以往研究表明,在体外培养5天原代神经元暴露于1.4%异氟烷4h树突棘明显减少。
摘要
背景:已知吸入麻醉药会破坏PDZ2结构域介导的突触后密度95(postsynaptic density -95,PSD-95)蛋白的蛋白质间相互作用。本研究旨在探讨早期异氟烷暴露对突触PSD-95 PDZ2结构域破坏的潜在机制,这种破坏改变了棘突密度和认知功能。作者假设,一氧化氮信号通路组分激活蛋白激酶-G,可以防止小鼠PSD-95蛋白PDZ2结构域破坏所致神经元早期树突棘和突触的丢失及认知功能障碍。方法:出生后第7天的小鼠暴露于1.5%异氟烷4h,或注射8mg/kg激活的PSD-95野生型PDZ2肽或可溶性鸟苷酸环化酶激活剂YC-1及其各自的对照。体外培养原代神经元,培养7天后,将原代神经元暴露于异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽段4h。采用免疫共沉淀,测量棘突密度、突触、环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶活性和以及新物体识别记忆实验进行评估。
结果:与对照组相比,暴露异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽段:1)相对于N-甲基-D-天冬氨酸受体NR2亚单位沉淀,PSD-95共免疫沉淀减少(mean±SD[对照百分比]):异氟烷(54.73±16.52),P=0.001和PSD-95野生型PDZ2肽(51.32±12.93),P=0.001;2)棘突密度损失(平均值±SD[每10微米脊柱密度]):对照组(5.28±0.56)VS异氟烷组(2.23±0.67),P<0.0001,PSD-95突变型PDZ2肽(4.74±0.94)VS PSD-95野生型PDZ2肽(1.47±0.87),P<0.001;突触点减少(平均值±SD[对照百分比]):异氟烷(41.1±14.38),P=0.001和PSD-95野生型PDZ2肽(50.49±14.31),P<0.001。NO 供体或环状鸟苷一磷酸类似物可防止棘突和突触丢失以及环状鸟苷一磷酸依赖性蛋白激酶活性下降,但这种预防被初级神经元中的可溶性鸟苷酸环化酶或蛋白激酶-G 抑制剂阻断。3)5周时的新物体识别缺陷:(平均值±标准差[识别指数]):雄性大鼠;对照组(64.08±10.57)与异氟烷(48.49±13.41)相比,P=0.001,(n=60)雌性大鼠;对照组(67.13±11.17)与异氟烷(53.76±6.64)相比,P=0.003(n=58)。YC-1的引入可以预防异氟烷引起的认知记忆损伤。
结论:激活可溶性鸟苷酸环化酶或蛋白激酶-G可防止异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽诱导的树突棘和突触丢失。YC-1是鸟苷酸环化酶的一种非独立激活剂,能够减轻认知记忆损伤,支持可溶性鸟苷酸环化酶介导的蛋白激酶-G信号在减轻异氟烷诱导的认知损害中的作用。
背景:
临床前研究表明,新生儿早期暴露于麻醉药可能对其脑功能产生影响。动物研究包括对非人类灵长类研究表明,新生儿和婴儿时期的麻醉药暴露会导致长期认知功能障碍和神经认知能力受损。然而,这些神经缺陷背后的机制尚不明确。因此,确定因暴露于麻醉药而受损并产生不良神经发育结果的细胞和分子机制,包括注意力缺陷障碍和学习和记忆障碍是十分重要的。
突触内和突触外的离子通道和受体已被认为是麻醉药作用的重要靶点。许多离子通道和受体通过 PDZ 结构域介导的蛋白质-蛋白质相互作用与其下游信号通路相关联。研究者前期研究表明,吸入麻醉药可破坏PDZ 结构域介导的蛋白质相互作用。临床相关浓度的吸入麻醉药异氟烷可剂量依赖性和特异性抑制PDZ2结构域介导的突触后密度 (PSD) 蛋白 95 或 PSD-93 与 N-甲基-D-天冬氨酸受体 (NMDAR) 或神经元一氧化氮合酶(nNOS)之间的相互作用。为了模拟异氟烷麻醉的作用,研究使用了活性 PSD-95 野生型 PDZ2 肽,其可破坏突触后密度-PDZ2 介导的蛋白质相互作用。这种相互作用被破坏可降低最低肺泡有效浓度以及翻正反射的半数效应浓度,表明该结构域以及蛋白质是麻醉药作用的重要靶点。PSD-95 PDZ2与NMDA受体的相互作用促进兴奋性突触的可塑性,然而,在新生海马中,PSD-95 PDZ2结构域介导的蛋白质相互作用丢失和PSD-95-NMDAR nNOS复合体破坏相关的潜在信号通路尚不清楚。因此,研究者研究了临床相关浓度的异氟烷是否会破坏新生小鼠脑海马及原代神经元中由PDZ2结构域介导的NR2A/2B和PSD-95之间的蛋白相互作用及其潜在机制。此外,研究还检测了异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽对树突棘和突触的影响,对大脑可塑性起着决定性作用。在前期研究中,研究者发现在异氟烷或者PSD-95野生型PDZ2肽暴露时给予NO能够保护突触可塑性。然而,NO保护作用的下游分子机制和级联信号通路尚不清楚。因此,在本研究中,采用药理激活剂和抑制剂来探索一氧化氮-鸟苷酸环化酶-蛋白激酶G信号通路的每一步级联反应。具体而言,研究探究了NO或YC-1激活的可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)是否可以特异性的缓解异氟烷或者PSD-95野生型PDZ2肽引起的棘突密度或者突触丢失。此外,研究还探究了通过环鸟苷酸(cGMP)类似物激活蛋白激酶G (PKG)是否可以防止异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽诱导的树突棘和突触丢失。为了准确地确定可溶性鸟苷酸环化酶依赖的cGMP-PKG信号通路的参与,研究者在小鼠异氟烷麻醉时采用了不依赖NO的可溶性鸟苷酸环化酶激活剂YC-1,以探究是否单独使用可溶性鸟苷酸环化酶激活剂可以预防认知障碍。
实验结果
异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽破坏小鼠海马中PDZ2结构域介导的NMDA受体NR2A/2B与PSD-95之间的蛋白相互作用
为了检测异氟烷暴露是否会破坏发育大脑海马中突触PDZ2结构域介导的蛋白相互作用,研究者将出生后7天的小鼠暴露于异氟烷或对照条件(50%氧气)4h。另一组腹腔注射融合肽、活性PSD-95野生型PDZ2肽(模拟异氟烷)或非活性PSD-95突变型PDZ2肽(非活性对照)。在正常情况下,PSD-95的第二个PDZ结构域与nNOS的PDZ结构域或NR2A和NR2B亚基的C-末端尾部相互作用。通过免疫共沉淀实验,研究者发现异氟烷和PSD-95野生型PDZ2 肽显著破坏了海马裂解物中NR2A/2B亚基和PSD-95之间的相互作用。然而,在对照组和PSD-95突变型PDZ2肽组中,这种相互作用保留了下来(fig.1 A,B)。单因素方差分析显示,与对照组相比,异氟烷组PSD-95共免疫沉淀相对于NR2A/2B共免疫沉淀的水平降低(P=0.001);与PSD-95野生型PDZ2肽组相比,PSD-95野生型PDZ2肽组降低(P=0.001)。
图1. 异氟烷与PSD-95野生型PDZ2肽可破坏对新生小鼠海马NMDA受体NR2A/2B和PSD-95 PDZ2蛋白相互作用。
异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽暴露对原代海马神经元细胞活力和树突棘密度的影响
原代神经细胞MAP-2/DAPI免疫组化染色结果显示,85%的细胞MAP-2蛋白阳性(fig. 2A)。体外培养7天神经元暴露1.5%异氟烷或者1μM活性PSD-95野生肽4h,采用MTT检测细胞活性,结果显示,与各自的对照或未处理的神经元相比,1.5%异氟烷或1 M活性PSD-95野生型PDZ2肽均未降低海马神经元的活力(fig. 2B, C)。在突触形成和神经发生过程中,PSD-95作为一种重要的支架蛋白,其发育障碍可能会影响突触可塑性,导致神经功能障碍。因此,研究者研究了异氟烷或突触PDS95-PDZ2和NR2A / 2B蛋白相互作用的丢失是否会影响发育中的海马神经元的早期突触发生。与各自对照组相比,暴露于1.5%七氟烷4h或者1μΜ活性PSD-95野生型PDZ2肽段后,神经元突触棘数量明显减少(P<0.001;fig. 2D-G)。此外,研究者还观察到PSD-95野生型PDZ2肽暴露,PSD-95突变PDZ2肽与PSD-95野生型PDZ2肽相比,棘突长度显着增加。此外,研究者还观察到异氟烷与PSD-95野生型PDZ2肽段均可导致突触的长度增加。
图2. 异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽对神经元细胞活力和树突棘的影响。
一氧化氮介导的可溶性鸟苷酸环化酶的活化可防止异氟烷和PSD95野生型PDZ2肽诱导的原代海马早期树突棘丢失
一氧化氮信号传导在调节兴奋性突触的发育中起着重要作用,NO产生的损伤会干扰突触和突触棘的发育。研究者研究了NO供体DETA壬酸酯对异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽诱导的海马神经元早期树突棘丢失的影响。首先,研究者确定神经元细胞中DETA壬酸酯和可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂-ODQ的非细胞毒性浓度。在异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽暴露时添加150μM DETA壬酸酯可减弱神经元细胞中树突状棘的丢失(P=0.030,fig.3A-D)。为了确定NO激活sGC是否特异性和足以防止异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽诱导的棘突密度损失,研究者用ODQ (100 μ M)和DETA壬酸酯处理神经元细胞。ODQ阻断了DETA壬酸酯减弱异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽诱导的树突棘丢失的能力(fig.3A-D)。
图3. 可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ阻断NO供体DETA壬酸酯防止异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽诱导的树突棘丢失的能力。
8-Br-cGMP介导的蛋白激酶G的激活可防止异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽诱导的树突棘的损失和海马神经元中依赖于循环GMP的蛋白激酶活性的下降
NO的多重作用是通过其典型受体、可溶性鸟酰基环化酶(sGC)和二级信使cGMP介导的。因此,研究者研究了cGMP模拟物8-Br-cGMP对异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽诱导的树突棘丢失的影响。首先,研究者测定了神经元细胞中8-Br-cGMP和蛋白激酶G (PKG)抑制剂KT5823的非细胞毒性浓度。在异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽暴露时添加200 μM 8-Br-cGMP可减弱海马神经元细胞中树突棘的丢失(fig.4 A-D)。接下来,为了确定8-Br-cGMP激活PKG是否特异性和足够防止异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽诱导的棘突密度丢失,研究者在8-Br-cGMP中添加了1个µM KT5823。研究者发现KT5823阻断了8-Br-cGMP防止异氟烷诱导棘突丢失的能力(fig4. A-D)。cGMP依赖的蛋白激酶参与了长时程增强和突触可塑性,而cGMP依赖的蛋白激酶I型可在海马神经元的游离培养中检测到。研究者将海马神经元暴露于异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽中,同时存在/不存在8-Br-cGMP和KT5823。异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽均导致cGMP依赖性蛋白激酶活性下降(fig. 5E,F)。然而,8-Br-cGMP改善了cGMP依赖性蛋白激酶活性的丧失。相反,添加PKG抑制剂KT5823可进一步降低海马神经元细胞中cGMP依赖性蛋白激酶的水平(fig. 5E,F)。
图4. 蛋白激酶G抑制剂KT5823阻断了8-Br-cGMP防止异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽诱导的树突棘丢失和循环GMP依赖性蛋白激酶活性下降的能力。
图5. 8-Br-cGMP和YC-1防止异氟烷诱导的突触丢失,这种保护作用在KT5823存在时被阻断。
异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽诱导的原代神经元突触缺失在8-Br-cGMP和YC-1的存在下得到缓解
以往研究表明,异氟烷损害小鼠海马突触的可塑性。NO-cGMP-PKG信号参与调节大脑不同区域突触可塑性和记忆形成。因此,研究者首先研究了异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽对初级神经元突触的影响。体外实验中,研究者将原代神培养7d经元与暴露于异氟烷和多肽4小时,在存在和不存在该药物的情况下,细胞在体外培养14天后进行免疫细胞化学染色,在培养基更换期间保持所有药物的浓度恒定。数据采用单因素方差分析进行分析,研究者发现暴露异氟烷后或者PSD-95野生型PDZ2肽后突触染色点计数显著减少 (fig 6A - B)。研究者接下来探究了cGMP类似物8-Br-cGMP和YC-1对异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽诱导的突触丢失的影响。异氟烷暴露时添加200 μ M的8-Br-cGMP和10 μ M的YC-1可减轻突触的丢失 (fig. 5A-B)。8-Br-cGMP和YC-1也能减弱PSD-95野生型PDZ2肽诱导的突触丢失 (fig. 6 A-B)。接下来,为了验证8-BrcGMP对PKG的激活是否特异性和足够防止异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽诱导的突触染色点减少,研究者引入了KT5823和8-Br-cGMP。研究者发现KT5823阻断了8-Br-cGMP防止异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽诱导突触丢失的能力,表明该途径依赖于蛋白激酶G。
图6. PSD-95野生型PDZ2肽暴露会导致突触丢失,但在8-Br-cGMP和YC-1存在的情况下会缓解突触丢失。
YC-1治疗可防止新生异氟烷诱导的5周龄小鼠物体识别记忆损伤
为了确定新生儿异氟烷暴露或突触PSD-95 PDZ2破坏是否与后期认知障碍有关,研究者采用物体识别实验评估出生后7天雌性雄性小鼠接受七氟烷麻醉4周后(出生后35天)后海马依赖的学习记忆能力是否有影响。研究者发现,氧气对照组、氧气对照+YC-1组以及七氟烷+YC-1组能够区分新物体和已知物体,而异氟烷组未能够区分出新物体与已知物体。YC-1治疗可防止异氟烷暴露引起的新物体识别障碍,其表现为新物体识别能力的增强。
图7. 新生儿暴露于异氟烷会损害雄性和雌性小鼠5周时的识别记忆。
讨论:
本研究中检测了异氟烷对小鼠海马突触PDZ2相互作用的影响及对小鼠海马初级神经元树突棘和突触以及认知功能的影响。作者前期研究发现,在临床相关浓度的吸入麻醉药会破坏PDZ结构域介导的PSD95或PSD-93与NMDA受体NR2亚基或神经元一氧化氮合酶(nNOS)之间的相互作用。据此推测,在突触形成的关键时期,突触PDZ2相互作用的中断可能会损害神经元的可塑性,导致长期的认知功能障碍或神经功能障碍。研究发现,暴露于异氟烷或PSD95野生型PDZ2肽4h会破坏新生小鼠大脑海马中NR2A/2B亚基与PSD-95 PDZ2结构域之间的相互作用。此外,在体外培养的海马神经元中,异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽可导致早期树突棘的丢失、成熟突触的丧失以及依赖于循环GMP的蛋白激酶活性的下降。异氟烷暴露时引入NO供体或cGMP类似物可防止早期树突棘、成熟突触的损失,以及异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽导致的GMP依赖性蛋白激酶活性的降低。此外,在新生小鼠异氟烷暴露期间引入可溶性鸟酰基环化酶(sGC)激活剂YC-1可防止5周时物体识别记忆的丧失。这些数据表明,早期麻醉暴露后上游NMDAR NR2-PSD-95-PDZ2-nNOS复合物失调会损害下游 NO/sGC/ cGMP介导的蛋白激酶- G信号通路(fig.8).
以往研究表明,在体外培养5天原代神经元暴露于1.4%异氟烷4h树突棘明显减少。研究者研究了异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽对体外7天和体外14天神经元树突棘和突触的影响,因为功能极化大约在神经元细胞被包覆一周后开始。此外,在体外培养的14天是突触连接建立的时间点。
本研究发现,体外培养原代神经元7d暴露于异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽(模拟异氟烷)4h可致早期树突棘的丧失,这些研究结果与既往研究结果是一致的。兴奋性突触存在于树突棘上,因此早期树突棘的缺失会减少兴奋性神经传递,也会导致突触的缺失。此外,研究者还观察到体外培养7d原代神经元暴露于异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽4h会导致神经元14d时突触减少。研究表明,吸入麻醉药可以作用于许多与PDZ结构域介导的蛋白质相互作用相关的离子通道和受体及其下游信号通路连接离子通道和受体及其下游信号通路。异氟烷对突触PDZ2结构域的破坏,为新生儿大脑海马区PSD-95NMDAR-nNOS复合体的解离和小鼠认知功能障碍、海马神经元早期树突棘、成熟突触障碍和循环GMP依赖性蛋白激酶活性的丧失提供了可能的机制。
随后,研究者研究了新生儿麻醉暴露或海马突触PSD95 - PDZ2相互作用的受阻是否会影响小鼠达到一定年龄后的记忆和认知功能。采用新物体实验发现,新生小鼠早期暴露于麻醉后导致雄性和雌性小鼠的海马依赖学习和记忆,包括非空间识别记忆损伤。研究者实验室之前发表的研究表明,3周和6周大的小鼠早期暴露于异氟烷或注射PSD-95野生型PDZ2肽表出识别记忆性能下降。然而,为了验证这种认知记忆障碍是否是由于sGC/ cGMP依赖的下游信号通路受损所致,研究者在异氟烷暴露的小鼠中给予可溶性鸟苷酰环化酶激活剂YC -1。研究发现YC-1治疗缓解了异氟烷所致的物体识别记忆损伤,这与另一组研究结果相似,该研究报告了YC-1对不同麻醉药导致的认知功能障碍具有保护作用,提示依赖于sGC/cGMP的信号在早期麻醉暴露引起的认知障碍中有作用。
大脑的发育是通过可塑性和依赖于活动的机制来协调的,这些机制控制着脊柱和突触的形成和消除。有证据表明,活动依赖的树突棘和突触的形成是由一个突触后信号级联介导的,涉及NO、cGMP和血管扩张剂刺激的磷酸化蛋白磷酸化。研究者最近的研究结果表明,使用NO供体可防止新生儿异氟烷诱导的突触可塑性和记忆障碍。
大脑的发育通过调控突触可塑性以及神经元的活动控制树突棘及突触的形成和消除。大量证据表明,活动依赖的突触棘和突触的形成可由个突触后信号级联反应包括NO、cGMP和血管扩张剂刺激的磷酸化蛋白所调节。作者最近研究结果表明,使用NO供体可防止新生儿异氟烷诱导的突触可塑性和记忆障碍。然而,突触PSD-95-PDZ2结构域相互作用受阻可影响NO的保护作用并导致早期树突棘的丢失,但其下游通路尚不清楚。因此,为了识别NO介导的信号转导的下游成分,研究者使用了几种药理学激活剂和抑制剂。可溶性鸟苷酰环化酶(sGC)是已知的NO受体,它的激活导致随后cGMP水平的升高。在这里,研究者发现NO信号通路的组成部分激活PKG可能与海马神经元细胞暴露异氟烷或野生型PDZ2肽导致早期树突棘密度和突触损失有关。在异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽暴露时,用NO供体DETA 壬酸酯预处理神经元可防止树突棘密度的损失。然而,使用选择性可溶性鸟酰基环化酶抑制剂(ODQ)可以逆转这种作用。当NO供体加入可溶性鸟酰基环化酶抑制剂时,它并不能防止异氟烷诱导的棘突损伤。这些结果表明NO激活可溶性鸟酰基环化酶是特异性的,足以防止海马神经元细胞中异氟烷诱导的树突棘丢失。
NO-sGC-cGMP通路在调节海马和大脑皮层中的突触传递、可塑性及认知功能中发挥重要作用。研究还观察到DETA壬酸酯的作用与cGMP类似物8-Br-cGMP相似。8-Br-cGMP预处理可防止异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽引起的早期棘突和突触的丢失。为了验证cGMP对PKG的激活是否特异性和足够防止异氟烷或突触PSD-95 PDZ2障碍导致的棘突丢失,研究者在PKG抑制剂(KT5823)存在的情况下,向海马神经元添加8-Br-cGMP。然而,在KT5823存在的情况下,8-Br-cGMP并不能防止异氟烷诱导的棘突丢失。这些结果表明,cGMP通过PKG作用,防止异氟烷和PSD-95野生型PDZ2肽诱导的海马神经元棘突丢失。此外,添加NO独立可溶性鸟苷环化酶激活剂YC-1,也可减轻异氟烷或PSD-95野生型PDZ2肽对海马神经元突触的损伤。
本研究存在一定的局限性,在异氟烷麻醉或PSD-95野生型PDZ2肽的诱导神经毒性的体内及体外实验中,研究者并没有研究性别差异是否有影响,因为研究表明,不同的发育阶段,性别并不影响对麻醉药的敏感性。尽管如此,为了回应同行评议,研究者进行了额外的实验,并报告了新生雄性和雌性小鼠在5周时暴露于异氟烷对物体识别记忆的影响。
本研究表明,临床相关浓度的异氟烷显著破坏了新生小鼠大脑海马NMDAR NR2A/2B亚基与PSD-95之间的相互作用。研究还发现,新生异氟烷或突触PSD-95 PDZ2破坏会导致雄鼠和雌鼠在5周时的识别记忆损伤,并在体外导致早期树突棘和突触的丧失,但不会引起明显的神经元死亡。研究者的研究结果强烈表明,在体外引入NO供体或cGMP类似物可防止早期树突棘和突触的损伤。此外,在异氟烷暴露时引入可溶性鸟苷酰环化酶激活剂YC-1可缓解物体识别记忆的损伤。这些研究加深了研究者对异氟烷或新生儿海马上游PSD-95蛋白PDZ2结构域的破坏如何干扰这些下游信号通路的理解。此外,本研究工作拓展了对吸入麻醉所致认知障碍机制的理解,对其潜在的治疗途径有了新的认知。
编译、校对:魏恺,罗猛强
文献链接:
Agarwal S, Schaefer ML, Krall C, et al. Isoflurane Disrupts Postsynaptic Density-95 Protein Interactions Causing Neuronal Synapse Loss and Cognitive Impairment in Juvenile Mice via Canonical NO-mediated Protein Kinase-G Signaling. Anesthesiology. 2022 Aug 1;137(2):212-231.
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