系统回顾TCR-T细胞抗癌试验的涌现

前言

T细胞受体工程化T细胞疗法（TCR-T）和嵌合抗原受体T细胞疗法（CAR-T）是两种过继性T细胞疗法，它们通过基因改造天然T细胞来治疗癌症。虽然CAR-T疗法对B细胞谱系的血液系统恶性肿瘤产生了显着疗效，但大多数实体瘤未能对CAR-T产生显着反应。另一方面，TCR-T疗法在治疗实体瘤方面显示出前所未有的前景，并引起了越来越多的兴趣。为了为这个快速发展的领域创建一份公正、全面和科学的报告，我们仔细分析了使用TCR-T疗法的所有84项临床试验（于2018年6月11日从ClinicalTrials.gov下载）。在这些临床试验中观察到了信息特征和趋势。每年启动的试验数量都在按预期增加，但观察到一个有趣的模式：NY-ESO-1作为靶向性最强的抗原类型，是31项临床试验的目标；黑色素瘤是最有针对性的癌症类型，是33项临床试验的目标。新抗原和代表性不足的癌症仍有待在未来的研究和临床试验中作为目标。与CAR-T疗法不同，84项临床试验中只有约16%的目标是针对血液系统恶性肿瘤，这与TCR-T疗法对实体瘤的巨大潜力一致。本综述调查了6家拥有新型TCR-T理念和产品的制药/生物技术公司，这些公司采用了多种方法来提高T细胞受体的亲和力和效率，并最大限度地减少交叉反应。同时讨论了由于肿瘤微环境而导致TCR-T疗法发展的主要挑战。

介绍

过继T细胞疗法是一种潜在的强大癌症治疗方法，它对天然T细胞进行基因改造，使其具有肿瘤特异性并提高其破坏肿瘤细胞的能力。转基因T细胞能够表达嵌合抗原受体(CARs)或T细胞受体(TCRs)，在多项临床试验中显示出骄人的结果。嵌合抗原受体通常由3部分组成：包含用于识别特定抗原的胞外域单链片段变体(scFv)、跨膜域和包含CD3ζ链的胞内域，其中包含3个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。嵌合抗原受体-T细胞疗法在对抗血液系统恶性肿瘤方面显示出优异的效果，但相比之下，其对实体瘤的效果并不令人满意。本综述重点关注TCR工程化T(TCR-T)细胞，其对实体瘤显示出比CAR-T细胞更大的前景。本综述阐明了TCR-T细胞治疗的基本机制和TCR靶向的不同类型的肿瘤抗原，然后总结了在ClinicalTrials.gov上收集的有关TCR-T细胞治疗临床试验的信息以及有关开发和试验的技术由几家主要的制药/生物技术公司提供。最后，本综述总结了对该癌症治疗的主要挑战和改进。

TCR的效力取决于它们与肽-主要组织相容性复合物(pMHC)的相互作用，肽与MHC结合形成复合物。细胞内抗原被切割成肽链，并由MHC分子展示形成pMHC。待表达的细胞质蛋白由I类MHC蛋白（其中大部分是有缺陷的核糖体翻译产物）通过蛋白水解被切割成肽链。然后这些肽与I类MHC蛋白结合，这些蛋白在所有有核细胞的细胞表面表达。一些细胞表达II类MHC蛋白，称为抗原呈递细胞(APC)。它们通过内吞作用和将它们切割成肽链以与II类MHC蛋白结合。来自T细胞的T细胞受体，必须与患者的人类白细胞抗原(HLA)等位基因相匹配，识别这些pMHC并杀死癌细胞。（人类I类MHC蛋白从3个基因区域表达：HLA-A、HLA-B和HLA-C，人类II类MHC蛋白也从3个基因区域表达：HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ）

T细胞受体是一种异源二聚体，由2条不同的跨膜多肽链组成：α链和β链，每条链由一个恒定区组成，将链锚定在T细胞表面膜内，以及一个可变区，识别并结合MHCs呈现的抗原。TCR复合物与6个多肽结合，形成2个异源二聚体，CD3γε和CD3δε，以及1个同源二聚体CD3ζ，它们共同形成CD3复合体。CD3复合体总共包含10个ITAMs，这些 ITAMs 参与 T 细胞激活。CAR-T细胞和TCR-T细胞的不同结构如图1所示。额外的共刺激信号对于T细胞功能的完全执行也必不可少，包括细胞毒性T细胞表面的CD8，它与I类MHC复合物结合，辅助T细胞表面的CD4与II类MHC复合物结合。还有其他经过充分研究的共刺激分子，包括CD28：参与APC上的B7和4-1BB（CD137），与 APC 表面的配体结合时，上调抗凋亡因子以促进T细胞存活。共抑制分子：如细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）和程序性细胞死亡蛋白1（PD-1），也是负责消除T细胞信号的T细胞系统的一部分。

图1. CAR-T和TCR-T细胞疗法示意图

通常仅针对细胞表面蛋白的CAR-T细胞已经有4代，此处显示的是最新一代。所有代的CAR-T细胞都包含一个scFv，由抗体的可变轻(VL)和可变重(VH)链、跨膜结构域和带有ITAM的CD3ζ链组成，用于激活T细胞。第四代CAR还包括一个共刺激分子(CM1)，例如CD28和B7，以及一个用于增强T细胞效应的白细胞介素-12(IL-12)结构域。T细胞受体工程化的T细胞具有1个TCR，由α链和β链，每个都包含一个可变域(v)和一个恒定域(c)，以及一个未标记的跨膜域和6个用于T细胞激活的CD3链。I类MHC蛋白由一条α链组成，具有3个结构域α1、α2、α3和β2-微球蛋白，呈递源自细胞内蛋白质的蛋白水解的肽。

另一方面，嵌合抗原受体采用抗体-抗原识别机制，该机制由源自抗体的scFv组成，以便与靶细胞表面的抗原结合，与跨膜域和共刺激域一起激活免疫反应。然而大多数蛋白质，它们在细胞内表达而不是在细胞表面表达（只有约28%在细胞表面表达），这使得它们无法作为CAR的抗原。因此，CAR可靶向的抗原种类往往有限；此外，细胞表面抗原的密度因细胞而异。传统上，通常认为CAR比TCR具有更高的亲和力。然而，根据最近的一项研究，通过比较单链TCR（Vβ-linker-Vα）、作为CAR样受体的scFv类似物以及具有相同KD的CAR的亲和力，已经表明全长TCR的敏感性高于即使CAR以更高密度表达且不存在CD8辅助受体（这可以将所需的TCR亲和力降低大约100倍，并将每个靶细胞所需的pMHC量从30多个分子减少到仅1个分子）。这种更高的敏感性可以实现在多项临床试验中观察到，更快速地破坏肿瘤细胞但也增加了“on-target, off-tumor”毒性的风险。有趣的是，尽管TCR比CAR的敏感性更高，但发现 TCR 可以调解细胞因子的释放量较小。因此，与CAR-T细胞疗法相比，TCR-T细胞疗法可能降低细胞因子释放综合征的风险。虽然CAR-T细胞在抗血液学癌症方面显示出有希望的结果，但它们对实体瘤治疗的疗效却不太明显，这可能是由于实体瘤的免疫抑制微环境，这将在后面的部分中讨论，以及以足够的密度水平存在的癌症抗原可以在没有“on-target, off-tumor”毒性的情况下进行靶向。另一方面，T细胞受体工程化的T细胞在治疗两种实体瘤方面都取得了一些成功，例如作为转移性黑色素瘤和血液癌，可能是因为后者由于肿瘤表面存在的拷贝数少而具有更高的穿透力，而CAR-T抗原的拷贝数量众多。

TCR-T疗法利用保留这些复合物的T细胞的修饰来特异性靶向特定肿瘤细胞表达的抗原。

TCR-T细胞治疗中使用的抗原类型

在实践中，有多种方法可以对TCR-T细胞治疗中靶向的肿瘤抗原进行分类。通常，人类肿瘤抗原分为两种主要类型：共享肿瘤相关抗原（shared TAAs）和独特的肿瘤相关抗原（unique TAAs），或肿瘤特异性抗原。前者包括睾丸癌(CT)抗原、过表达抗原和分化抗原，后者包括新抗原和癌病毒抗原。人乳头瘤病毒(HPV)E6蛋白和HPV E7蛋白属于癌病毒抗原类别。肿瘤抗原的多样性和复杂性往往会导致“on-target, off-tumor”毒性。每种类型的抗原在TCR靶向方面都有其独特的优势，但也有其特定的缺点。

癌症-睾丸抗原在各种肿瘤类型以及睾丸、精子发生期间和胎盘中表达。通常它们在成人组织中是沉默的，但它们在不同的肿瘤类型中具有转录活性。理论上，因为许多肿瘤类型高水平表达CT抗原，而正常组织很少表达，它们被认为是有吸引力且安全的免疫治疗靶点，但在实践中，情况并非总是如此。黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A基因家族是一组CT抗原：MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10和MAGE-A12的表达频率超过1/10000。在NCI MAGE-A3试验中，针对MAGE-A3的TCR意外地与在大脑中表达的相关肽MAGE-A12发生交叉反应，导致前9名患者中有2人死亡，第3名患者出现严重的精神损伤。研究发现人脑可能还表达MAGE-A1、MAGE-A8和MAGE-A9。在Adaptimmune进行的另一项试验中，靶向MAGE-A3的TCR与心脏中一种无关的蛋白肌联蛋白结合。TCR与正常组织之间的这些相互作用表明靶向CT抗原的潜在危险。

分化抗原由以组织特异性方式表达的基因编码。因此，它们在肿瘤细胞和相应起源组织的健康细胞之间共享，与过表达抗原不同，后者在某些（如果不是全部）健康组织类型中表达。大多数此类抗原，包括糖蛋白（gp100）、T细胞和酪氨酸酶识别的黑色素瘤抗原（MART-1），主要存在于黑色素瘤和正常黑色素细胞中。然而，分化抗原确实包括癌胚抗原，通常在结肠癌中高度表达，和其他一些在一些上皮组织和肿瘤中发现，包括前列腺癌，在这种情况下，前列腺特异性抗原被确定为一种分化抗原。靶向此类分化抗原将可能会对关键器官的正常细胞产生“on-target, off-tumor”毒性。针对MART-1蛋白的TCR-T细胞疗法的前2项试验使用了2种不同的蛋白质，受I类MHC限制，但靶向类似表位DMF4和DMF5。尽管在功能测定中，DMF5工程化T细胞被证明比DMF4工程化T细胞更活跃，但使用DMF5 T细胞的扩展试验报告了DMF4 T细胞未报告的对眼睛、耳朵和皮肤的自身免疫毒性。在一项试验中，如毒性包括20名患者中的14名观察到红斑皮疹、20名患者中的11名观察到前葡萄膜炎以及20名患者中的10名观察到听力损失。在3名接受MART-1试验的患者中也观察到致命的心脏毒性。一方面，为了有效消除实体瘤，TCR应该非常有效才能取得任何进展。另一方面，当一种疗法非常有效时，它对低表达水平的组织和那些高表达水平的组织有同样的效果。因此，TCR的效力应控制在精确范围内，以不诱导免疫反应达到一定水平，但在达到阈值后足以杀死肿瘤细胞减少“on-target, off-tumor”的毒性。

过度表达的抗原是在许多正常组织以及不同类型的肿瘤中表达的抗原。它们在肿瘤细胞中以更高的水平表达，以达到T细胞识别的阈值。因为这些抗原也被表达，虽然在较低水平下，但正常组织存在“on-target, off-tumor”毒性的风险。例如，Wilms肿瘤1(WT1)是一种过度表达的抗原，在大多数急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病和几乎所有类型的实体瘤中都表现出高度表达。它也存在于多种关键组织中，例如心脏组织。间皮素是另一种过度表达的抗原，在间皮瘤中高度表达，但也存在于包括气管在内的多种组织的间皮细胞中。尽管人们普遍担心靶向此类抗原会产生“on-target, off-tumor”毒性，但报告表明靶向WT1的T细胞能够区分肿瘤细胞和正常组织。使用鼠类模型，也有人建议增强亲和力靶向WT1抗原的TCR，虽然超过了胸腺选择的阈值，但在转移到野生型小鼠中时没有表现出自身免疫毒性。因此可以推断，WT1和其他过度表达的抗原可能具有攻击肿瘤细胞的能力，但在很大程度上是多余的正常细胞，使其成为TCR-T治疗的理想靶点。

新抗原是由特定于个体肿瘤的随机体细胞突变形成的，并且当肿瘤细胞在不同部位或不同时间从患者身上分离时也会发生变化。因此，瞄准此类抗原可以降低“on-target, off-tumor”毒性，但在实践中是昂贵的。这是因为新抗原的鉴定有时需要对每个个体肿瘤的全基因组进行测序，以鉴定突变基因并选择包含预测由患者HLA等位基因呈递的基序的肽。此外，由于肿瘤异质性，必须对几种新抗原进行测序和靶向同一类型的肿瘤。肿瘤异质性分为某些类型，包括患者间肿瘤异质性、肿瘤内异质性和转移间异质性。它导致免疫疗法的靶标仅针对所有肿瘤细胞的一部分，这会降低此类疗法的功效并增加转移的风险。肿瘤异质性的性质意味着如果需要完全根除肿瘤，则必须靶向新抗原。

由于每种类型的肿瘤抗原的不同特征，不同制药/生物技术公司和研究机构的产品在关注哪个类别方面有不同的选择。

TCR-T细胞治疗临床试验统计

截至2018年6月11日，在ClinicalTrials.gov上发布的包含关键词“TCR”的376项临床试验中，其中84项已被确定采用TCR-T细胞治疗技术通过人工管理。从这84项临床试验中可以揭示某些模式，如图2和图3所示。自6月11日收集数据以来，至7月28日，ClinicalTrials.gov中包含了另外13项试验，其中只有1项与TCR-T相关-细胞疗法（NCT03578406）并针对HPV E6抗原。有关此新试验的信息未包含在图和补充表中。

图2. 84项TCR-T临床试验的主要信息和趋势

(A)图2A是每年开始的临床试验数量（条形图，基于右侧y坐标）和自2004年以来已完成的临床试验数量（折线图，基于左侧y坐标）。(B)图2B是每年已完成或将要完成的临床试验数量。(C)图2C为尚未招募、活跃但未招募、招募、邀请招募、撤回、终止、已完成和状态未知的试验的相应比例。(D)图2D是84项试验中不同临床分期的各自比例。(E)图2E是84次试验中每种类型抗原的比例。

图3. 84个TCR-T临床试验所针对的

每种类型的抗原和癌症的比例

(A)图3A是84项试验中每种特定抗原的比例。(B)在收集到的84项试验中，总共有210种癌症成为目标（许多试验针对一种以上的癌症，并且多种类型的癌症针对一种以上的试验）。图3B是84项试验中每种类型癌症的比例。

首先，如图2A所示，临床试验的开始年份显示出一种特殊的模式。最早的三项TCR-T细胞治疗临床试验始于2004年。此后，从2006年开始，每年启动的临床试验数量呈现出3、4年的周期性波动。以2006年至2013年的8年为例，2006年至2008年，临床试验数量呈稳步上升趋势，2008年达到高峰，2009年呈下降趋势，2010年至2012年呈稳步上升趋势。2013年减少，等等，但从2004年到2018年，临床试验数量总体呈上升趋势。临床试验数量达到另一个高峰，而从长远来看，由于其巨大的潜力，对TCR-T细胞疗法的需求和兴趣有所增加。如图2B所示，这84项临床试验中的28项预计将在2019年和2020年完成。这将是评估TCR-T应用结果优于其他免疫治疗方法的最佳时机。

其次，如图2C所示，这些临床试验（48项临床试验）中约有57%仍在招募，而这些临床试验（20项临床试验）中只有不到1/4被终止或完成。这证明，与CAR-T细胞疗法相比，TCR-T细胞疗法仍然是一个相对较新的研究靶点，表明TCR-T细胞疗法在未来可能具有巨大的潜力。

第三，根据图2D，这些试验（35项试验）中约有42%是针对1期临床试验，而这些试验（28项试验）中约有33%是针对1期和2期临床试验，再次表明大多数的TCR-T临床试验处于开发起步阶段，TCR-T细胞疗法在行业或医院的应用还有很长的路要走。

第四，如图2E和3A所示，84项临床试验（43项试验）所针对的抗原中有一半以上是CT抗原，这43项试验中有31项针对NY-ESO-1（30项试验针对NY-ESO-1，1项试验针对NY-ESO-1&LAGE-1A），可能是因为NY-ESO-1特异性TCR-T细胞在滑膜细胞肉瘤、黑色素瘤和骨髓瘤的治疗潜力方面已经过最彻底的检查和测试。只有3项试验针对新抗原，可能是因为执行测序以及确定每位患者的有效TCR需要大量时间和成本，并且需要对每位患者重复相同的过程。另一方面，如果方法测序和良好的制造过程可以变得更高效和更具成本效益，例如应用机器人系统使测序更快，并使用成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统或睡美人转座子，新抗原可以潜力巨大，而TCR-T产业没有太多竞争。

最后，如图3B所示，最常靶向的癌症类型是黑色素瘤，它是33项试验的目标。这可能是因为黑色素瘤病例的频率很高。2018年，黑色素瘤占美国皮肤癌新发病例的近92%和皮肤癌相关死亡的约69%，58并且黑色素瘤的发病率增长速度高于大多数其他癌症。另一个原因可能是黑色素瘤病变相对容易获得，并且黑色素瘤易于适应组织培养的性质意味着组织样本和细胞系可以随时用于研究目的，从而使黑色素瘤成为临床试验的首选。白血病和胃肠道癌症落为第二，成为24次试验的目标。在84项临床试验中提到的210种癌症中，只有34项试验（约16%）仅关注血液系统恶性肿瘤（白血病：24项试验；骨髓瘤：8项试验；淋巴瘤：1项试验；[未指明]血液系统恶性肿瘤：1项试验），因此这84项临床试验所针对的癌症类型中有84%属于实体瘤类别，这可能是因为CAR-T已经很好地证明了治疗血液系统恶性肿瘤的有效性，而多项研究证明其对实体瘤的影响与TCR-T细胞疗法相比，对实体瘤已被证明是不成功的。然而，由于这些不令人满意的结果，确实有人试图提高CAR-T细胞对实体瘤的性能。65因此，未来CAR-T细胞有可能广泛用于实体瘤治疗。

开发 TCR-T 细胞治疗的

主要制药/生物技术公司

表1列出了本节稍后讨论的几家主要制药/生物技术公司的临床试验。

Adaptimmune（英国牛津郡）修改患者自身的CD4+和CD8+细胞的TCR以表达特定的肽增强亲和力受体(SPEAR)以增加天然TCR的结合亲和力，克服由于在胸腺中的T细胞。特异性肽增强亲和力受体是通过修饰天然TCR的高变互补决定区并选择具有高亲和力和缺乏同种反应性的TCR制成的。Adaptimmune的SPEAR的主要靶标是CT抗原，包括MAGE-A4、MAGE-A10和NY-ESO-1。它还与GlaxoSmithKline葛兰素史克（英国布伦特福德）合作，针对另一种CT抗原黑色素瘤（PRAME）中优先表达的抗原。这些抗原要么没有被加工成肽或在正常成人组织上最低限度地加工。Adaptimmune还在开发针对甲胎蛋白(AFP)的SPEAR，一种高度表达的糖蛋白在胎儿血清中，但在成人血液中含量低，主要是由于成熟的肝细胞不能产生AFP。AFP在肝细胞癌中高水平表达，Adaptimmune正试图用AFP TCR治愈这种情况。靶向这些抗原应该可以降低“on-target, off-tumor”毒性的风险。此外，它还开发了由分子分析组成的专有临床前筛选程序，以系统地识别人体内与目标癌症肽相似的肽，以消除进一步的交叉反应。它开发了人体细胞测试，以确定SPEAR是否与正常细胞样本结合，以及它们是否对全血样本也有效。

KitePharma的目标是MAGE-A3/MAGE-A6，使用KITE-718（NCT03139370）以及新抗原。通过收购荷兰私营公司T-cell Factory B.V.(TCF)于2015年加强了其TCR产品平台，并将其更名为作为KitePharma EU，因此获得了其专有的TCR-GENErator发现平台，以便快速、高通量地鉴定TCR，包括那些靶向新抗原的TCR。它主要包含当工程化TCR结合时诱导癌细胞凋亡的T细胞。

Medigene采用病毒载体介导的转移，将编码特定TCR的基因注入CD4+和CD8+T细胞。其TCR-T平台提供识别各种肿瘤抗原的TCR-T细胞，包括肿瘤共有的常见抗原和每个患者特异性的新抗原。自2018年3月以来，公司一直在开展其首个临床试验研究：其以PRAME为靶点的TCR-T疗法MDG1011的I/II期临床试验，用于治疗包括多发性骨髓瘤（MM）在内的各种血液系统恶性肿瘤，AML和骨髓增生异常综合征（NCT03503968）。同时，它正在与Charite医院（查里蒂医院）和Max-Delbruck-Center（马克斯-德尔布吕克中心）合作，在德国开展一项TCR研究，开发复发或难治性MM的TCR-T细胞识别MAGE-A1抗原。

TCR2 Therapeutics拥有独特的TRuC（代表“T细胞受体融合构建体”，剑桥，马萨诸塞州）平台，无需HLA匹配即可招募TCR。该平台结合了肿瘤抗原结合剂，例如scFv、单域抗体、和抗原结合片段，连接到TCR的CD3γ链。这种结构使工程化的TCR能够靶向表面抗原，不需要HLA匹配，克服了TCR-T细胞疗法的主要限制，但保留了由TCR和CD3组成的完整TCR系统。TRuC平台的另一个优点是它灵活并且可以采取多种形式，其中之一是双靶标TRuC平台，其中2个肿瘤抗原结合物与单个TRuC-T细胞产品偶联，以克服某些肿瘤中常见的抗原逃逸机制。最后，每个TRuC-T细胞产品都可以设计成携带内置附件或调节剂，包括T细胞增强剂、上/下控制基因和基质模型，以激活T细胞或灭活肿瘤细胞发挥作用（已知组织驻留的基质细胞积极参与肿瘤的发生和/或进化）。因此，这项创新为T细胞提供了一种更复杂的机制，可以更有效地杀死肿瘤细胞，同时在理论上规避“on-target, off-tumor”毒性，但其实际应用仍需要临床试验来评估。

Immatics公司开发了其ACTengine方法，该方法对患者的自体T细胞进行基因工程以在慢病毒转导时表达外源性TCR。通过专有的高通量筛选(HTS)，从天然人类T细胞库中鉴定出具有最佳亲和力的高度特异性外源性TCR，类似KitePharma和Medigene正在做的事情。通过这种方法，它与MD Anderson Cancer中心合作开发了3个产品：IMA-201、IMA-202，已进入临床I/II期，以及IMA-203。它还发明了双特异性TCR分子，这些分子可以在哺乳动物宿主细胞中轻松合成并包含2个结构域：一个T细胞募集抗体结构域，靶向免疫调节T细胞表面蛋白，如CD3，以及一个特定的TCR结构域靶向并结合I类MHC复合物呈递的肿瘤抗原。这种设计的好处是激活T细胞攻击肿瘤细胞，而不管它们的内在特异性。因此，这就像针对肿瘤细胞间接募集T细胞，这也可以防止“on-target, off-tumor”毒性，因为不需要增强的外源性TCR。尽管如此，它还需要进行多次临床试验才能确定这种设计在实际人体中是否真的有效。

另一方面，Bellicum Pharmaceutical没有提供另一种替代方案来增强TCR对癌细胞的亲和力或效力。相反，其新技术是为了防止工程化T细胞在患者体内出现副作用。它为TCR-T细胞疗法开发了一种名为CaspaCIDe的开关技术。该技术涉及用编码caspase-9和化学诱导二聚化（CID）蛋白的基因转化T细胞具有允许结合rimiducid的特殊设计结构域。当患者因“on-target, off-tumor”毒性而出现严重副作用时，会引入rimiducid并使CID蛋白二聚化。CID蛋白的二聚化启动信号级联反应，激活caspase-9然后caspase-3，最终导致T细胞凋亡以减轻副作用。

障碍和突破

TCR的一项永恒挑战是它们对肿瘤抗原的结合亲和力。已经提出了几种方法，包括上述公司应用的那些平台。Medigene与其他机构合作，提出了一种人源化小鼠模型，用于识别与人类相比具有更高亲和力和更显着治疗效果的亲和力增强的TCR。事实上，TCR的亲和力也应该受到控制，这不仅是因为交叉反应，还因为通过自相残杀转导的T细胞之间的自身反应，使得这种增强的T细胞在培养中无法存活，这当TCRs对NY-ESO-1的亲和力增强到KD=26pM时就是这种情况。TCRs的亲和力也与其对正常体细胞的“on-target, off-tumor”毒性直接相关。TCR-T细胞的瘤内注射是该问题的潜在解决方案，可以在局部达到高浓度和生物利用度的T细胞，而正常体细胞对这些注入的T细胞的实际全身暴露可以保持（非常）低。另一种方法将是在TCR-T细胞中添加一个抑制性CAR分子，其中一个单独的CAR包含靶向正常组织而非肿瘤组织上的抗原的scFv与抑制性细胞质结构域融合，例如免疫检查点分子PD-1。这种方法可以使TCR-T细胞区分具有相同抗原的肿瘤细胞和正常细胞。此外，还提出了诱导工程化T细胞凋亡的提议：iCas9，其中加入小分子后将caspase9基因修饰为可诱导的，是T细胞潜在的理想自杀开关。最后，另一种方法是反式-用修饰的人CYP4B1酶基因诱导工程化T细胞，导致原毒素4-ipomeanol的生物活化并诱导T细胞杀伤。

由于肿瘤的免疫抑制微环境，T细胞受体也难以根除转移性肿瘤。肿瘤组织通过限制T细胞特异性粘附分子（例如细胞间粘附分子1、共刺激配体）在肿瘤内皮细胞中的表达或关闭T细胞特异性化学引诱物来抑制T细胞向组织运输。肿瘤细胞通过与癌症相关的成纤维细胞和细胞外基质成分阻碍T细胞迁移。某些源自肿瘤细胞的分子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素10(IL-10)和前列腺素E2，它们协同诱导FAS配体和因此可以介导FAS阳性CD8效应T细胞的细胞凋亡。T细胞介导的肿瘤细胞杀伤的第二道屏障被抑制T细胞活化。T细胞通常会遇到缺氧，如果持续缺氧，通常会导致T细胞逃避以及肿瘤进展：所有快速分裂的哺乳动物细胞都需要高葡萄糖摄取来维持其增殖。因此，肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞细胞必须与自然环境中有限的葡萄糖进行激烈的竞争。然而，在缺氧情况下，肿瘤细胞可以驱动葡萄糖转运蛋白GLUT1的更高表达，保持高代谢率和增殖，并击败T细胞，降低其抗肿瘤活性。此外，肿瘤细胞通常会增加共抑制配体（检查点抑制剂）的表达，包括PD-1配体1（PD-L1）和PD-1配体2（PD-L2），以及降低产生与T细胞上的CD28结合时的共刺激信号。CTLA-4，CD28的同系物，但比CD28具有更大的结合亲和力，主要由活化的T细胞表达，在结合时阻止T细胞的进一步活化结合APC上的配体B7。PD-1是另一种属于免疫球蛋白超家族的抑制分子，当与PD-L1结合时，会诱导抗原特异性T细胞的凋亡并减少调节性T细胞的凋亡。此外，PD-L2与PD-1的结合可以显着抑制TCR介导的增殖和辅助T细胞产生的细胞因子。也可能存在数量不足的趋化因子受体，例如CXC趋化因子受体3（CXCR3)，在肿瘤细胞中吸引T细胞，而肿瘤可能诱导增强的坏死。

幸运的是，可以修改TCR以改善T细胞的转运和激活。一种方法是用编码肿瘤表达的趋化因子受体的基因来改造T细胞，以改善T细胞的运输。一项研究证明了通过编码CXCR2的基因转导的T细胞有效诱导干扰素-γ分泌，CXCL1受体由一系列肿瘤细胞系表达。另一种方法已被证明在5个不同使用CAR-T细胞的血管化肿瘤类型，是设计具有靶向VEGFR-2蛋白的CAR的T细胞，VEGFR-2蛋白是过度表达的肿瘤内皮细胞。因此，可以设计TCR以表达此类受体并提高T-细胞贩运。对于T细胞活化，一种方法是将一个信号开关合并到T细胞中，该信号在与肿瘤趋化因子结合时将抑制信号逆转为增加T细胞增殖的激活信号，例如通过融合IL-7的嵌合趋化因子受体内结构域到IL-4受体外结构域，后者对EBV转化的B细胞肿瘤显示出惊人的抗肿瘤益处。

开发了多种免疫检查点阻断抑制剂以增强免疫疗法对反应不佳的肿瘤的疗效。细胞毒性T淋巴细胞抗原4阻断和PD-1阻断被证明可有效增强T细胞活化。细胞毒性T淋巴细胞抗原4阻断抗体MDX-CTLA-4，现在称为ipilimumab，通常用作免疫检查点阻断剂，用于84项已确定的临床试验中的2项。PD-1抑制剂和PD-L1抑制剂在旨在治疗癌症的临床试验中也很常见；此外，2种PD-1抑制剂nivolumab（用于84项试验中的1项）和pembrolizumab（用于84项试验中的2项）和1种PD-L1抑制剂atezolizumab已获得食品和药物管理局的批准。某些癌症类型的药物管理。另一种方法涉及使用基因编辑技术去除T细胞中编码共抑制配体结合分子的基因。例如，转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)介导的PD-1基因在肿瘤反应性CD4+和CD8+T细胞（被过继转移）中失活，已证明可提高T细胞对肿瘤组织PD-1介导的细胞死亡的抵抗力。

另一个挑战，尤其是针对新抗原特异性的TCRs，就是为了高效识别这种特殊的抗原。正如KitePharma等公司所应用的那样，HTS-IR技术在批量和单细胞水平上的应用，包括TraCeR和单细胞TCRseq等用于重建TCR和识别免疫原性新抗原的计算方法，为分析多样性、动力学、和T细胞的克隆性。尽管未来基因测序和生物信息学分析的进步可能会降低其成本，但目前它仍然是一种相对昂贵的方法。

还尝试进行其他改进，包括使用锌指、TALEN或CRISPR/Cas9系统通过核酸酶基因组编辑敲除内源性TCR，以实现更有效的识别和更高水平的外源性TCR表达。同时靶向多种抗原，例如过继转移靶向gp100和卵清蛋白的2个CD8+T细胞群，在一项试验中导致B16-OVA黑色素瘤的延迟复发。通过这些改进，TCR-T细胞疗法很可能成为更有效地根除肿瘤，但降低成本可能是癌症患者面临的另一个问题。

总体而言，TCR-T细胞疗法发展迅速，已成为对抗各种类型癌症，尤其是实体瘤的一种有前景的策略。我们的研究不需要伦理委员会的批准，因为它不包含人类或动物试验。

参考文献

Zhang J, Wang L. The Emerging World of TCR-T Cell Trials Against Cancer: A Systematic Review. Technology in Cancer Research & Treatment. January 2019. doi:10.1177/1533033819831068