无需PAM序列的新型Cas9，可在任意位点精确切割DNA，让分子克隆告别限制性内切酶

撰文丨nagashi

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

如果你在分子生物学实验室呆过一段时间，那么你就会发现冰箱里总是装满了用于实验的限制性内切酶。 这些酶可以识别特定的DNA序列 （例如 BamHⅠ内切酶的酶切位点为GGATCC） 并将其切割，这也导致可能需要好几种甚至几十种限制性内切酶才能完成常规的分子克隆试验。

令人兴奋的是，来自哈佛医学院/麻省总医院的  Benjamin Kleinstiver  研究团队的一项最新研究，有望彻底淘汰掉这些繁杂冗余的限制性内切酶。

因为CRISPR-Cas核酸酶以可编程的方式裂解DNA，在体外分子应用方面比限制性内切酶更有优势。

该论文以： Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests  为题，发表于 Nature Biotechnology 期刊。

该研究开发了一种无 PAM 序列要求的 CRISPR-SpCas9 突变体——SpRY，可以在基因组上几乎任何序列上切割 DNA，成为取代限制性内切酶的强力竞争者，并将拓展 CRISPR-Cas9 基因编辑技术在任意 DNA 序列上的应用。

近年来，CRISPR 基因编辑技术发展迅猛，并显著改变了基因编辑领域的格局，为科学家们自由操纵基因提供了前所未有的简便和高效的工具，但当前的 CRISPR 技术并非完美无缺，仍存在一些局限性，并面临许多挑战。

例如，目前最常使用的基因编辑系统 CRISPR-SpCas9，野生型 SpCas9 识别的基因组上的序列需要有一段短DNA序列——间隔序列前体临近基序 （protospacer adjacent motif， PAM ） 。这也导致一个尴尬的情况，当我们要编辑的基因组序列附近没有可识别的 PAM 序列时，SpCas9 将无法识别我们要编辑的目标基因组序列，也就无法执行后续的基因编辑任务。

早在2020年，Benjamin Kleinstiver 团队就在 Science 期刊发表论文，尝试构建了首个几乎 可以识别整个基因组序列的 spCas9 突变体——SpRY，它不再需要特定的 PAM 序列才能编辑 DNA。他们发现，在人类细胞中，SpRY 更喜欢含有 NRN PAM 的位点，而对含有 NYN PAM 位点的识别靶向能力较弱， （N=任意碱基，R=A或G，Y=C或T） 。

从那时起，Benjamin Kleinstiver 团队意识到，除了在人类细胞中编辑 DNA 外，SpRY 还可以做很多事情。在这项发表于 Nature Biotechnology 的最新研究中，研究团队探究了 SpRY 在分子克隆上的应用，使得 DNA 操作更简单，不再受到序列的约束。

通讯作者Benjamin Kleinstiver（左），第一作者Kathleen Christie

研究团队在体外测试了 SpRY 的 DNA 切割能力，通过使用超过130个 gRNAs 对多种 PAM 进行 SpRY DNA 降解 （SpRYgests） ，他们惊讶地发现它基本上没有 PAM 序列的要求，可以在几乎任何序列上切割 DNA，包括野生型 SpCas9 的难切割位点。这一发现克服了在任意特定碱基上切割 DNA 的障碍。

SpRY 酶体外裂解效率的表征

Benjamin Kleinstiver 团队设想了一个精简的 SpRYgests 工具包：用户可以根据自己的目标序列设计相应的 gRNA，然后将其加入到反应体系中，SpRY 就可以识别该序列，并在特定的位点上切割 DNA，从而可以自由操纵基因。

简而言之，在未来，我们可以将如今分子生物学实验室常用的限制性内切酶彻底淘汰掉，只需要一种SpRY即可完成所有的分子克隆实验。

通过SpRYgest进行分子克隆

不仅如此，SpRYgests 还将简化和加快更复杂的克隆方法，如构建饱和突变库。在当前，让公司合成这些库可能非常昂贵——要花费数千到数万美元，但 SpRYgests 可以在几天内生成这些库，且只需几十美元。

此外，除了分子克隆，SpRYgests 解锁了在基因组中任意特定位置切割 DNA 的能力，这可以用于 DNA 文库构建、下一代测序等应用上。

通过SpRYgest快速生成饱和诱变文库

总的来说，这项研究展示了一种无 PAM 序列要求的 SpCas9 突变体——SpRY，它可以在体外高效地切割任意 DNA 序列，在分子克隆领域展现出强大的应用潜力，为科学研究带来便利和效率！

论文链接 ：

1.https://www.nature.com/articles/s41587-022-01492-y

2.https://www.science.org/doi/10.1126/science.aba8853