精准前沿丨多组学用于溃疡性结肠炎肠道菌群中普通拟杆菌蛋白酶关联疾病严重程度的研究

本期《精准前沿》栏目分享美国加州大学David J. Gonzalez 和 Rob Knight研究团队发表于Nature Microbiology（IF = 30.964）上的一篇研究[1]，研究通过对加州大学IBD学术中心炎症性肠病（IBD）队列患者进行多组学（宏基因组、宏蛋白质组学、16S rRNA扩增子测序、粪便代谢组学和血清蛋白质组学）研究，对宿主-微生物相互作用进行探索，基于多组学研究结果，提高了对驱动溃疡性结肠炎功能性菌群改变的理解，并为确定其它可能被抑制通路作为治疗策略提供了新的见解。

研究背景

溃疡性结肠炎（UC, Ulcerative colitis），是一种炎症性肠病(IBD,  inflammatory bowel disease)，以结肠的慢性炎症为特征，黏膜炎症的严重程度、持续性与发病率和死亡率相关。UC是由宿主-菌群稳态的破坏引起的。针对宿主的非特异性免疫抑制剂，如类固醇、硫嘌呤和/或生物制剂，可用于抵消中重度炎症患者的自然病程。然而，这些治疗方法与重大风险相关，并且在充分管理疾病方面往往无效。有许多基于基因组技术的微生物组研究已经确定了与UC的关联，强调了与UC状态相关的微生物失衡和组成的时间变化。虽然最近的研究将UC的微生物群分析扩展到了基因组学之外，但仍然不清楚这些变化在本质上是因果关系还是关联关系。在本研究中，作者通过宏基因组-宏蛋白质组学方法，以及传统的16S rRNA扩增子测序、粪便代谢组学和血清蛋白质组学方法，在一个大的横剖面队列中研究了IBD患者，寻找可以用于治疗的宿主-微生物相互作用。

研究设计

为了了解UC患者的宿主-微生物相互作用是如何被破坏的，本研究收集并分析了来自加州大学一个炎症性肠疾病中心的40名UC患者的6个基于组学数据集（粪便样本的宏蛋白质组学、代谢组学、宏基因组学、宏肽组学、扩增子测序和血清样本的蛋白质组学数据集），以及疾病活动的各种临床、内镜和组织学测量。本研究收集210份样本（UC）73份，克罗恩病（CD）117份，健康对照20份，分别进行独立分析（图1）。

  图1. 研究设计和数据库生成  

研究结果

1.  与IBD严重程度的宏组学关联

尽管本研究的队列纳入了不同的患者群体，许多临床严重程度指标显示出高度相关性（图2a）。考虑到严重程度指标的重叠，本研究选择了包括患者症状在内的代表性指标：UC的部分Mayo指标，以及CD的克罗恩病活动指数（CDAI，Crohn’s Disease Activity Index）中患者报告的结果（大便频率、腹痛、一般健康状况）。在收集到的所有宏组学中，疾病严重程度与α-多样性和β-多样性均显著相关（图2b-c）。CD亚型和两个单独处理的UC组显示出与健康对照组不同的独特微生物群组成（图3a）。以粪便为基础的-组数据分布之间的相关性强于血清蛋白质组（图3b），并且宏蛋白质组可以最强烈地预测UC活动，而联合数据和代谢组紧随其后（图3c）。在活动期UC患者中，还观察到人类蛋白的增加，以及磷胆碱等代谢物类别与活动相关（图3d-e）。

图2. 多组学多样性与IBD疾病活动性相关

图3. IBD疾病活动性的多组学分析

利用小型微生物群基因和蛋白质的直接比较，线性回归确定了与临床疾病严重程度最相关的特征（r > 0.3）。比较正相关和负相关的属注释，发现拟杆菌类蛋白占UC疾病活性正相关蛋白的40-60%（图4a）。疾病活动与拟杆菌属的相关性在两个UC群组中都得到了证实，并被确定为UC特有的CD亚型，每个亚型都有独特的疾病相关蛋白。相对于宏蛋白质组，拟杆菌属基因在UC中与疾病严重程度的相关性较弱（图4b）。对拟杆菌属疾病活动相关蛋白的功能分析显示，蛋白酶的表达增加（图4c）。普通拟杆菌（B. vulgatus）和杜氏拟杆菌（B. dorei）是在健康成年人中流行的两种密切相关的物种。本研究分析了来自拟杆菌属的59种拟杆菌的119种不同的酶和蛋白酶与UC严重程度的相关性。丝氨酸蛋白酶，包括六种二肽酶，是拟杆菌属物种中常见的与UC活动相关的蛋白酶（图4e）。应用离群值方法（outlier approach）比较宏基因组和宏蛋白质组数据，本研究确定了B. vulgatus和B. dorei蛋白酶生产过剩或不足的患者样本，并观察到蛋白酶含量增加的患者，临床严重程度和内镜下疾病活动程度明显高于蛋白酶减少组和典型UC患者样本（图4f，图5a）。从组织学角度来看，只有18.8%被归为“过度生产者”的患者出现了组织学缓解，而38.5%被归为“生产不足”的患者和45%的其他患者出现了组织学缓解（图5b）。由于相关的蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，这两类蛋白酶主要在细胞外空间发挥作用，作者推测这些蛋白可能在细胞外蛋白水解和疾病活动加剧中发挥作用。  

图4. 整合宏基因组-宏蛋白质组分析揭示拟杆菌肽蛋白酶区分活跃UC患者的一个亚群

图5. 普通拟杆菌蛋白酶产生过多的患者会增加内窥镜和组织学的严重程度

2.  UC患者组学和拟杆菌上清中蛋白水解的评估

代谢组学和宏肽组学分析证实了蛋白水解在UC患者中的重要性。最初是通过鉴定二肽丰度观察到的，二肽丰度是与UC疾病活性相关性第二高的代谢物类别（图6a）。二肽和寡肽是与疾病活性正相关的代谢产物中最常见的两个化学类别（r > 0.3）分别占总正相关的44%和5.8%。为了进一步分析寡肽，本研究采用从头测序的方法分析了宏肽组学（来自复杂的多物种样本的多肽）。结果在严重UC的粪便样本和拟杆菌属蛋白酶生产过剩的患者中发现了更多的肽片段（图6b，图7）。该数据还揭示了来自人类蛋白质的肽片段的身份，包括来自胶原和粘蛋白的结构蛋白（图6c）。这些人类蛋白是UC蛋白酶的潜在靶标。已知的中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶-327的切割模式并不是识别肽末端的强信号（图7b），这表明中性粒细胞蛋白酶可能不是患者蛋白水解的主要贡献者。

图6. 评估UC患者和拟杆菌上清的蛋白质水解作用

图7. 肽片段在活跃的UC患者和拟杆菌属蛋白酶富集的患者中增加 为了鉴定与UC疾病活性相关的拟杆菌属中的蛋白酶活性，培养细菌并通过蛋白质组学和蛋白酶活性测定对上清液进行分析。抑制丝氨酸蛋白酶被证明是扰乱上清B. vulgatus蛋白水解的最有效方法（图6d）。蛋白质组学分析发现，在B. vulgatus、B. dorei和B. theotaomicron（B. theta）的上清蛋白中，丝氨酸型活性是最常见的一类酶功能。 3.  蛋白酶抑制在体外和体内均可抑制普通拟杆菌诱导的结肠上皮损伤 接下来，本研究利用Caco-2单层上皮测试了UC患者中6种最丰富的拟杆菌属对肠道屏障的影响。结果显示，与两种最丰富的拟杆菌属（B. vulgatus和B. dorei）孵育38小时后，跨上皮电阻（TEER）显著降低，而其他物种却显著增加（图8a）。尽管B. vulgatus和B. dorei对TEER的影响相似，且都有大量与UC活性相关的蛋白酶，但本研究选择了B. vulgatus作为实验的重点，因为它在UC肠道菌群和健康肠道菌群中都是更丰富的成员。接下来，通过添加丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶特异性的蛋白酶抑制剂混合物来评估蛋白酶活性对上皮通透性破坏的影响。研究发现，蛋白酶抑制在接种普通拟杆菌22小时和38小时后均显著增加了TEER（图9a-b）。本研究进一步测试了对数期生长的B. vulgatus上清液是否对TEER有类似的影响（图8c）。没有发现显著的影响，这表明要么感兴趣的蛋白酶是膜结合的，要么应激源（例如，宿主-微生物相互作用或营养剥夺）对蛋白酶的分泌是必要的。

图8. 利用共培养、上清液和蛋白酶抑制剂测定拟杆菌属对TEER的影响

共聚焦显微镜观察发现肠单层对普通拟杆菌处理的上皮细胞产生了显著影响，紧密连接蛋白、Zo-1和Occludin发生了明显变化（图9d），影像学研究也显示了B. vulgatus处理对Caco-2细胞的细胞形态和肌动蛋白网络的潜在影响（图16）。对单层细胞形态的分析显示，细胞的圆形显著降低（P = 0.0043），可以通过蛋白酶抑制恢复（图9e）。

为了研究普通拟杆菌蛋白酶在体内的作用，在IL10- / -无菌小鼠模型中对普通拟杆菌进行了单定植，并向一半小鼠的饮用水中补充所选择的蛋白酶抑制剂混合物（图9f）。定植10周后，蛋白酶抑制对结肠上皮有保护作用，减少隐窝的炎症细胞浸润（图9g）。蛋白酶抑制剂治疗显著改善了组织学结肠炎的严重程度（图9h），同时显著降低了B. vulgatus诱导的隐窝增生（图9i）。

图9. 蛋白酶抑制对B. vulgatus和粪便移植诱导的体外和体内病理有保护作用

4.  UC患者粪便中存在的B. vulgatus蛋白酶将结肠炎严重程度移植到无菌小鼠

接下来，本研究试图评估UC患者中高水平B. vulgatus蛋白酶的存在对肠道炎症发展的影响程度。为此，将UC患者的粪便移植到有结肠炎倾向的IL10缺乏无菌小鼠中（图9j）。本研究选择具有或不具有高水平B. vulgatus蛋白酶的患者粪便样本（n=3例UC患者）移植到易发生结肠炎的IL10缺乏无菌小鼠组中。其中一半的小鼠通过饮用水注射了蛋白酶抑制剂混合物（每种情况下n=9只小鼠）。根据疾病的总指标（结肠缩短和脾肿大-图9k-l）和组织病理学分析（图9m），给予蛋白酶含量丰富的粪便样本的小鼠显示明显的结肠炎。这些表型在接受UC患者粪便的小鼠中不明显（这些小鼠缺乏大量的B. vulgatus蛋白酶）。其他器官未观察到显著差异（图10a-f）。蛋白酶抑制剂混合物对饲喂低蛋白酶粪便样本的小鼠的这些参数没有显著影响，但对饲喂富含蛋白酶粪便样本的小鼠的结肠炎明显减轻。通过测量粪便中脂蛋白丰度和脾脏细菌负荷来评估结肠炎症的趋势相似，但没有达到统计学意义（图10g-h）。这些研究表明，拟杆菌属蛋白酶增加的UC患者的微生物群具有较高的结肠炎潜能，并提示蛋白酶抑制可以作为严重UC的治疗干预措施。

最后，为了证实在粪便移植研究中存在B. vulgatus蛋白酶，本研究对小鼠粪便进行了宏蛋白质组学分析。将移植小鼠的粪便与一名拥有过多B. vulgatus蛋白酶的患者和一名蛋白酶水平较低的对照患者的样本进行比较，能够检测到在蛋白酶抑制剂混合物存在的情况下，过量移植小鼠的拟杆菌属蛋白和B. vulgatus蛋白酶的丰度增加（图10i，图9n）。在这些小鼠中鉴定出的B. vulgatus蛋白酶的共同功能包括丝氨酸型肽酶活性和二肽酶活性（图10j）。为了指导今后对B. vulgatus蛋白酶的研究，本研究对UC患者的蛋白酶特性、体外研究和体内研究进行了比较（图10k-l）。值得注意的是，在整个研究中，几种二肽基肽酶（如DPPIV、DPPVII）被一致确定，它们在营养有限区域的氨基酸代谢和牙龈卟啉单胞菌（一种与牙周病相关的细菌）的毒性中发挥着已知的作用。有趣的是，人类DPPIV是众多糖尿病治疗药物的靶点。DPPIV抑制剂也被证明在结肠炎模型中具有保护作用（原因是防止胰高血糖素样肽-2降解），由此推测寻常B. vulgatus DPPIV可能是一个有趣的潜在治疗靶点。

图10. 粪便移植实验的额外测量

讨论

本研究推进了目前对B. vulgatus和UC的认识。拟杆菌属是肠道中最丰富的物种之一，位于结肠的外层黏膜层，在消化复杂的碳水化合物中发挥重要作用。早期研究表明，B. vulgatus具有潜在的致病性作用，因为该细菌被发现可诱导无菌豚鼠实验性结肠炎。进一步证实这一联系的是，UC患者中针对B. vulgatus外膜蛋白的高水平抗体。然而，后来的研究确定了B. vulgatus在结肠炎模型中的混合作用，最近的基因组研究只是偶尔涉及拟杆菌属。因此，拟杆菌属在IBD中作用的详细机制还没有很好地建立。本研究的体外研究发现，B. vulgatus和B. dorei（最近被重新归类为Phocaeicola）破坏结肠上皮完整性，这种表型与丝氨酸和/或半胱氨酸蛋白酶有关。B. vulgatus的单定植研究和粪便移植研究的结果进一步表明了B. vulgatus丝氨酸蛋白酶在实验性结肠炎中的重要性。在患者样本中，交叉参照B. vulgatus蛋白酶的丰度和B. vulgatus宏基因组丰度，我们得以识别出这些细菌蛋白酶异常高水平的炎症患者子集。有趣的是，最近的一项研究强调，B. vulgatus蛋白酶的基因组存在以及粪便蛋白酶活性的增加与UC的发生相关。总之，本研究将B. vulgatus蛋白酶与疾病的开始和疾病活动中的爆发联系起来。此外，本研究还表明，抑制B. vulgatus蛋白酶可能有治疗或预防作用。 本研究存在的几个局限性：（1）在实验中使用了非特异性蛋白酶抑制剂，因此无法区分哪种蛋白酶或哪种蛋白酶对表型最重要；（2）单定植研究没有包括一个额外的对照组来比较蛋白酶抑制治疗反映健康表型的程度；（3）在结肠上皮屏障上使用B. vulgatus上清的实验并没有像共培养中观察到的那样破坏膜的完整性，需要更多的工作来确定本研究所观察到的表型的条件和机制。 结语 本研究通过整合粪便宏蛋白质组学、代谢组学、16S扩增子测序、鸟枪法宏基因组学、宏肽组学和血清蛋白质组学，以及体外和体内验证，证明了微生物组中的某些成员，如B. vulgatus，可能通过蛋白酶活性加剧UC疾病的活动。此外，鉴于本研究的体外和体内实验的前景，为进一步研究拟杆菌属蛋白酶抑制作为UC治疗方法奠定了基础。  END  参考文献： [1]  Mills, R.H., Dulai, P.S., Vázquez-Baeza, Y. et al. Multi-omics analyses of the ulcerative colitis gut microbiome link Bacteroides vulgatus proteases with disease severity. Nat Microbiol 7, 262–276 （2022）. https://doi.org/10.1038/s41564-021-01050-3 

撰写丨ShyRu 编辑、排版丨SX