硬核知识点！蛋白药细胞培养经验总结

前言

哺乳动物细胞培养技术已成为21世纪生物制药企业立足全球制药界所必须掌握的核心技术。细胞培养工艺的稳健性是保证重组蛋白药物质量可控的基础，开发出高产稳健并易于放大的细胞培养工艺是生物制药企业面临的重要研究课题。本文旨在讨论细胞培养关键工艺参数的控制策略，为同行提供参考。

对于重组蛋白药物的细胞培养生产工艺，通常由四个步骤组成，分别为：种子复苏、摇瓶阶段种子扩增、反应器阶段种子扩增、反应器生产，如图1所示。以下分别对各步骤相关培养工艺参数的控制策略进行阐述。

图一：细胞培养工艺流程图

01步骤一：MCB/WCB复苏

原液生产的启动始于细胞复苏，细胞复苏条件显著影响细胞生长和细胞活率恢复的时间。在细胞复苏阶段的关键工艺控制参数主要为：复苏培养基、解冻时间、解冻温度。

复苏培养基是决定细胞复苏成功与否的重要因素。不同的培养基对细胞生长的影响较大，根据细胞类型选择或者筛选不同厂商的培养基以确定针对特定项目的复苏培养基。基于先验知识，针对CHO-K1细胞采用公司平台的复苏培养基均能满足细胞生长的需求，故通常不对细胞复苏培养进行筛选和优化。

解冻时间影响复苏后的细胞活率恢复状态。通常细胞冻存液中含有8~15%的二甲基亚砜（DMSO）做为冻存保护剂，其主要作用机理是DMSO在低温下能够稳定细胞膜，防止快速低温形成的冰晶对细胞的损伤。但DMSO对细胞也有较大的毒性作用，细胞复苏时间过长会严重损伤细胞，导致细胞生长缓慢或者细胞坏死。基于先验知识，一般细胞复苏时间控制在3分钟以内对细胞活率无显著影响，鉴于复苏时间容易控制，故将通常不对复苏时间进行单独研究。

解冻温度将影响复苏时间和细胞活率。解冻温度越低，细胞复苏时间越长，二甲基亚砜对细胞产生毒性作用越大，解冻温度越高可能会对细胞活率产生不利影响。在细胞复苏时，通常水浴锅的温度设定在37℃，在此温度下能保证细胞解冻时间小于3分钟并且对细胞活率无负面影响。故通常采用平台经验将解冻温度设定在37℃，不对其进行优化研究。

02步骤二：摇瓶阶段种子扩增

摇瓶阶段种子体积逐渐扩增过程是生产反应器种子链设计的重要组成部分，在此阶段关键工艺控制参数主要为：培养基、接种密度、培养时间、摇床参数。

种子培养基是决定细胞能否正常生长的重要因素。针对不同的细胞株通常需要筛选合适的培养基，通常基于种子的比生长速率和细胞活率的维持情况来评价种子培养基的优劣，但同时需考虑种子培养基的生产的稳健性和成本。

接种密度将影响细胞生长速率和培养周期。在研发阶段对细胞生长曲线、传代密度和培养时间进行研究，以定义种子链设计中接种活细胞密度的范围。

培养时间将影响转种活细胞密度。通常最佳的转种活细胞密度在细胞对数生长前中期，此时种子生长处于旺盛状态，在此阶段进行接种有助于细胞快速适应接种后的培养环境，在研发阶段应对细胞生长曲线进行研究，以确定转种细胞密度的上限，从而确定培养时间。

摇床参数精确控制是保证细胞正常生长的重要保障。摇床参数例如培养温度、搅拌转速、二氧化碳水平、湿度等均应控制的合适的范围内。基于先验知识，针对哺乳动物细胞培养在种子阶段通常将培养温度设定在36.5℃~37℃，细胞在此温度下生长较快，活率维持较好。搅拌转速会影响溶液的传质效果和对细胞产生剪切力，较高的搅拌转速其传质效果越好，通同时其剪切力对细胞的损伤也越大，经验表明，振幅为50mm的摇床，其搅拌转速设定在100~130 rpm，在此范围内剪切力对细胞生长的影响较小，并且通常能达到满意的物料混合效果。摇床二氧化碳水平在维持培养液pH方面起重要作用，二氧化碳的设定值通常在5%~10%之间。摇床湿度控制也是维持细胞正常生长的必要条件，湿度控制能降低摇瓶培养液挥发承担，减少挥发对细胞生长的影响，通常将湿度控制在60%~80%的范围内。

03步骤三：反应器阶段种子扩增

反应器阶段种子扩增是连接摇瓶种子和生产反应器的重要步骤，其目的是生长足够的可用于生产反应器接种的种子。在此阶段关键工艺控制参数主要为：培养基、接种密度、培养时间、反应器参数。

培养基可能与摇瓶接种种子扩增培养基有所不同，在此阶段，一方面为了减少筛选压力的残留和降低成本，通常在生产反应器接种前1~3代在培养基中去除筛选压力。另一方面为了降低在接种时种子培养基和生产培养基比例的波动，通常在生产反应器接种前1~3代采用生产培养基进行种子扩增。

接种密度范围的确定需要开展详细的研究，在IND申报阶段的培养工艺基于时间和成本的考虑，针对接种密度的研究可在摇瓶中进行，但培养基需与未来商业化生长种子反应器保持一致。后期在工艺表征（PC）研究中需要建立反应器缩小模型，采用确认缩小模型的反应对初始接种密度的范围进行研究，以具有代表意义。

培养时间的确定同接种密度研究一样，IND申报阶段可采用摇瓶规模进行研究，在药物研发的后期对培养时间单独开展详细的种子链工艺表征研究。

反应器参数将影响细胞生长状态，在IND申报阶段，通常基于经验采用平台的反应工艺参数进行培养。通常pH控制在6.7~7.3的范围内，温度设定在37℃，DO控制在20%以上。搅拌转速的设定根据反应器品牌不同而有所差异，通常从两个方面来考虑搅拌转速设定合理性，一是溶液的混合效果和界面传质情况，二是高搅拌转速所产生的剪切力对细胞的损伤。

04步骤四：反应器生产

采用生产反应器进行细胞培养是生产原液的重要步骤。目前业界针对重组蛋白的生产通常采用Fed-batch培养模式，培养周期为10~17天（通常为14天），对于此工艺主要的控制参数为：培养基、接种密度、搅拌转速、培养温度、降温策略、pH控制、通气控制、葡萄糖控制。

培养基对细胞培养性能的影响较大，不同培养基条件下，细胞生长、代谢、产物表达和产物质量可能会表现较大的差异。在研发阶段应对不同性能的基础培养基和补料培养基进行筛选和研究，根据关键质量属性和工艺属性确定适合于特定项目的培养基，并对补料策略（包含补料量和补料时间）进行研究，以确定合适的补料策略。

接种密度将影响活细胞到达峰值的时间，通常接种密度越高，细胞密度到达峰值的时间越短，假如细胞活率与低接种密度条件维持一致，则在相同的培养周期内会得到较高的产量。接种密度还会影响补料策略、降温时间，故在研发阶段应对接种密度进行充分的研究，以确定合适的接种密度，既保证操作的可实现性，同时也保证工艺具有较高的产量。

搅拌转速主要影响培养液的混合效果和细胞生长状态，高的搅拌转速条件下，细胞混合效果较好，微观均一性较高，但同时高搅拌转速产生较大的剪切力不利于细胞生长和细胞活率的维持。为了避免细胞因剪切力带来的损伤，通常在培养液中添加表面活性剂，例如P188。大量的实践证明，在培养基中添加表明活性剂后细胞可耐受较高的剪切力，因此在IND阶段通常不对搅拌转速进行单独研究，常采用平台的搅拌转速进行控制。

培养温度通常被定义为关键工艺参数（KPP），在Fed-batch培养模式中，通常在培养前期为了满足细胞快速生长故较高的温度（例如37.0℃），在培养中后期为了维持细胞活率和提高产量采用降温培养（例如31~34℃）。据报道，降温有助于提高目的蛋白mRNA的稳定性，提高翻译水平，进而提高蛋白比生产速率。鉴于培养温度不但影响细胞培养性能，而且还可能影响关键质量属性（CQA），故针对降温温度的确定，需要对其进行详细研究，以确定满足该项目产量和质量的需求。

降温策略将影响细胞表达量和细胞活率，通常有两种降温手段来实现降温控制，一是确定降温时间，二是确定降温活细胞密度。通常确定降温活细胞密度的范围是研发阶段研究的重点，其原因是根据密度降温更能保持批间一致性，但当降温密度确定之后，可根据多批次的数据总结降低时间点，提升操作的简便性。

pH控制将影重组蛋白质量属性，例如电荷异质体和糖型异质体等，故pH控制的研究是研发阶段应该考虑的重点。通常适用于细胞生长的pH范围为6.7~7.4之间，据报道，低pH能抑制乳酸和蛋白酸性异质体的形成，故需要对pH控制进行研究以确定合适的pH控制策略。

通气控制在培养后期是移除二氧化碳的重要手段，尤其在大规模反应器中，由于反应器的页面高使二氧化碳的移除较为困难，导致培养液中二氧化碳的分压较高，严重影响细胞培养性能和蛋白质量属性，为了降低二氧化碳的积累，通常在培养后期通过增加底部通气的方式来实现。

葡萄糖控制能显著影响细胞培养性能，葡萄糖是哺乳动物细胞生长和维持的重要碳源，但高浓度的葡萄糖将会促进细胞快速生产乳酸，大量的乳酸积累将对细胞生长和细胞活率的维持产生不利影响。另一方面低浓度的葡萄糖将会影响糖型的分布，通常针对生产重组蛋白的CHO细胞，葡萄糖浓度控制在大于1 g/L以上。

小结

上游细胞培养工艺优化永无止境，建议企业应基于时间和成本的评估，综合选择合适的生产工艺（或是平台工艺）进行原液生成来满足IND申报的需要，在后期工艺表征（PC）研究中，再根据实验设计结果总结和相关设备的控制能力来确定种子链和生产反应器的工艺参数的可操作空间，确保在操作空间内的变动不影响细胞培养性能和关键质量属性，从而实现细胞培养工艺的可持续性和稳健性。

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