的II LKE（参考编号：70/2018，257/2018），并根据ARREAT指南进行报告。35小鼠被每五组饲养在浓缩的过滤顶部笼中，并可以随意自由获得食物和水。笼子，巢穴，食物和水在使用前通过高压灭菌进行灭菌。

动物研究设计

HU对马兜铃酸I诱导的CKD进展的影响

六周龄的阿尔布-克里特2;饲洛克斯/洛克斯老鼠和暴饮暴食9洛克斯/洛克斯对照小鼠（由瑞士洛桑洛桑大学综合基因组学中心弗雷德里克·普雷特纳和伯恩哈德·托伦斯提供）腹膜内注射他莫昔芬1周，以耗尽Alb-creERT2中的Glut9表达;饲洛克斯/洛克斯小 鼠。36之后，阿尔布-克里特2;饲洛克斯/洛克斯老鼠和暴饮暴食9洛克斯/洛克斯对照小鼠腹膜内注射马氏菌酸I（AAI; PBS中5mg / kg身体重量）或载体（PBS），持续2周。37所有小鼠都接受了标准chow饮食，每公斤富含25.6克肌苷（Ssniff，Soest，德国），持续42天。阿尔伯-克瑞特2;饲洛克斯/洛克斯小鼠发展为 HU 和 AAI 诱导的 CKD （HU+AAI）， 骤血9洛克斯/洛克斯小鼠仅发展为AAI诱导的CKD，没有胡（AAI）和阿尔布 - 克雷特2;饲洛克斯/洛克斯使用载体注射和肌苷的周氏饮食的小鼠开发了没有CKD（HU）的HU。

慢性UA晶体肾病模型

诱导慢性UA晶体肾病，阿尔布 - 克里特2;饲洛克斯/洛克斯老鼠和暴饮暴食9洛克斯/洛克斯对照小鼠腹膜内注射他莫昔芬，隔日1周。之后，将小鼠分为四组：第一组Alb-creERT2;饲洛克斯/洛克斯小鼠（HU +结晶尿[CU]）接受酸性饮食，其中58千卡%脂肪和蔗糖富含每公斤25.6克肌苷（新不伦瑞克省研究饮食公司），第二组Alb-creERT2;饲洛克斯/洛克斯小鼠接受了含有肌苷（HU−CU）的标准食物，这是第三组Glut9洛克斯/洛克斯小鼠喂食肌苷（健康1）的致酸饮食，第四组Glut9洛克斯/洛克斯小鼠接受肌苷（健康2）的chow饮食32或42天。托伐菌素（德国塞勒克化学）悬浮在0.5%甲基纤维素/ 0.025%吐温20（德国西格玛奥尔德里奇）中进行体内研究。对于干预研究，HU + CU小鼠从第14天开始接受每日载体（100 μl D-PBS）或托伐菌素（20mg / kg，100 μl D-PBS）2周，通过口服强饲法。从第14天到第32天，每隔一天将HU + CU小鼠腹膜内注射腺苷（1mg / ml，200 μ l D-PBS）（德国西格玛 - 奥尔德里奇）或载体（200 μl D-PBS）。所有干预研究的小组规模计算均基于GFR作为主要终点和从我们先前研究中获得的定量假设。38,39我们通过分层随机化将小鼠分配到不同的治疗方法。

马尔迪-菲特质谱成像

使用低温恒温器（德国徕卡病理系统）从健康，HU−CU和HU + CU小鼠的冷冻未固定肾组织中制备冷冻切片（10 μm）。将组织切片解冻安装在超冻土显微镜载玻片（德国赛默飞世尔科技）上，并使用偏振光进行显微镜检查双折射结晶沉积物。在准备MALDI-质谱（MS）测量之前，我们在室温下在真空干燥器中干燥切片至少45分钟。40然后，为了包衣组织载玻片，使用iMatrix喷雾器在水中施用1：1乙腈/ 0.1%2，2，2-三氟乙醇酸的10mg / ml的α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液。以5 ml/cm2的流速进行四次喷涂循环。在7台特斯拉SolariX XR FTICR MS仪器上分析组织载玻片，该仪器配有配备Smartbeam II激光系统的MALDI光源（德国布鲁克不来梅）。在150–3000 m/z的质量范围内，在负电离模式下检测到离子。在2000 Hz的频率下，每个像素应用200次使用顺序设置的激光照射，在30μm的横向分辨率下，将激光功率设置为20%。针对所有数据点的均方根对每个像素的信号进行归一化。离子图像与切片的光学扫描进行配准，该扫描是在使用光学扫描仪（OpticLab H850；Plustek，德国）应用矩阵之前生成的。 使用FlexImage 4.0、数据分析4.3和/或SCiLS实验室软件（德国布鲁克不来梅）生成MS图像并分析数据。通过将测量的m / z值与根据其元素公式计算的值相匹配来鉴定代谢物UA（C 5 H 4 N 4 O 3 ），则在 1 页/分钟 （m/z 167.02103 D±1 页/分钟）的质量窗口内。 40

介入研究的主要终点

经皮测量GFR

我们在第0天，第14天，第32天和第42天测量了有意识小鼠的GFR（每组n = 5-7只小鼠）。简而言之，我们用异氟醚麻醉小鼠，将一个由两个发光二极管，一个光电二极管和一个电池（德国曼海姆MediBeacon Inc.）制成的微型成像仪设备安装到动物的剃须脖子上。38,42记录皮肤的背景信号5分钟，然后小鼠接受单次注射FITC-汉西司林（iv，150mg / kg体重）（德国曼海姆MediBeacon Inc.）。每只老鼠都放在一个笼子里，信号被记录90分钟。使用成像设备MPD Studio软件（德国曼海姆媒体公司）分析数据。GFR（每100 g体重μ升/分钟）是使用具有线性校正（注射，血浆，间质室和t）的三室模型，通过FITC-正性甘油的荧光强度随时间的降低来计算的1/2的FITC-汉西斯特林），小鼠的体重，以及根据制造商协议的经验性转换因子。

次要端点

在不同时间点收集小鼠血清的

生化参数

。为了评估 HU 和 CKD，我们使用市售试剂盒测量血清尿素氮和肌酐（德国霍尔茨海姆 DiaSys）和血清 UA（BioA测定系统，海沃德），并根据制造商的方案计算浓度。

肾损伤和纤维化的评估

安乐死后，我们从小鼠身上取样了肾脏。我们使用一个肾脏进行流式细胞术分析，另一个肾脏分为三个相等的部分。一部分保存在RNA溶液中，稍后在−80°C下进行RNA分离，第二部分固定在4%甲醛中以包埋在石蜡中以进行组织学分析。39将第三部分在4%多聚甲醛中固定2小时，并在4°C下转移到D-PBS中的15%蔗糖中再转移2小时。之后，将肾脏保存在D-PBS中30%蔗糖中4°C过夜，然后在-80°C下储存以进行组织学检查。为了评估肾损伤和纤维化，我们分别用高碘酸-希夫（PAS）试剂以及银和小天狼星红染色2-μm厚的肾脏切片。通过使用大鼠抗小鼠CD45（BD生物科学，德国海德堡）和大鼠抗小鼠F4 / 80抗体（Bio-Rad，英国基德灵顿）进行免疫染色，在肾脏切片上鉴定肾免疫细胞和巨噬细胞。44免疫染色（%面积）的定量是使用ImageJ软件完成的。一名对实验条件视而不见的观察者进行了所有评估。

荧光染色和免疫组化

将具有HU + CU的小鼠的肾脏固定在4%多聚甲醛中2小时，并在4°C下转移到D-PBS中的15%蔗糖中另外2小时。之后，将肾脏保存在D-PBS中30%蔗糖中4°C过夜，然后在-80°C下储存以进行组织学检查。鬼菁素荧光染色（Alexa荧光-488-共轭，绿色;生命科技，米兰，意大利）过夜和DAPI（核心;生命科技公司，意大利米兰）对40 μ米厚的肾脏切片进行了30分钟，使用配备变色龙Ultra II双光子激光器的徕卡SP5 AOBS共聚焦显微镜（德国韦茨拉尔徕卡）通过z堆栈可视化UA晶体肉芽肿。用HU + CU小鼠的肾脏切片（10 μm）用鬼臼（AlexaFluor-546-共轭，红色;生命科技，意大利米兰）30分钟，然后用双花凝集素（DBA;共轭， 绿色;载体实验室，伯林盖姆）或莲花四角藻凝集素（LTA;共轭， 绿色;载体实验室，伯林盖姆）30分钟，然后DAPI染色30分钟。45肾脏切片也用抗α平滑肌肌动蛋白（αSMA）抗体（德国西格玛 - 奥尔德里奇）或抗Tamm-Horsfall蛋白（THP）抗体（加拿大伯灵顿塞德兰）染色30分钟。二抗是AlexaFluor-488山羊抗小鼠IgG2a或AlexaFluor-488山羊抗小鼠IgG2b（均来自意大利米兰生命科技公司），在30分钟DAPI染色前孵育时间为30分钟。在配备变色龙Ultra-II双光子激光器的徕卡SP5 AOBS共聚焦显微镜（德国韦茨拉尔徕卡）上拍摄了代表性图像，并使用徕卡LAS X软件计算了每个肾脏切片的肉芽肿数量和肉芽肿的大小（μm）。

为了鉴定未溶解的晶体沉积物，在第3天，第14天和第32天用苏木精和曙红（H&E）染色HU + CU小鼠的冷冻（冷冻）未固定的肾脏切片，并在偏振光下可视化UA晶体沉积物。

来自UA晶体沉积物，间质纤维化和细胞浸润的患者的人肾活检样本来自Arkana实验室（阿肯色州小石城）。活检切片固定在Michel的固定剂或10%中性缓冲福尔马林中，并使用标准方案用三色，PAS或H&E染色。我们还对一名65岁的尿路上皮癌和CKD患者（邻近组织显示间质性肾炎和高血压肾病）的肾切除术组织进行了免疫染色。手术标本被新鲜收集并立即固定在法国里尔CHRU大学医院病理学系的10%中性缓冲福尔马林中。用以下抗体染色活检切片：小鼠抗人CD68抗体（1：250，M0814;丹麦达科），小鼠抗人HLA-DR抗体（1：400，M0775;丹麦DKO）和兔抗人CD163抗体（1：400，DB 045-1;生物技术，斯洛伐克），使用标准方案（在台克标记ULTA IHC / ISH系统上的自动免疫组化[IHC];罗氏），并在光学显微镜下观察。

核糖核酸制备和实时荧光定量 PCR

根据制造商的说明，使用来自Qiagen（德国杜塞尔多夫）的RNA提取试剂盒从小鼠肾脏（每组n = 5-7只小鼠）中分离总RNA。使用1%琼脂糖凝胶评估RNA质量，然后使用逆转录转录成cDNA（上标II;英维特亨，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）。使用 SYBRGreen PCR 预混液进行实时 RT-PCR，并使用光循环仪 480（德国曼海姆罗氏）进行分析。所有基因表达值均使用18s rRNA作为管家基因进行归一化。

小鼠样品的流式细胞术分析

我们从小鼠身上取样肾脏，并在37°C下用胶原酶/ DNAse1消化40分钟。38消化的组织通过70-μ m的过滤器，并用冷的D-PBS洗涤。然后将单细胞悬浮液（D-PBS中0.1%BSA，0.01%叠氮化钠）和用抗小鼠CD16 / 32（2.4G2）阻断的FcR洗涤5分钟。阻断后，将细胞用表面抗体PE/Cy5抗小鼠CD45、V450抗小鼠CD11b、BV510抗小鼠MHCII、PE/Cy7抗小鼠Gr1、APC/Cy7抗小鼠CD11c（均来自德国费尔生物转基因）、APC抗小鼠F4/80（德国慕尼黑生物拉德）、FITC抗小鼠CD206（德国北德生物科学公司）和PE抗小鼠Cx3CR1（德国海德堡生物科学）在4°C下染色30分钟。47孵育后，用洗涤缓冲液洗涤细胞并在1ml新鲜洗涤缓冲液中重构。我们使用BD FACSCanto II（新泽西州贝克顿·迪金森）进行流式细胞术分析，并使用FlowJo 8.7（树星公司，阿什兰，俄勒冈州）分析数据。我们使用英维得安检测计数珠（PCB100;赛默飞世尔科技，德国朗根塞尔博尔德）确定每微米细胞的绝对数量。 根据制造商的协议，使用小鼠ELISA试剂盒测量血清中IL-6的ELISA浓度（射线生物技术，诺克罗斯）。吸光度是在多色卡 EX 读码器（德国热电子公司）上测量的。

UA晶体肉芽肿小鼠肾细胞的单细胞RNA测序和数据处理

具有UA晶体肉芽肿（HU + CU）的小鼠的肾脏在液氮中快速冷冻，并在稍后的时间点使用反弹浸渍均质器分离细胞核，如前所述。48简而言之，用细胞核EZ裂解缓冲液（NUC-101;西格玛-奥尔德里奇，德国）补充了RNAse抑制剂。将冷冻组织解冻并切成小块（<1毫米），并使用Dounse均质机匀浆。将匀浆物通过40-μm细胞过滤器（PluriSelect）过滤，并在4°C下以500×g离心5分钟。将沉淀重悬并用4ml重悬缓冲液（1×PBS，2%BSA）洗涤。

根据制造商的说明，使用v3.0化学在铬平台（10x基因组学）上运行细胞核。测序是在使用S1流通池的Illumina Novaseq平台上进行的（伊拉斯谟MC，鹿特丹，荷兰）。由此产生的RNA测序读数与肌肉肌肉Ensembl释放93顶级组装与细胞游侠版本3.0.2（10x基因组学）对齐。估计的细胞数为12，080，每个细胞的平均读数为7775，每个细胞的中位基因为1066个。评估对齐读数总数，细胞和检测到的每个细胞的基因总数的测序性能。我们使用修耳3.0版49和R包，用于识别非免疫细胞和免疫细胞簇。我们过滤掉了表达基因数量少（<200），线粒体基因数量（>0.1%）和总读取次数（>50，000）的细胞，并进行了差异基因分析，并生成了包括巨噬细胞亚群在内的不同免疫细胞的基因热图。聚类被可视化为 UMAP。

统计分析

使用图形盒棱镜7软件对数据进行统计分析。数据呈正态分布，并通过t检验来计算两组之间的显著性，通过单向方差分析与Tukey的事后检验对三个或更多组进行比较，或者通过双向方差分析与Bonferroni的比较事后检验进行比较，当使用两个参数与多个组进行时。所有数据均以平均值表示±SD和P<0.05被认为具有统计学意义。组大小在每个相应的图形图例中指示。

结果

无症状 HU 不影响马兜铃酸诱导的 CKD 的进展

首先，我们测试了持续性无症状 HU 可能导致和促成 CKD 进展的概念。我们喂了阿尔伯-克里特2;饲洛克斯/洛克斯和“饥饿”9洛克斯/洛克斯控制小鼠富含肌苷的chow饮食，并通过使小鼠暴露于AAI来诱导一种进行形式的CKD，AAI是一种已知的肾毒素，导致人类和小鼠的非结晶CKD37 ( 图 1A ).在基线时，所有三组小鼠的血清UA水平在4至6mg / dl之间，在Alb-creERT2中增加;饲洛克斯/洛克斯在第42天小鼠至12-20毫克/分升（HU，HU + AAI），而Glut9洛克斯/洛克斯小鼠保持在基线 UA 水平 （AAI）（ 图 1B ).HU本身与任何结晶尿或痛风性关节炎的体征无关（未显示），因此可以定义为无症状的HU。值得注意的是，无症状 HU 的存在不影响 AAI 诱导的肾病 （HU+AAI） 的进展，与 AAI 小鼠相比，尿素水平降低、GFR 下降、肾小管萎缩和间质纤维化（ 图 1，C–F ).因此，健壮和持续的无症状HU不影响AAI诱导的CKD在小鼠中的进展。

图 1. 无症状 HU 不会诱发肾损伤或促成 AAI 诱发的 CKD 的进展。（一）实验设置示意图。阿尔伯-克瑞特2;饲 洛克斯/洛克斯 老鼠和暴饮暴食9 洛克斯/洛克斯 将小鼠腹膜内注射他莫昔芬，然后注射AAI以诱导CKD或载体（对照）。所有三组均采用肌苷标准周饮食42天。（黑白）第0天和第42天（每组n = 5只小鼠）仅血尿酸，仅AAI和HU + AAI小鼠的血清UA（B）和尿素氮水平（C）和GFR（D）。（英–埃）PAS（放大，×100）染色显示仅在AAI（E′）和HU + AAI（Eʺ）小鼠中发生肾小管损伤，但在第42天（每组n = 5只小鼠）中不显示仅HU（E）小鼠。（傅-菲）在第42天（每组n = 5只小鼠）中仅AAI（F′）和HU + AAI（Fʺ）小鼠中，在皮克罗 - 天狼星红色染色的肾脏切片上显示的间质纤维化，但不在仅HU（F）小鼠中。放大倍率，×200。数据为平均值±标准误差 * P<0.05;** 和 P<0.01;P<0.001;NS，通过双向方差分析不显著。

HU 伴有 UA 结晶尿症导致慢性肾脏病

在急性尿酸盐肾病模型中，作者表明，低至轻度HU伴UA结晶尿诱导与肾小管损伤，炎症，巨噬细胞浸润和Alb-creERT2纤维化相关的肾功能障碍;饲洛克斯/洛克斯小 鼠。36,50为了研究具有UA结晶尿症的HU是否驱动CKD，我们放置了阿尔布-克雷特2;饲洛克斯/洛克斯或“过剩”9洛克斯/洛克斯控制小鼠使用富含尿酸盐前体肌苷的产酸饮食或含有肌苷的标准chow饮食32天（ 图 2A ).在两组阿尔布- 克里特2;饲洛克斯/洛克斯喂食富含肌苷的饮食的小鼠，与Glut9相比，血清UA水平显着增加洛克斯/洛克斯小鼠（健康1和2），表明这些小鼠发展了HU（ 图 2B ).但是，只有阿尔布-克里特2;饲洛克斯/洛克斯肌苷酸化饮食的小鼠发生CKD（HU + CU），与Alb-creERT2相比，血清尿素和肌酐水平显着增加以及GFR下降;饲洛克斯/洛克斯使用肌苷（HU−CU）和暴食9洛克斯/洛克斯两种肌苷饮食（健康1，健康2）的小鼠保持健康而没有肾脏损伤（ 图 2，C–E ).

图 2.

肾脏晶体沉积物导致小鼠CKD。（A） 阿尔布-克里特2;饲洛克斯/洛克斯和“饥饿”9洛克斯/洛克斯对照小鼠腹膜内注射他莫昔芬。两组均喂食富含肌苷的致酸饮食或肌苷的标准chow饮食长达32天。（黑白）血清 UA （B）， 尿素氮 （C） 和肌酐 （D） 水平的阿尔布-克瑞特 2;饲洛克斯/洛克斯使用产酸饮食和肌苷 （HU+CU） 或有肌苷 （HU−CU） 和谷过激的饮食的小鼠洛克斯/洛克斯在第32天使用肌苷（健康2）或用肌苷（健康1）进行酸化饮食的小鼠（每组n = 5只小鼠，使用单向方差分析）。（E）从第0天到第32天所有四组的GFR（每组n = 5只小鼠，双向方差分析）。（F）从HU + CU小鼠收集尿液，这些小鼠在第0天，第3天，第14天和第32天喂食肌苷的致酸饮食。图像说明了第3、14和32天尿液中的UA晶体（F'-F'''）。（G）使用pH计测量HU + CU小鼠的尿液pH值（每组n = 5只小鼠，单向方差分析）。（汉-日）冷冻未固定的肾脏切片（H-J）和晶体沉积物的H&E染色在Alb-creERT2的可偏振光学显微镜下可视化;饲洛克斯/洛克斯在第3天，第14天和第32天（H'-J'）使用酸源性饮食和肌苷（HU + CU）的小鼠。数据为平均值±标<0.01;或 P<0.001;NS，不重要。###

报告显示，低尿pH值可促进可溶性UA的结晶和UA晶体肾病或UA尿石症的发展。14,51,52为了调查尿液结晶是否是导致观察到的肾功能不全的原因，我们检查了Alb-creERT2的尿液;饲洛克斯/洛克斯用肌苷（HU + CU）喂养酸源性饮食并发现显着结晶尿（ 图1F ）以及尿液 pH 值下降（ 图 1G ）从第3天开始。在用H&E染色的冷冻未固定的肾脏切片上也观察到晶体沉积物，这些切片在偏振光（ 图 2，H–J ).这表明肌苷和致酸饮食都需要在Alb-creERT2中诱导具有结晶尿的HU;饲洛克斯/洛克斯小鼠，而单独的酸化饮食或食物饮食不足以诱导HU或晶体诱导的CKD（补充图1，A-D）。

为了确定这种晶体沉积物的组成和位置，我们进行了偏振光显微镜检查，并在HU + CU小鼠（ 图 3A ），而在HU−CU和健康小鼠（ 图 3、A 和 A ).晶体沉积物主要局限于内延髓，但也位于皮质的局灶区域。MALDI-MS成像使分析物UA（蓝色）的分子分布与组织切片的偏振图像相匹配，UA与检测到的晶体沉积物（ 图 3、A 和 B ).MALDI-MS成像显示，主要分析物是UA，如蓝色所示，信号为m / z 167.02103，质量精度为±1 ppm（ 图 3B ).这对应于UA的去质子化形式。为了确认来自HU + CU小鼠的尿液晶体是UA晶体，我们添加了重组尿酸酶，发现UA晶体在5分钟后完全溶解（ 图 3C ），而草酸钙晶体不受影响（补充图1E）。HU + CU小鼠的体重在32天后不受影响，而HU和健康小鼠在开始特殊饮食后体重增加（ 图 3D ).第32天HU + CU小鼠的肾脏尺寸较小，皮层粗糙而苍白，有白色晶体沉积物，第32天体重更大（ 图 3、E' 和 H ） 与第 3 天的肾脏相比（ 图3E ）和第32天从HU和健康小鼠（ 图 3，F–H ).

图 3.

髓质晶体沉积物由UA组成。阿尔伯-克瑞特2;饲洛克斯/洛克斯和“饥饿”9洛克斯/洛克斯对照小鼠腹膜内注射他莫昔芬。两组均喂食富含肌苷的致酸饮食或肌苷的标准chow饮食长达32天。（A）偏振光显微镜图像（MALDI-MS成像前）可视化来自具有HU + CU（A）和HU−CU（A'）的小鼠和健康小鼠（A''）的冷冻未固定肾组织切片中的双折射晶体沉积物。（B）用光学扫描叠加MALDI-MS图像，以可视化与（A）（B）相同的HU + CU小鼠组织切片中UA（m / z 167.02103 D）的空间分布，但在HU−CU小鼠（B'）中要少得多，并且在健康小鼠（B''）中不存在。c， 皮层;m，髓质。（C）第32天（C）在光学显微镜下观察HU + CU小鼠的尿液晶体。在5分钟内加入拉布立酶溶解UA晶体（C'–Cv).放大倍率，×400。（D）第0天和第32天所有四组小鼠的体重（每组n = 5只小鼠，双向方差分析）。（英英吉利）第3天（E）和第32天（E'）来自HU + CU小鼠以及来自HU−CU（F）或健康小鼠（G）的肾脏的宏观图像。（H）第32天所有四组小鼠的肾重（每组n = 4-5只小鼠，单向方差分析）。数据为平均值±标准偏差 *P<0.05;**页<0.01;P<0.001;NS，不重要。

PAS染色仅在HU + CU（ 图 4，A–A ，黑色箭头）以及管状损伤标志物KIM-1的增加（ 图 4B ），但不是在第32天的HU−CU和健康对照组。每个肾脏切片存在5至21个肉芽肿（ 图 4C ).所有肉芽肿主要出现在延髓中，中央有一个溶解的UA晶体裂隙，被多核巨细胞包围（ 图 4、D 和 E ，补充电影 1 和 2）。这些肉芽肿的大小从50到150 μ米不等;大多数肉芽肿测量在 70 至 110 μm（ 图4F ），总肉芽肿大小与晶体裂隙大小呈正相关（斜率为 0.35，相关系数为 r2=0.55; 图 4G ).我们没有在皮质中发现肉芽肿，因此在冷冻的未固定的肾脏切片上记录的晶体沉积物很可能与在固定过程中被冲洗掉的小管内的UA沉淀有关 .

图 4.

肾 UA 晶体沉积与慢性 UA 晶体肾病小鼠的肾小管损伤、炎症和间质纤维化有关。阿尔伯-克瑞特2;饲洛克斯/洛克斯和“饥饿”9洛克斯/洛克斯对照小鼠腹膜内注射他莫昔芬。两组均喂食富含肌苷的致酸饮食或含有肌苷的标准chow饮食32天。（A）PAS染色表明HU + CU小鼠（A）中的肾小管损伤和UA晶体肉芽肿（黑色箭头），但在HU-CU（A'）和健康小鼠（A''和A'''）中则不然。放大倍率，×200。（B）第32天所有四组小鼠肾内mRNA表达水平为肾小管损伤标志物KIM-1。（C）在HU + CU小鼠的PAS染色肾脏切片上计数的肉芽肿数量。在HU−CU和健康小鼠（每组n = 7只小鼠，单因素方差分析）中未观察到肉芽肿。（D）PAS染色显示HU + CU小鼠中的UA晶体肉芽肿。放大倍率，×400。（E）冷冻未固定肾脏切片的荧光显微镜显示UA肉芽肿，其中心是来自具有HU + CU小鼠的溶解UA晶体的裂隙，如鬼灭英（肌动蛋白丝，绿色）和DAPI（细胞核，白色）所示。放大倍率，×630。（F 和 G）对肾切片上每例 UA 肉芽肿 （μm） 的大小进行定量分析，以及裂隙大小 （μm） 与 UA 肉芽肿大小 （μm） 之间的线性相关性，以及 r2=0.35 （G）.（H）UA肉芽肿（白色箭头）和来自HU + CU小鼠纤维化的荧光显微镜，如αSMA（绿色），鬼臼蛋白（肌动蛋白丝，红色）和DAPI（细胞核，白色）所示。放大倍率，×400。（国际–韩国）来自具有HU + CU的小鼠的UA肉芽肿（白色箭头）的免疫染色，如DBA（I，远端小管，绿色），LTA（J，近端小管，绿色）和THP（K，厚的上升肢体，绿色）所示。将鬼笔环蛋白用作膜染色（肌动蛋白丝，红色）和DAPI以可视化细胞核（白色）。放大倍率，×400。数据为平均值±SD<。NS，不重要。

接下来，我们询问UA晶体肉芽肿是否由肌成纤维母细胞或管状上皮细胞组成。我们对 HU+CU 小鼠的冷冻固定肾切片进行了免疫染色，发现 UA 晶体肉芽肿对 αSMA、DBA、LTA 和 THP（ 图 4，H–K ，白色箭头），排除管状上皮细胞组成。

与HU + CU小鼠肾脏切片中的UA晶体肉芽肿一样，人肾活检样品中的髓质UA晶体沉积物以针状或羽毛状空裂的形式显示为空隙，代表福尔马林固定和组织处理后溶解的UA晶体（ 补充图2A ，黑色箭头）。UA晶体肉芽肿显示中度至重度细胞炎症，上皮样单核细胞层（ 补充图2A ），异物型巨细胞（ 补充图2B ，黑色箭头）和间质纤维化（ 补充图2C ）。在固定过程中幸存下来的UA晶体在偏振光下显示出双折射（ 补充图2D ）。综上所述，降低尿液pH值将我们的小鼠强健且持续的无症状HU模型转变为模仿以肉芽肿性间质性肾炎为特征的慢性UA晶体肾病的模型。

结晶肉芽肿在慢性 UA 晶体肾病病程晚期形成

晶体 UA 肉芽肿是在 CKD 和间质纤维化之前还是之后发展尚不清楚。为了研究这一点，我们研究了UA肉芽肿在CKD间质纤维化的一个时间段内的演变。与第32天的其他三组相比，HU + CU小鼠的纤连蛋白1，胶原1α1和成纤维细胞特异性蛋白（Fsp）–1的肾内mRNA表达水平显着增加（ 图 5A ).Picro-sirius红色染色显示，间质纤维化在第14天已经存在，并且在HU + CU小鼠的研究结束之前进一步增加，如Picro-sirius红区域的百分比所示（ 图 5、B 和 C ).这与GFR随时间下降（ 图 5D ).在确定GFR下降与间质纤维化程度之间的关联时，我们发现斜率为−2.26的两个变量之间存在线性关系，相关系数为r2=0.67 （ 图5E ).尽管GFR下降了50%（第0天与第14天; 图 5D ）和纤维化病变的显著增加（ 图 5C ），我们注意到，与第32天相比，HU + CU小鼠中U + CU小鼠的UA晶体肉芽肿数量非常低（ 图5F ).肉芽肿数量与纤维化程度之间的统计分析显示，无线性消退，而是从第14天到第32天达到稳定状态（r2=0.54; 图 5G ).因此，在这种慢性UA晶体肾病模型中，肉芽肿在疾病过程的后期形成，而不是在CKD和间质纤维化已经建立之前。

图 5.

间质纤维化后形成的肾UA晶体肉芽肿。阿尔伯-克瑞特2;饲洛克斯/洛克斯和“饥饿”9洛克斯/洛克斯对照小鼠腹膜内注射他莫昔芬。两组均喂食富含肌苷的致酸饮食或含有肌苷的标准chow饮食32天。（A）所有四组小鼠的纤维化标志物纤连蛋白1，胶原（Col）1α1和Fsp-1的肾内mRNA表达水平（每组n = 5只小鼠，单因子方差分析）。（B）皮克罗 - 天狼星红色染色，说明在第14天（B）和第32天（B'）天HU−CU小鼠肾脏切片中的间质纤维化。黑色箭头指向UA肉芽肿。放大倍率，×200。（C）量化来自HU + CU小鼠的小天狼星红色染色肾切片（每组n = 5-7只小鼠，单向方差分析）。（D）HU + CU小鼠在第0天，第14天和第32天的GFR（每组n = 5-7只小鼠，单向方差分析）。（E）随时间推移的HU+CU小鼠GFR与纤维化的线性回归分析（r2=0.67）。（F）在第0天，第14天和第32天对HU + CU小鼠的PAS染色的肾脏切片计数的UA肉芽肿数量（每组n = 5-7只小鼠，单向方差分析）。（G） 非线性回归图示，每个肾切片的肉芽肿数量与间质纤维化程度之间的曲线拟合（r2=0.54）。数据为平均值±标准偏差 *P<0.05;页<0.01;P<0.001;NS，不重要。

慢性UA晶体肾病伴肉芽肿性间质性肾炎的巨噬细胞表型

接下来，我们在第32天对HU + CU小鼠的肾脏进行了单细胞RNA测序。已知细胞类型特异性标志物，53–56已鉴定的通常实质肾细胞（ 图 6、A 和 B ），以及白细胞簇均呈 Ptprc （Cd45） 阳性，正如预期的那样（ 图 6C ).此外，我们使用文献中的常见基因来鉴定炎症信号通路，如JAK/STAT（ 图 6D ）和不同的免疫细胞亚群57,58包括促炎性 M1 样（ 图6E ）和交替活化的M2样巨噬细胞（ 图6F ），中性粒细胞（ 图 6G ）和常规树突状细胞 （cDC） 亚群 （ 图 6、H 和 I ).这些数据意味着在慢性UA晶体肾病期间与免疫细胞浸润相关的慢性炎症反应。

图 6.

鉴定炎症信号通路和免疫细胞亚群。单细胞核糖核酸测序。（一和二）第32天对患有慢性UA晶体肾病和肉芽肿性肾炎（HU + CU）的小鼠的肾脏进行单细胞RNA测序。共鉴定出12组非免疫细胞和免疫细胞。聚类分析以 UMAP （A） 和热图 （B） 的形式表示。C.D.I.过渡，收集导管插层和转移细胞;导管主细胞收集导管主细胞;直流小管，远端波纹小管;L.亨勒，亨利细胞的环;系膜，系膜细胞;小管，近端小管;外延。输尿管，输尿管上皮细胞。（C–I）来自HU + CU小鼠肾脏的单细胞RNA测序根据Ptprc基因表达证明为UMAP（C）来鉴定免疫细胞簇。免疫细胞簇内特定基因的热图具有炎症信号通路（D），M1样（E）和M2样巨噬细胞（F），嗜中性粒细胞（G）和cDCC cDC1（H）和cDC2（I）的特征。

巨噬细胞在体内平衡期间以及急性和慢性疾病过程的所有不同阶段充当局部微环境的放大器。58,59为了评估哪些浸润的白细胞，特别是巨噬细胞表型可能有助于慢性UA晶体肾病肉芽肿的形成，我们首先对肾细胞悬浮液进行了流式细胞术分析。数据显示，大多数白细胞是CD45MHCIIF4/80++你好巨噬细胞。这些进一步被区分为M1样促炎巨噬细胞（CD45MHCIIF4/80++你好光盘11张+瞧断续器206+−）和替代活化的 M2 样巨噬细胞 （CD45MHCIIF4/80++你好光盘11张+瞧断续器206++) ( 图 7、A 和 B ).化学药品（CD45/80CD11b+++你好断续器11酸你好） 以及中性粒细胞和单核细胞 （CD45MHCII+−镉11B你好第一页你好）也出席了（ 图 7、A 和 B ).肾脏切片的免疫染色证实，与第32天的其他三组相比，HU + CU小鼠中浸润的F4 / 80巨噬细胞数量较多（+ 图 7D ).有趣的是，在第14天，HU+CU小鼠中M1样巨噬细胞的数量高于M2样巨噬细胞，这一观察结果在第32天逆转（ 图 7C ).UA 晶体肉芽肿为 CD45 和 F4/80 阳性（++ 图 7、E 和 F ），指示M1样巨噬细胞。M2样巨噬细胞标志物CD163为阴性（ 图 7G ).

图 7.

巨噬细胞有助于UA晶体肉芽肿的形成。阿尔伯-克瑞特2;饲洛克斯/洛克斯和“饥饿”9洛克斯/洛克斯对照小鼠腹膜内注射他莫昔芬。两组均喂食富含肌苷的致酸饮食或含有肌苷的标准chow饮食14和32天。（一和二）来自HU + CU小鼠的整个肾脏的流式细胞术分析。识别巨噬细胞的门控策略 （CD45MHCIICD11bF4/80+++你好断续器11酸瞧），促炎性 M1 样巨噬细胞 （CD45MHCIIF4/80++你好光盘11张+瞧断续器3+−），或者活化的 M2 样巨噬细胞 （CD45MHCIIF4/80++你好光盘11张+瞧中性粒细胞（ CD45+++−CD11bGr-1） 和碳直流（CD45++++瞧镉11B你好断续器11酸你好） （A）。第32天来自HU + CU小鼠肾脏的白细胞亚群的绝对数量（每组n = 5只小鼠）（B）。（C）通过流式细胞术测定的第14天和第32天来自HU + CU小鼠的M1和M2样巨噬细胞的绝对数量（每组n = 5只小鼠，双向方差分析）。数据为平均值±标准偏差 *P<0.05;页<0.001。（D）肾脏切片的F4 / 80免疫染色，说明F4 / 80细胞在HU + CU小鼠（D）中的浸润，但不是在第32天在HU−CU（D'）和健康小鼠（D''和D'''）中。放大倍率，×25。（英英吉利）对HU+CU小鼠肾脏的免疫染色表明，UA晶体肉芽肿对免疫细胞标志物CD45（E）和F4/80（F）呈阳性，但对M2样巨噬细胞标志物CD163（G）在第32天没有阳性。放大倍率，×200。（汉-日）肾切除术标本的免疫染色显示许多 UA 晶体肉芽肿对 CD68 巨噬细胞 （H） 和 HLA-DR+ 促炎性 M1 样巨噬细胞 （I） 呈阳性，但对 CD163 替代活化的 M2 样巨噬细胞 （J） 则不呈阳性（放大，×400）。患者为65岁男性，有尿路上皮癌、间质性肾炎和血管性肾病、2型糖尿病、缺血性心肌病和高血压、血清肌酐2 mg/dl病史。+++

为了在人类中也证实这一点，对一名HU患者的肾活检样本进行IHC显示肉芽肿和间质（+ 图 7H ).髓质 UA 晶体肉芽肿主要由 HLA-DR 促炎性 M1 样巨噬细胞（+ 图 7I ），而CD163交替激活的M2样巨噬细胞弥漫性地分布在更宽的周围间质（+ 图 7J ).数据表明，在HU相关结晶尿患者中，髓质UA晶体肉芽肿与进行性CKD的结构间质重塑特征有关;这些病变涉及促炎性 M1 样巨噬细胞。

托伐菌素的JAK/STAT抑制不影响慢性UA晶体肾病中晶体肉芽肿的形成和CKD进展

人类微阵列基因表达数据60显示大多数炎症基因，包括STAT1，IL4R，IL13RA1，IL6ST，IL6R，IL13和INFG，所有这些都参与JAK / STAT信号传导，在大多数CKD实体中表达，尽管在高度炎症性肾脏疾病（如狼疮性肾炎（ 图 3 、补充方法）或 FSGS。 61 然而，JAK/STAT信号传导在晶体肾病中的作用目前尚不清楚。这提出了一个问题，即靶向晶体诱导的炎症是否可以调节慢性UA晶体肾病和特别是肉芽肿性间质性肾炎的进展。

JAK/STAT抑制剂托伐菌素被批准用于治疗慢性炎症，如类风湿性关节炎62和银屑病关节炎，63这在我们的慢性UA晶体肾病伴肉芽肿性肾炎模型中作为测试托伐菌素的额外理由。HU + CU小鼠从第14天开始接受20mg / kg托伐菌素，当间质纤维化但尚未建立晶体肉芽肿时（补充图4A）。与第32天的载体治疗小鼠相比，托伐菌素显着降低了血清IL-6水平（补充图4B）。然而，在血清 UA 水平、尿素水平、GFR、肾小管损伤和肾脏内 MRNA 表达的 KIM-1、Il6、Tnfα、iNos、Arg1、纤连蛋白 1 和 Col1α1（补充图 4，B–I）方面，托伐菌素与载体治疗之间没有观察到差异。此外，与载体处理的HU + CU小鼠相比，托伐菌素没有改变M1样和M2样巨噬细胞的数量（补充图4，J和K）以及UA晶体肉芽肿的数量（补充图4L）。因此，托伐菌素的JAK/STAT抑制不影响UA晶体诱导的炎症、巨噬细胞介导的肉芽肿形成和慢性UA晶体肾病小鼠模型中的CKD进展。

用腺苷抑制M1巨噬细胞减少肉芽肿形成和慢性UA晶体肾病的CKD进展

如果JAK / STAT抑制是一种过于不特异性的抗炎策略，我们推测了一种更具体的干预措施，例如抑制间质巨噬细胞的M1样表型。腺苷A的活化2巨噬细胞上的受体可以抑制巨噬细胞的M1样活化，这一概念先前已被证明可以防止其他CKD模型中的进行性间质纤维化。64–66因此，我们研究了受体激动剂腺苷对HU + CU小鼠的影响，从第14天到第32天安乐死（ 图 8A ).腺苷对血清UA水平没有影响（ 图 8B ），但显著降低血清尿素氮水平，并在第 32 天（ 图 8、C 和 D ).肾脏切片的免疫染色显示肾小管损伤较少（ 图 8、E 和 F ），UA晶体肉芽肿数量减少（ 图 8G ），并减少间质性纤维化（ 图 8H ）以及肾内CD45细胞数量的减少（+ 图 8I ）在腺苷治疗后。正如预期的那样，腺苷治疗诱导巨噬细胞从M1-型巨噬细胞转变为M2样巨噬细胞表型，CD45MHCIIF4/80的数量减少表明++你好光盘11张+瞧断续器3+−M1样巨噬细胞（ 图 8J ），但CD45MHCIIF4/80的数量增加++你好光盘11张+瞧CX3CR1CD206 M2样巨噬细胞 （++ 图 8K ）在第32天。综上所述，无症状 HU 不影响 CKD，除非 UA 在肾脏内结晶并引起 UA 晶体肾病（ 图8L 、左面板和中间面板）。UA晶体肉芽肿在慢性UA晶体肾病病（ 图 8L，右面板 ).肉芽肿性肾炎与多种巨噬细胞表型相关，但 UA 晶体肉芽肿中富含 M1 样巨噬细胞。用腺苷抑制M1样巨噬细胞活化会减弱晶体肉芽肿的形成和随后的CKD进展。因此，M1样巨噬细胞在慢性UA晶体肾病伴肉芽肿性间质性肾炎的进展中起着至关重要的作用。

图 8.

腺苷治疗通过激活巨噬细胞中的腺苷受体信号传导来减少肉芽肿相关的 CKD 进展。（一）实验设置示意图。阿尔伯-克瑞特2;饲洛克斯/洛克斯将小鼠腹膜内注射他莫昔芬，然后用肌苷喂养产酸饮食32天。在第14天，HU + CU小鼠每隔一天注射一次腺苷或载体。（黑白）腺苷和载体处理的HU + CU小鼠在第0-32天的血清UA（B）和BUN水平（C）和GFR（D）（每组n = 5）。（英和女）PAS染色（E）说明了第14天HU + CU小鼠和第32天腺苷和载体处理的HU + CU小鼠的肾小管损伤和肾小管损伤评分（F）（每组n = 3-7只小鼠）。放大倍率，×100。（G）PAS染色的肾脏切片上的肉芽肿数量（每组n = 3-7只小鼠）。（H）银染肾脏切片间质纤维化的百分比（%）（每组n = 3-7只小鼠）。（国际–韩国）肾脏 CD45 细胞的绝对数量 （I），促炎性 M1 样巨噬细胞 （J， CD45MHCIIF4/80+++你好光盘11张+瞧断续器3+−），以及替代活化的 M2 样巨噬细胞 （K， CD45MHCIIF4/80++你好光盘11张+瞧CX3CR1CD206）（每组n = 3-7只小鼠）。数据为平均值±标< *P<0.05;页<0.01;P<0.001;NS，通过双向方差分析不显著。（L）提出了无症状HU和UA结晶尿的机制。无 UA 结晶尿的无症状 HU 的缺失或存在不会导致 CKD（左图）。只有当 UA 由于尿 pH 值低而在尿液中沉淀时，UA 晶体才会引发肾小管梗阻、炎症和间质纤维化，如慢性 UA 晶体肾病（中图）。最终，晶体塞子转位到间隙室中。在间质中，大晶体团的受挫吞噬作用导致由M1样巨噬细胞组成的UA晶体肉芽肿的形成。这些 UA 晶体肉芽肿有助于 CKD 进展（右图），可被腺苷抑制。++

讨论

我们假设（1）无症状的HU不会促进CKD进展，除非UA在肾脏中结晶;（2）UA晶体肉芽肿可能不在CKD之前，而是在先前存在的CKD上发展;（3）肉芽肿相关巨噬细胞的表型驱动CKD进展。我们的实验数据证实，无症状的HU不会引起CKD或促进肾功能的进行性下降。只有由于尿酸化导致结晶尿的 HU 可诱发肾小管损伤、炎症和间质纤维化，这是 CKD 的特征。随后，UA晶体肉芽肿形成并导致CKD进展（ 图8L ).使用腺苷靶向M1样巨噬细胞可以防止UA晶体肉芽肿的形成和进行性间质纤维化，而JAK / STAT抑制剂托伐菌素没有这种作用。这些发现否定了无症状 HU 在 CKD 进展中的作用，并提示 UA 结晶尿和 UA 结石形成是潜在指标。

多年来，无症状 HU 是否有助于 CKD 进展一直是一个有争议的问题。8,67尽管对所有单中心研究的荟萃分析支持降尿酸药物对未选择的 CKD 进展的益处，比值比为 0.9，但对有关该主题的所有有充分效力的多中心随机对照试验的 meta 分析显示，比值比为 1，因此否定了无症状 HU 与未选择形式的 CKD 进展之间的因果关系。9这一结论不仅与孟德尔随机化研究对这一问题的两项研究结果一致，68,69而且我们的体内数据也表明，即使强健和持续的无症状HU也不会引起CKD或加速AAI诱导的CKD。此外，我们最近可以证明，无症状 HU 作为先天免疫的内在负调节剂，具有在急性组织炎症中通过尿酸盐转运蛋白 SLC2A9 介导的 UA 细胞内摄取抑制单核细胞活化的能力，70,71强调对无症状 HU 的免疫调节作用。

然而，当UA在肾脏中沉淀时，例如，在酸源性饮食的影响下，情况就不同了。36或其他降低尿液pH值的因素。14,15这种UA晶体沉积物引起肾小管阻塞，炎症，包括巨噬细胞在内的免疫细胞浸润和间质纤维化，类似于在草酸钙晶体诱导的CKD中观察到的纤维化。38,71肾功能受损、尿液酸化、饮食中过量摄入富含嘌呤的食物、内源性 UA 分泌过多和 UA 沉淀都是慢性 UA 晶体肾病的已知危险因素。72–77事实上，降低尿pH值足以将无症状的HU转变为慢性UA结晶性肾病。

髓质 UA 晶体肉芽肿继发于慢性 UA 晶体肾病和间质纤维化，可能与肾小管晶体塞和插管外有关，这些小管晶体栓塞和插管在标准病理学中仍然不可见，并且仅在冷冻的未固定的肾脏切片上检测到，这与在人肾活检中观察到的一致。17,26在此过程中，巨噬细胞包围并将UA晶体转位到间质中，然后形成肉芽肿，78这反过来又通过M1样巨噬细胞相关的肾脏炎症驱动间质炎症，从而促进CKD的进展。UA晶体的直接相互作用甚至摄取强烈刺激巨噬细胞激活这种促炎表型。79–81肉芽肿由不同的巨噬细胞亚群组成。这种活化的促炎巨噬细胞直接与感染性生物体或肉芽肿中心被交替活化的巨噬细胞包围的微颗粒相互作用。28,78,82–84M1样巨噬细胞存在于慢性UA晶体肾病小鼠中，并且用腺苷抑制M1样表型显着减弱肉芽肿性间质性肾炎并进展为CKD。这一发现与先前的体外和体内报告一致，这些报告证明了在各种CKD动物模型中靶向巨噬细胞中靶向腺苷受体信号传导的有益作用。64–66,85–89包括其他慢性结晶性肾病。47,90腺苷对肾脏内外其他免疫细胞亚群的影响也可能有助于功能和结构结果。

虽然仅被批准用于治疗类风湿性和银屑病关节炎，但许多实验研究表明，抑制JAK / STAT信号通路可以抑制包括哮喘在内的多种自身免疫性和炎症性疾病模型中的炎症和器官损伤，91巨细胞动脉炎，92溃疡性结肠炎，93慢性胰腺炎，94和狼疮性肾炎。95,96人类微阵列基因表达数据60显示许多 JAK/STAT 信号通路相关转录本在高度炎症性疾病（如狼疮性肾炎）中的过表达。慢性 UA 晶体肾病肾脏的转录组分析给出了一致的结果。然而，JAK / STAT抑制剂托伐菌素在我们的模型中没有显示出肾保护作用。我们假设 JAK/STAT 相关细胞因子与更慢性病因引起的肉芽肿性间质性肾炎没有严重影响。然而，托伐菌素对 Jak1 和 Jak3 有特异性作用，我们不能排除具有其他特异性的 JAK/STAT 抑制剂可能引起不同的效果。

我们的实验旨在达到模仿人类深厚HU的HU水平。有人可能会争辩说，UA在小鼠和人类的处理方式完全不同，小鼠没有被编程为如此高的UA酸水平，实际上更温和的HU形式会更好地模仿人类的相对升高。然而，结合先前研究的结果，我们可以得出结论，即使高血清UA水平也不会加速CKD进展，除非它们引起小鼠结晶尿和肾内UA沉积。50

总之，我们的数据显示，无症状的HU不会影响CKD的进展，除非UA在肾脏中结晶，如UA结晶尿导致慢性UA晶体肾病（图8L).UA晶体肉芽肿在该过程的后期发展，但有助于CKD进展，因为UA晶体触发M1样巨噬细胞相关的间质炎症和纤维化。专门针对这些促炎性 M1 样巨噬细胞，但不针对 JAK/STAT 抑制，可以减弱肉芽肿性间质性肾炎。我们目前的科学证据表明，只有患有 UA 晶体尿症的 HU 才能驱动 CKD，并且识别尿液 UA 晶体可以作为无症状 HU 患者是否需要接受降尿酸盐治疗的额外诊断参数。‍

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