精准前沿丨晚期肝细胞癌对阿替利珠单抗联合贝伐单抗的临床反应和耐药的分子相关性

本期《精准前沿》栏目分享美国哈佛医学院的研究团队发表于Nature Medicine（IF=87.24）上的一篇研究[1]，该研究纳入了358例来自GO30140(NCT02715531) 1b期试验和IMbrave150(NCT03434379) 3期研究的肝细胞癌的患者，这些患者接受了阿替利珠单抗+贝伐单抗、阿替利珠单抗单药治疗或索拉非尼治疗，研究确定了联合治疗的关键分子相关性，并强调抗VEGF可能通过靶向血管生成、Treg增殖和骨髓细胞炎症与抗PD-L1协同作用。

病例分享

肝细胞癌（HCC, hepatocellular carcinoma）是全球第六大常见癌症、癌症相关死亡的第三大原因。对于不可切除的HCC患者，目前获批的一线全身疗法包括索拉非尼和乐伐替尼在内的抗血管生成多激酶抑制剂。其他针对程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）—PD-L1轴的多激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂（ICI）已被批准作为二线治疗。尽管有这些治疗选择，但不可切除的HCC患者预后较差，医疗需求仍然很高。最近阿替利珠单抗（抗PD-L1）和贝伐单抗（抗VEGF）的联合治疗在初始1b期研究（GO30140）和随后的3期随机研究（IMbrave150）中显示出可耐受的安全性和较好的抗肿瘤活性，与索拉非尼相比，表现出中位总生存期（OS）统计学意义和临床意义上的改善。因此，联合疗法已被70多个国家批准为既往未接受过全身治疗、不可切除HCC患者的新护理标准。在非小细胞肺癌（NSCLC）和肾细胞癌（RCC）的2/3期研究中，与各自的护理标准相比，ICI与抗VEGF的组合也有显著改善的临床结果。然而，潜在的预测性生物标志物以及对联合治疗的反应或耐药机制尚未得到深入研究。该研究报告了358例基线肿瘤的分子特征，这些患者来自GO30140 1b期或IMbrave150 3期试验的HCC患者，这些患者接受了阿替利珠单抗+贝伐单抗、阿替利珠单抗单药治疗或索拉非尼治疗。研究确定了用于预测抗PD-L1和抗VEGF联合治疗响应和耐药性的潜在候选生物标志物。此外，研究结果为抗VEGF如何增强抗肿瘤免疫和增强抗PD-L1免疫治疗提供了机制见解。  

研究设计

研究设计（图1）：

(1) 使用GO30140研究（n=90）作为初始发现队列，使用IMbrale150研究（n=177）作为第二个队列进行进一步确认和探索。

(2) 转录组水平分析包括全基因组差异基因表达分析、GSEA、细胞类型去卷积分析和通路/免疫亚群特征及其与RECIST反应和存活的关联。基因组分析包括肿瘤突变负荷、新抗原负荷、体细胞突变及其与RECIST反应和生存的关联。

(3) 为了更好地了解抗VEGF增强了抗PD-L1的抗肿瘤活性的机制，使用GO30140 F组随机研究的转录组数据作为发现数据集，并通过治疗前vs治疗后配对的活检样本以及临床前小鼠模型的基因表达分析进一步验证这些发现。同时整合了包括PD-L1 IHC、CD8 IHC、多重IHC和数字病理学在内的原位分析，交叉验证或支持基因组的发现。

图1. 研究设计

研究结果

1.  对阿替利珠单抗联合贝伐单抗治疗临床反应的分子相关性

为了探索与阿替利珠单抗+贝伐单抗的临床反应或耐药相关的潜在生物标志物，使用GO30140 A组研究（n=90）作为初始发现队列，IMbrave150研究（n=177）作为第二个队列进行了综合分析。结合这两项试验的临床数据，进行生物标志物的初步分析。

GO30140 A组是一个评估阿替利珠单抗+贝伐单抗疗效的单臂研究队列，在该队列中探索了与主要疗效终点、确认的客观缓解率（ORR）的潜在基因组相关性。全基因组差异表达基因（DEG）分析结果显示：在治疗前肿瘤中存在的多个抗肿瘤免疫基因是与对联合治疗敏感（定义为完全（CR）或部分反应（PR））相关的主要特征（图2A），Hallmark基因集富集分析（GSEA）进一步证实了这一结论。作者还观察到包括CD8和CD4 T细胞、Tregs、B细胞和树突状细胞的几种免疫亚群的存在，与更好的响应和更长的无进展生存期（PFS）相关。IMbrave150 3期队列中阿替利珠单抗+贝伐单抗组的全基因组DEG和GSEA分析同样得到了证实。几种关键的肝脏代谢途径，包括胆汁酸、异源物质和脂肪酸代谢，与治疗抵抗有关（图2b）。

为了进一步确认全基因组DEG、GSEA和xCell分析中鉴定的分子特征、生物学通路和免疫亚群的临床相关性，作者从DEG分析中获得了由前十个基因组成的联合治疗反应特征（ABRS）。以及一组代表这些通路/关键免疫子集的分子特征，并进行了进一步分析以评估它们与临床结果的关联。发现ABRS以及与ICIs临床反应相关的免疫特征，包括CD274（PD-L1）或Teff特征（CXCL9、PRF1和GZMB）的表达，在敏感组患者中始终较高（图2c）。这些标志物高表达的患者比低表达患者具有更长的PFS（图2d）。这些候选生物标志物与不同治疗存活率的关联在随机IMbrave150 3期队列中得到进一步验证。包括已知预后因素在内的多变量分析证实，ABRS、CD274或Teff特征高表达的患者PFS有所改善。但是，当阿替利珠单抗+贝伐单抗组与索拉非尼治疗进行对照时，发现患者这些生物标志物的低表达在PFS方面没有显著差异。与索拉非尼相比，ABRS、CD274或Teff特征表达较低的患者在OS中显示出有利的HR，但是这些差异不太稳健，95% CI重叠且P值不显著（图2e）。

图2. 对阿替利珠单抗联合贝伐单抗治疗临床反应的分子相关性

2.  临床响应分子相关性的原位验证

除了使用随机IMbrave150 3期研究进行数据层面的独立验证外，作者还对基因组学结果进行了原位验证。对于回顾性探索性分析，作者通过免疫组织化学方法（IHC）评估了GO30140中180名患者，以及IMbrave150中199名患者的PD-L1蛋白表达。从GO30140 armA研究中，作者之前报告无论PD-L1状态如何，都观察到了临床变化。然而，随着PD-L1免疫细胞/肿瘤细胞（IC/TC）评分≥1%、5%或10%的临界值增加，ORR似乎有增加的趋势，但没有达到统计学意义。在IMbrave150中观察到了类似的趋势，表明PD-L1状态与临床结果之间存在潜在关联；然而，这种趋势既不一致也不稳健。

接下来研究了肿瘤微环境（TME）中的其他分子特征及其与临床结果的关联。为此，作者开发了两个五重IHC检测panel以及随附的全载玻片数字病理学算法，分析了来自GO30140 armA队列的61个基线肿瘤样本。其中一个用于评估肿瘤免疫微环境中的基质成分，另一个用于表征T细胞的功能状态。与作者的基因组发现一致，多重IHC分析显示，与无反应者（SD/PD）相比，反应者（CR/PR）在肿瘤区域具有更高密度的浸润CD8+T细胞、CD3+T细胞和GZMB+CD3+T细胞（图3a）。在应答者中也观察到肿瘤和免疫细胞中更高的PD-L1蛋白表达，尽管并不显著（图3a）。多重IHC还显示，应答者在肿瘤细胞表面显示出比无应答者更高的MHC I类表达（图3a）。对于IMbrave150，作者分析了177个基线肿瘤样本中肿瘤浸润CD8+T细胞的密度（图3b）。与索拉非尼相比，具有高密度瘤内CD8+T细胞的患者显示出更长的OS。来自GO30140和IMbrave150研究的原位分析显示，已存在免疫力的患者使用阿替利珠单抗+贝伐单抗联合治疗似乎可以有效改善患者临床结局。

图3.临床反应的分子相关性的原位验证

3.  阿替利珠单抗+贝伐单抗联合治疗耐药的分子相关性

在GO30140 armA研究中，作者从全基因组DEG分析中发现了与阿替利珠单抗+贝伐单抗联合治疗耐药相关的候选生物标志物。其中，HES1的高表达是一个公认的NOTCH通路激活的转录靶标，可能与疾病进展和PFS较短的患者相关。然后，作者专注于与联合治疗耐药相关的生物学通路和关键免疫亚群。对来自随机IMbrave150研究的177个基线肿瘤组织的转录组数据的特征分析显示，与索拉非尼相比，阿替利珠单抗+贝伐单抗与索拉非尼组中Treg/Teff特征的低比率与PFS和OS改善相关，而高比例的Treg/Teff特征在两个治疗组中PFS无差异（图4a）。此外，由于甲胎蛋白（AFP）和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）代表了两种最成熟的HCC特异性生物标志物，尤其是AFP在之前的临床研究中已被证明对抗VEGFR2治疗具有预测作用，作者评估了这些生物标志物的表达水平与IMbrave150研究中的临床结果的关系。有趣的是，作者发现对于GPC3和AFP的高表达人群，与索拉非尼相比，进行阿替利珠单抗+贝伐单抗治疗，治疗效果较差。虽然在这些标志物低表达的患者中，联合治疗相比于与索拉非尼单纯治疗，有更长的PFS，但在这些基因高表达的患者中PFS无差异（图4b，c）。值得注意的是，这些生物标志物高表达的患者在OS方面仍表现出有利的HR；但是，在生物标志物低表达的人群中观察到了更大的OS治疗益处。综上所述，对于AFP和GPC3低表达人群，进行联合治疗可能会获得比单纯治疗更有益的临床结局。

图4. 阿替利珠单抗+贝伐单抗联合治疗耐药的分子相关性

4.  肿瘤突变与临床结果的相关性

在其他几种癌症类型中，肿瘤突变负荷（TMB）和新抗原负荷与ICI治疗改善临床结果有关。然而，TMB或新抗原负荷对于晚期HCC患者对免疫治疗反应的影响仍缺乏特征。为了研究TMB是否与晚期HCC中对联合治疗临床反应相关，作者对GO30140 A组中的76个患者匹配的基线肿瘤血液样本和IMbrave150中的130个基线肿瘤进行了全外显子组测序（WES）或FoundationOne panel的分析。在GO30140 A组中，独立审查机构（IRF）评估结果显示：相比于低（35%）或中等（17%）TMB患者，高TMB患者的ORR（56%）更高（图5a）。然而，与具有低或中等TMB的患者相比，具有高TMB的患者仅表现出较长PFS的非显著趋势（图5b）。在IMbrave150中，阿替利珠单抗+贝伐单抗组的TMB与缓解率或生存获益之间没有明显关联（图5a）。索拉非尼组中TMB高的患者的反应率（8.3%）低于TMB低（17%）或中等（22%）的患者（图5a）。

Mbrave150 HCC患者的突变情况证实了HCC中常见的疾病相关体细胞突变，包括TERT启动子突变（56.2%）和CTNNB1（37.7%）、TP53（36.2%）、ARID1A（19.2%）、RB1（12.3%）和MYC基因扩增（15.4%）（图5c）。其中，CTNNB1和TERT启动子的突变状态与临床结果存在潜在关联（图5d）。野生型CTNNB1的患者，联合治疗相较于索拉非尼单纯治疗，显示出更好的治疗效果，而突变型患者的受益程度没有这么强（图5d）。另一方面，在TERT突变型肿瘤患者中，联合治疗的益处比在TERT野生型肿瘤患者中更明显（图5e）。值得注意的是，在这些基因的突变状态和关键转录组生物标志物之间没有发现显著关联。由于这些分析中的样本量有限，有必要进一步验证。

图5. 肿瘤突变与临床结果的相关性

5.  阿替利珠单抗+贝伐单抗vs阿替利珠单抗结果的分子相关性

GO30140 F组是一个随机队列，比较了联合治疗与阿替利珠单抗单药治疗（图1）。因此，该组的生物标志物分析旨在进一步探究阿替利珠单抗+贝伐单抗的潜在作用机制（MOA），特别是关于抗VEGF如何潜在地增强抗PD-L1的抗肿瘤活性。对联合治疗组的44名患者和阿替利珠单抗单药治疗组的47名患者的基线肿瘤组织进行转录组分析。尽管两组之间的全基因组DEG和GSEA分析没有发现与临床结果差异相关的任何单个基因或生物学通路，但xCell反卷积分析确定了几个免疫亚群，包括CD8+T细胞、Tregs和巨噬细胞，与联合治疗获得的额外临床益处相关（图6a）。探究Teff、Treg的特征基因表达，包括CCR8、BATF、CTSC、TNFRSF4、FOXP3、TNFRSF18、IKZF2、IL2RA，以及骨髓炎症相关基因：CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL8、IL6、PTGS1，作者进一步证实这些特征的表达与联合治疗相较于单纯免疫治疗对PFS的改善密切相关（图6b-d）。总之，这些数据表明，靶向骨髓细胞炎症可能是不同肿瘤类型中抗VEGF的共同机制。因为贝伐单抗靶向VEGFA-VEGFR2信号轴，作者还评估了与结果相关的VEGFA和VEGF受体2（KDR）的基因表达。发现KDR（图6e）而非VEGFA的高表达也与增加的贝伐单抗获益相关，这支持了抗VEGF可能通过抑制肿瘤血管生成增强抗PD-L1的抗肿瘤活性的假设。

为了进一步验证这些关于抗VEGF如何提高阿替利珠单抗+贝伐单抗疗效的机制假设，作者评估了14名患者匹配的治疗前和治疗后肿瘤活检中KDR和Treg特征表达水平的动态变化。无论临床反应如何，联合治疗后KDR表达普遍下降，而在接受阿替利珠单抗单药治疗的患者中未观察到这种现象（图6f）。对于Treg标记，作者观察到阿替利珠单抗单药治疗和阿替利珠单抗+贝伐单抗联合治疗均导致了Treg标记表达的降低。然而，在联合治疗组中，观察到5名应答者（CR/PR）中有4名Treg基因特征水平降低，但6名无应答者（SD/PD）中只有2名Treg基因特征水平降低（图6f）。关于治疗前和治疗后肿瘤组织之间骨髓炎症特征表达的变化，没有观察到一致的趋势。

最后，作者评估了F组血管密度与临床结果的关联。对来自F组的86个基线肿瘤进行了多重IHC panel 1分析。通过CD31染色评估血管密度，并通过数字病理学量化为每平方毫米肿瘤区域的血管数量。与抗VEGF在脉管系统正常化和抑制肿瘤血管生成中的公认作用一致，发现基线肿瘤中的高血管密度与联合治疗相较于阿替利珠单抗单药治疗的PFS改善显著正相关（图6f）。

总之，作者的GO30140 F组生物标志物分析结果提供了新的机制见解和临床证据，表明抗VEGF可能通过靶向VEGF介导的血管生成、Treg增殖和骨髓细胞炎症来增强抗肿瘤免疫和增强抗PD-L1免疫治疗。

图6. 预测指标未能准确预测的患者肿瘤特征

讨论

血管生成和免疫逃避是相互依赖的过程，通常并行发生，并且可以被肿瘤细胞劫持以促进肿瘤的发展和进展。来自TME内血管和免疫细胞之间动态相互作用的临床前研究为针对肿瘤血管生成和免疫逃避的联合免疫疗法提供了理论基础。在临床上，抗血管生成疗法与ICI的联合治疗已在转移性非鳞状NSCLC、晚期RCC、子宫内膜癌以及不可切除的HCC的治疗中取得重大突破。该研究通过整合参与GO30140 1b期或IMbrave150 3期试验的HCC患者的358例基线肿瘤的转录组、遗传、原位多重IHC和数字病理学，确定了预测抗PD-L1和抗VEGF联合治疗的反应和耐药性的潜在候选生物标志物。

基线肿瘤组织中预先存在的免疫状态很可能推动了联合治疗在晚期HCC中的临床活性。PD-L1和CD8 IHC的进一步开发和优化，和/或基于Teff基因表达特征的诊断或富集策略，可能有助于预测无法切除的HCC初治患者对联合治疗的临床反应。尽管TMB与其他几种肿瘤类型的ICI临床结果改善有关，但在HCC中未发现TMB与PD-1单药治疗之间存在关联。该研究结果发现TMB与联合治疗的临床结果之间没有密切关联。另一方面，与索拉非尼相比，具有TERT启动子突变的患者使用联合治疗的临床结果似乎有更多的改善，而CTNNB1突变的患者使用临床益处改善较少。这些结果似乎是由不同治疗组中这些基因的突变状态之间的不同临床活动驱动的。更具体地说，在阿替利珠单抗+贝伐单抗组中，TERT启动子突变的患者比野生型患者的PFS和OS改善更多，而TERT启动子的突变状态似乎不影响索拉非尼组的结果。相比之下，CTNNB1突变状态在联合治疗组中没有显示出预后影响，而在索拉非尼组中，CTNNB1突变患者的PFS和OS似乎比CTNNB1野生型患者更长。索拉非尼治疗已被证明可减少HCC细胞系中的Wnt信号传导和β-连环蛋白，并在CTNNB1激活的异种移植小鼠模型中减少肿瘤体积并增加存活率。最近的一项临床前研究还表明，β-catenin活性HCC细胞比β-catenin野生型细胞对索拉非尼更敏感。WNT/β-连环蛋白信号改变的激活与HCC和黑色素瘤中的免疫沙漠景观、免疫排斥和对免疫疗法的抗性有关。这些结果表明贝伐单抗等抗VEGF药物可能能够克服WNT/β-连环蛋白信号介导的对ICI的耐药性。

最后，作者的研究提供了关于抗VEGF如何增强免疫治疗抗肿瘤免疫的机制探究。除了VEGF信号在促进肿瘤血管生成中的公认作用外，多种VEGF介导的免疫抑制临床前假设已被提出，包括：（1）通过抑制DC成熟而损害T细胞启动；（2）增加T细胞耗竭和降低效应T细胞的功能；（3）促进肿瘤相关巨噬细胞向更具免疫抑制表型的极化；（4）促进Treg浸润和增殖。然而，据作者所知，这些临床前假设都没有在临床研究中进行系统评估，以提供MOA的临床证据。通过在GO30140 F组队列中整合转录组和原位数字病理学分析，作者的研究提供了临床证据。这些临床发现通过免疫原性HCC小鼠模型中的体内功效和MOA研究得到进一步证实。特别是，抗VEGF似乎与抗PD-L1协同增加常规树突状细胞和CD8+T细胞的数量，可能是通过抗VEGF在减少肿瘤和肿瘤周围区域的血管数量、减少单核细胞的作用衍生巨噬细胞和抑制增殖的Tregs。作者的研究结果支持关于抗VEGF作用的三个关键MOA假设：（1）抑制肿瘤血管生成，（2）抑制VEGF介导的Treg增殖和（3）抑制骨髓细胞炎症。

结语

阿替利珠单抗和贝伐单抗联合治疗已成为不可切除肝细胞癌患者的新治疗标准。然而，潜在的预测性生物标志物以及反应和耐药机制仍然不太清楚。

该研究报告了对GO30140 1b期或IMbrave150 3期试验的358名肝细胞癌患者的肿瘤样本的综合分子分析，这些患者接受阿替利珠单抗联合贝伐单抗、阿替利珠单抗单药或索拉非尼（多激酶抑制剂）治疗。预先存在的免疫环境（CD274的高表达、T效应特征和肿瘤内CD8+ T细胞密度）与联合使用时更好的临床结果相关。降低的临床益处与高调节性T细胞（Treg）与效应T细胞（Teff）的比率和癌胚基因（GPC3、AFP）的表达有关。

与单独使用阿替利珠单抗相比，联合治疗的改善结果与VEGF受体2（KDR）、Tregs和骨髓炎症特征的高表达有关。这些发现通过分析成对的治疗前和治疗后活检、原位分析和体内小鼠模型得到进一步验证。

作者的研究确定了联合治疗的关键分子相关性，并强调抗VEGF可能通过靶向血管生成、Treg增殖和骨髓细胞炎症与抗PD-L1协同作用。

END 

参考文献：   [1]  Zhu, A.X., Abbas, A.R., de Galarreta, M.R. et al. Molecular correlates of clinical response and resistance to atezolizumab in combination with bevacizumab in advanced hepatocellular carcinoma. Nat Med 28, 1599–1611 （2022）. https://doi.org/10.1038/s41591-022-01868-2  

撰写丨Lulu  

编辑、排版丨SX