快报｜基于QFT-TB上清的生物标志物在活动性结核病诊断中的作用研究

作者：周俞，张富杰，施涵璐，吴培豪，周永列

第一作者及单位：周俞，浙江省人民医院检验科检验医学中心(杭州医学院附属人民医院)

通讯作者及单位：周永列，浙江省人民医院检验科检验医学中心(杭州医学院附属人民医院)

Host biomarkers other than interferon gamma in QFT-TB supernatants for

identifying active tuberculosis 

Yu Zhou,Fujie Zhang, Hanlu Shi, Peihao Wu, Yonglie Zhou **

Tuberculosis (Edinb),2022,136:102256.

doi: 10.1016/j.tube.2022.102256.

研究背景

目前，活动性结核病（ATB）的诊断在某些情况下仍然存在困难。结核菌素皮肤试验（TST）和γ干扰素释放试验（IGRA）是结核分枝杆菌潜伏感染（LTBI）的主要诊断工具。与TST相比，IGRA具有更高的特异度，但两者都不能准确区分ATB和LTBI，严重延误了ATB患者的诊断和治疗。目前，已有不少研究探讨了新型结核病特异性生物标志物在鉴别诊断ATB和LTBI中的性能。其中细胞因子（如IL-2）、趋化因子（如IP-10）等均被认为是鉴别ATB和LTBI的潜在指标，但由于实验设计和研究人群等的差异，不少结论尚需进一步验证。QuantiFERON®-TB（QFT-TB）是广泛应用于临床的IGRA。由于QFT-TB上清液中IFN-γ水平对区分ATB和LTBI具有局限性，且有不少用于ATB诊断的候选生物标志物有待进一步验证，我们拟通过BD Cytometric Bead Array（CBA）技术对QFT-TB上清液中的细胞因子/趋化因子（IL-2、IP-10、MCP-1和RANTES等）进行联合检测来区分不同结核感染状态的个体。该项研究可以作为QFT-TB试验的补充，并可能成为临床诊断ATB有用的检测工具。

研究方法

1．研究对象   

本研究于2020—2021年期间，在浙江省人民医院招募受试者，结合临床和实验室评估，所有研究对象被分为以下四类：（1）ATB，经抗酸染色阳性或（和）培养阳性或（和）分子检测阳性，有相关临床症状和影像学表现；（2）LTBI，QFT-TB阳性，无ATB临床症状和影像学证据；（3）其他肺部相关疾病（ORD），QFT-TB阴性，存在其他呼吸道疾病但抗酸染色阴性；（4）健康对照（HC），QFT-TB结果阴性、无肺部疾病的健康人群。本研究排除了接受抗结核治疗的ATB患者，以及HIV阳性、免疫缺陷和非肺部恶性肿瘤的患者。 

2. QFT-TB检测

QFT-TB检测根据制造商的说明进行（Wantai, Beijing, China）。收集所有受试者的外周血样本，分为三管进行培养：（1）阴性对照管（空白管）；（2）MTB特异性抗原刺激管（测试管）；（3）含PHA的阳性对照管（PHA管）。采用万泰Caris 200自动免疫分析仪检测IFN-γ水平。剩余的上清液储存在-80℃环境下进行下一步实验。  

3. 细胞因子和趋化因子检测 

采用BD Cytometric Bead Array（CBA）检测QFT-TB上清液中细胞因子/趋化因子（IL-2、IP-10、MCP-1和RANTES）。概括而言，将捕获磁珠添加到每个含有待测样品的试管中，室温孵育后，用PE标记的检测抗体孵育。用流式细胞仪设置珠对流式细胞仪进行校准后采集标本，同时建立相应的标准曲线。数据分析采用FCAP Array v3.0。TB-Ag刺激的细胞因子/趋化因子值采用背景扣除法（测试管减去空白管）计算。

研究结果

1. 纳入人群的基本特征   

该项研究最终共纳入128名受试者，其中ATB39例，LTBI34例，ORD22例，HC33例。具体临床和人口统计学特征如表1所示。各组人群年龄、性别比较差异均无统计学意义。在ATB组中，超60%的患者MTB培养和（或）分子检测阳性，92.31%的患者QFT-TB阳性。由于QFT-TB定义了LTBI，所有LTBI个体均QFT-TB阳性。ATB组与LTBI组间QFT-TB阳性率差异无统计学意义。肺结核是ATB组的主要疾病类型，其次是结核性胸膜炎。由于一些细胞因子和趋化因子在非结核呼吸道疾病中也升高，因此本研究也对ORD组进行了研究，其中，肺癌和肺炎占一半。

2. 不同组间细胞因子/趋化因子基线水平的比较 

我们首先在QFT-TB空白管中进行了IL-2、IP-10、MCP-1和RANTES的基线水平分析（图1）。结果发现，未受刺激的IL-2浓度在大多数参与者中极低。与LTBI相比，ATB患者RANTES基线水平较低（  P=0.005），但IP-10水平较高（  P=0.02）。ATB组IL-2（   P=0.006）和IP-10（  P=0.01）表达显著高于HC组，ORD组RANTES基线浓度则显著低于LTBI组（  P=0.003）。然而，MCP-1的基线水平在各组间差异无统计学意义。 

3. 各组间TB-Ag反应性细胞因子/趋化因子水平的比较   

为了进一步探索这四种免疫指标在TB特异性免疫应答中的潜在价值，我们将TB-Ag刺激管中的细胞因子/趋化因子水平减去空白管作为TB特异性应答的细胞因子/趋化因子浓度。所有免疫指标在ATB组中的浓度均显著高于LTBI组、ORD组和HC组（ P值均<0.01）。对于LTBI人群，其IP-10（ P=0.003）、MCP-1（ P=0.048）和RANTES（ P=0.002）水平均显著高于ORD组；结核反应性IL-2（ P<0.001）、IP-10（  P<0.001）和MCP-1（  P=0.04）显著高于HC组（图2）。

4. TB反应性细胞因子/趋化因子在ATB诊断中的性能 

鉴于ATB患者的各项免疫指标在TB-Ag刺激后均显著增高，我们绘制了ROC曲线来评估这些指标在ATB诊断中的性能（图3）。值得注意的是，在ATB和LTBI的鉴别诊断中，单一细胞因子/趋化因子的AUC值分布在IP-10的0.71和IL-2的0.76之间，高于QFT-TB试验中IFN-γ的0.59。此外，IP-10和QFT-TB试验在鉴别ATB和非TB感染（包括ORD和HC组）方面均具有良好的诊断效能（AUC＞0.95）。除了用于定义LTBI组的QFT-TB结果，IP-10在LTBI与非TB感染的鉴别诊断中AUC值最大（0.83）。在TB感染（包括ATB组和LTBI组）与非TB感染的鉴别诊断比较中，我们发现QFT-TB的AUC值最高（0.99），其次是IP-10（0.90）和IL-2（0.86）。 

5. 鉴别ATB和LTBI的诊断模型 

为了进一步提高免疫指标鉴别ATB和LTBI的能力，我们随后采用多因素logistic回归建立了鉴别ATB和LTBI的诊断模型。令人意外的是，模型最终选取了两个免疫指标，而未纳入QFT-TB结果中的IFN-γ：P= 1/[1+e-(0.007*IL-2+0.001*RANTES-0.991)]，P，预测值；e，自然对数。Hosmer-lemeshow检验的P值为0.42（ P>0.05），表明模型具有良好的拟合效果。ROC曲线的AUC为0.80（0.69～0.90），优于QFT-TB上清液中单个细胞因子/趋化因子和IFN-γ的AUC（表2）。当诊断模型的cut-off值为0.58时，其敏感度、特异度、PPV、NPV、PLR、NLR分别为72.41%（95%  CI ：52.51 %～86.55 %）、91.18%（95% CI ：75.19       %～97.69 %）、87.50%（95% CI ：66.54 %～96.71%）、79.49%（95%  CI ：63.06 %～90.13%）、8.21（95%CI ：2.72～24.74）、0.30（95% CI ：0.17～0.48）。   

研究结论

1. QFT-TB上清液中的细胞因子/趋化因子谱可以很好地区分ATB和非结核感染。

2. 上述所测细胞因子/趋化因子指标都比IFN-γ更能区分ATB和LTBI，其中IL-2的鉴别诊断效能最佳。

3. 包含TB特异性IL-2和RANTES的诊断模型可以显著提高ATB和LTBI的鉴别诊断效能。

本研究利用QFT-TB上清液进行细胞因子和趋化因子的联合检测，为ATB的诊断提供了一种简便的补充手段，具有良好的临床应用前景。

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供稿：周   俞

编辑：王   然   

审校：郭   萌

发布日期：2022-10-12

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