【产麻新谭】母体免疫激活引起的神经元周围基质网络缺失介导子代青春期认知功能损伤

南京医科大学附属妇产医院

背景  

孕期感染在妊娠期产妇中十分常见，对产妇健康及子代发育均存在不可忽视的影响[1-2]。最近的流行病学及临床研究证实，感染诱导的产前母体免疫激活（MIA）是子代神经发育的危险因素[3-4]。动物实验也表明，MIA可导致子代神经发育障碍性疾病，如自闭症、癫痫和精神分裂症，常表现出认知功能损伤[5-7]。尽管有大量证据表明MIA对子代认知功能存在不利影响，但其潜在机制仍知之甚少[8-9]。因此，探索MIA子代神经-分子改变并分析这些变化与子代远期，尤其是青春期，疾病发生的关系尤为重要。  

青春期是子代神经系统发育、成熟的复杂阶段，也是引起神经-认知障碍的易感时期[10]。海马GABA能系统是青春期易感性的关键因素之一[11]。在GABA能系统中，被PNN包裹的PV+中间神经元是最主要的亚型[12]。PNN是一种特殊的细胞外基质，对PV+中间神经元起到保护和调节作用。在出生后，PNN的形成、成熟与GABA能系统的发育相一致[13]。有证据显示，PNN表达异常和PV+中间神经元成熟障碍是认知功能损伤的基础[14]。据我们所知，目前尚未有研究探索LPS诱导的MIA对子代海马PNN和PV+中间神经元的直接影响，且这种影响对MIA相关认知结局的关系也不清楚。  

本研究的旨在验证MIA对子代青春期认知功能的影响并分析潜在机制。我们在通过LPS模拟孕期MIA；评估了子代青春期海马PNN、PV+中间神经元的变化及神经炎症反应，并探索这些变化是否是MIA导致认知损伤的基础。  

该研究由南京医科大学附属妇产医院麻醉科于2022年7月发表于Behavioural Brain Research杂志。  

材料和方法  

动物与MIA造模  

8-10周龄的C57BL/6J雌鼠和雄鼠在适应一周后开始实验。根据既往研究，于妊娠15天（GD15）通过腹腔注射LPS 120μg/kg建立MIA小鼠模型，分为CON组（n=16）和MIA组（n=16）。造模后4h，每组6只孕鼠安乐死，采血检测血浆IL-6水平。剩余孕鼠每日监测体重直至分娩并记录幼仔数量。鉴于雄性子代对产前母体细菌感染的高易感性，本研究以雄性子代作为实验对象。  

MIA造模后母体血浆炎性细胞因子检测  

使用ELISA试剂盒测定血浆IL-6水平。根据说明书，每孔加入100μL样品，37℃孵育1.5h，然后加入100μL生物素化抗体，37℃孵育1h，洗板5次后加入读取液，上机测定吸光度。每个样本进行复孔检测，以获得IL-6的平均浓度。  

实验流程  

实验1：每组选取10只子代（每窝不超过一只）用于行为学测试。在PD35-37天进行旷场（OF）、高架十字迷宫（EPM）和新物体识别 （NOR）实验。每组随机选取8只未接受行为学测试的子代（每窝不超过1只），在PD37天取材行免疫荧光检测。同样的方法，每组选择8只子代行蛋白印迹检测。  

实验2：CON组选择16只子鼠（每窝不超过2只），随机分为Sham组（n=8）和ChABC组（n=8）。在PD 30，双侧海马CA1区注射ChABC或等量磷酸盐缓冲液，分为ChABC组和Sham组。随后，在PD35-37行上述行为学测试，随后取材验证PNN的降解情况。  

行为学测试  

OF在一个40 cm×40 cm×40 cm的白色平台中进行。该装置均分为16格（4×4），中间4格定义为中央格。每只小鼠单独在平台中自由探索5min。摄像头自动记录小鼠运动总距离以及中央格停留时间，以此评估其运动能力和焦虑样行为。EPM由一个中心区域连接两个相对的开放臂（35 cm×5 cm）和两个相对的闭合臂（35 cm×5 cm×15 cm）组成。每只小鼠单独放入中心区域且面对同一闭合臂自由探索5min。摄像头记录小鼠运动轨迹，计算小鼠开放臂进入次数百分比及停留时间百分比用以评估焦虑样行为。NOR开始前小鼠在平台上连续适应两天，每天10min。训练阶段，两个相同的物体（A+A）放在平台对称的角落，小鼠自由探索10min。间隔1h后进行测试，将熟悉物体（A）和新物体（B）放于平台对应角落。小鼠自由探索5min，自动记录每个物体的探索时间。探索定义为小鼠鼻子对着物体，距离≤2cm，用鼻子嗅或接触物体。在物体上面转身、坐着或攀爬不属于探索。使用以下公式计算测试阶段的“偏好比”：偏好比=新物体探索时间/（熟悉物体的探索时间+新物体的探索时间）。  

免疫荧光  

小鼠经心脏灌注PBS及4%多聚甲醛（PFA）后收集脑组织，固定在4%PFA中。3μm的脑组织切片用3%牛血清白蛋白在37℃下封闭0.5h，随后加入下列一抗4℃孵育过夜：兔抗小清蛋白（PV; 1:100），兔抗钙离子结合蛋白-1（Iba-1;1:200），兔抗神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP; 1:200）。用植物凝集素染料-紫藤凝集素（WFA; 1:500）标记PNN。PBS洗涤三次后，用合适二抗或链霉亲和素Alexa Fluor488结合物（1:500）在37℃下孵育1h。在室温下加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色。通过荧光显微镜获得切片的显微图像。由一名对不知情分组的研究人员对WFA、PV、Iba-1和 GFAP进行量化分析。  

蛋白印迹  

小鼠海马组织离心后取上清备用。用Pierce™ Rapid Gold BCA试剂盒进行蛋白浓度定量。电泳转膜后，5%脱脂牛奶室温封闭1h，加入下列一抗4℃孵育过夜：兔抗基质金属蛋白-9 （MMP-9; 1:500）和兔抗β-肌动蛋白（1:2000）。TBST中洗涤5次后，加入二抗室温孵育1h。TBST洗涤5次后进行显影。蛋白质条带通过ImageJ软件进行半定量分析。每个样本分别独立进行三次实验，以获得平均灰度值。  

海马CA1区ChABC微量注射  

小鼠1%戊巴比妥钠（100 mg/kg）麻醉后，固定于立体定位仪中，切皮暴露头骨。按以下坐标：DP, − 2.0 mm; ML, ± 1.5 mm; DV, − 1.5 mm在双侧CA1上方开颅窗。使用Hamilton注射器连接33G针头在双侧海马CA1区注射ChABC（25 u/ml, C3667, Sigma, USA）或等量PBS（0.5μL/侧），注射完后留置针头5min以确保溶液充分扩散。术后予头孢唑林300 mg/kg腹腔内给药预防感染。  

统计分析  

使用SPSS 22.0进行统计分析。正态分布和方差齐性分别采用Shapiro-Wilk和Levene’s检验进行评估。数据分析采用独立样本t检验。所有数据以平均值±标准误表示。P值<0.05为差异具有显著性。  

结果  

孕期LPS暴露对母体的影响  

MIA和CON组孕鼠体重变化在造模后第一、二天具有显著差异（P < 0.001; P < 0.001, 图1B）。两组孕鼠幼仔数量无显著性差异（P = 0.431, 图1C）。与CON组比，MIA组孕鼠血浆IL-6水平显著升高（P = 0.001, 图1D）。   

MIA对子代青春期神经行为的影响  

与CON组相比，MIA组EPM开放臂进入次数百分比和停留时间百分比显著下降（P = 0.024，P = 0.035, 图1G, H）；同时，NOR中MIA组新物体探索时间和偏好比明显降低（P = 0.012，P = 0.023, 图1J, K），然而，两组小鼠OF中央格时间和NOR熟悉物体探索时间无显著差异（P = 0.495，P = 0.420, 图1F, I）。  

MIA抑制子代青春期PNN的表达  

两组小鼠海马PV+神经元无明显变化（P = 0.814，P = 0.864，P = 0.511, 图2C, 3B, 4B）。与CON组相比，MIA组CA1区WFA+细胞密度、WFA+PV+细胞百分比显著降低（P = 0.004，P = 0.002 图2D、E）；而CA3和DG区无明显变化（P = 0.377, P = 0.879，P = 0.452, P = 0.670 图3C、D, 4C、D）。因此，我们推测CA1区PNN缺失和WFA+PV+细胞减少可能与MIA子代认知功能损伤有关。  

PNN缺失可能与MIA子代认知功能损伤有关  

为了证实上述假设，我们在CON组子代CA1区注射ChABC降解PNN（图5A）。结果显示：与Sham组相比，ChABC组CA1区WFA+细胞密度和WFA+PV+细胞百分比降低（P = 0.002，P = 0.006, 图6C, D）。CA1区PV+细胞密度在两组之间无明显差异（P = 0.702, 图6B）。行为学测试中，两组下小鼠OF运动总距离、中央格时间，EPM开放臂停留时间百分比，以及NOR熟悉物体探索时间均无显著性差异（P = 0.489，P = 0.451，P = 0.708，P = 0.191, 图5B, C, E, F）。与sham组相比，ChABC组新物体探索时间、偏好比以及开放臂进入次数百分比均降低（P = 0.035，P = 0.011, P = 0.039，图6G, H）。因此，这些结果提示PNN缺失可能与MIA后子代青春期认知损伤有关。  

MIA诱导子代海马神经炎性反应  

结果显示，MIA和CON组GFAP+星形胶质细胞密度无明显差异（P = 0.288，P = 0.552，P = 0.263，图7D）。然而，MIA组海马CA1、CA3和DG区Iba-1+小胶质细胞明显增加（P = 0.004，P = 0.008，P = 0.001, 图8D）。此外，与CON组相比，MIA组MMP-9的表达显著增加（P = 0.005，图8E, F）。因此，我们推测MIA后长期的海马神经炎症可能与子代青春期PNN缺失有关。  

讨论  

本研究进一步阐述了MIA暴露对子代青春期行为的影响，验证了孕期MIA可导致子代长期认知功能损伤。机制探索发现，CA1区PNN缺失可能介导MIA后代认知功能损伤。此外，小胶质细胞和MMP-9可能是PNN缺失的潜在因素。  

流行病学研究提示，MIA可干扰子代早期大脑发育，增加子代远期神经发育障碍的易感性。动物研究也表明，产前MIA可导致子代行为和精神障碍。近几十年来，在探索MIA对子代神经发育影响的过程中出现了多种不同的动物模型。其中，LPS诱发MIA是既往研究中最常用方法之一。本研究在GD15用小剂量LPS成功地诱导了孕鼠的免疫激活，并在子代青春期发现焦虑样行为和识别记忆损伤。  

青春期精神-认知障碍的高发生率与GABA能系统的病理改变有关。在GABA能系统中，PV+中间神经元与认知的信息加工密切相关。既往研究发现，GD15-16暴露于LPS（100μg/kg）的成年子代，其海马和内侧前额叶皮质PV+中间神经元减少。然而本研究并未发现MIA对子代青春期海马PV+中间神经元的影响。这一复杂结果可能与动物种类、LPS剂量、孕期暴露时间和子代发育窗口等有关。  

PNN可促进PV+中间神经元成熟，进而影响认知相关的行为表现。本研究提示，MIA对海马PNN和WFA+PV+细胞百分比存在不利影响。尽管缺乏LPS研究的直接证据，但有研究表明，在GD15暴露于PolyI:C的子代，在成年早期表现出前额叶皮质PNN以及PNN包裹的PV+细胞百分比的减少。为了验证PNN缺失对认知功能损伤的影响，本研究在正常子代青春期通过ChABC降解CA1区PNN。结果显示，ChABC处理后小鼠出现识别记忆损伤，其表现与MIA子代一致。据我们所知，ChABC通过对硫酸软骨素蛋白多糖（CSPG）中糖胺聚糖链的作用来实现PNN降解。然而值得注意的是，CSPG中枢神经系统的细胞外基质中广泛分布。因此，在本研究中注射ChABC可能具有PNN降解以外的非靶向效应，这也可能影响认知功能。因此，本研究表明，CA1区PNN的缺失可能部分介导了MIA子代认知功能损伤。  

在大脑发育过程中，PNN的重要成分CSPG主要由星形胶质细胞分泌。而降解包括PNN在内的细胞外基质的酶主要由小胶质细胞分泌。MIA对子代的神经炎症有重要且持久的影响。有研究报道，孕期免疫刺激可使子代小胶质细胞和星形胶质细胞持续激活；但也有研究报道不一致的结果。本研究中提示了小胶质细胞和MMP-9的增加；但未见星形胶质细胞的改变。小胶质细胞在PNN重构中的作用在啮齿类动物的研究中已有报道。然而，本研究并未证实CA1区小胶质细胞增多与PNN降解之间的因果关系，这是本研究的一个主要不足之处。因此，在之后的研究中需要采用更特异的方法，如使用药理学方法敲除小胶质细胞，以证实这种关系。  

综上所述，我们的结果表明MIA后代CA1中PNN缺失可能介导了青春期认知功能损伤。同时，小胶质细胞和MMP-9可能与MIA后PNN的缺失有关。本研究为探讨孕期感染对子代神经发育的影响提供了新的视角。

述评

鉴于孕期母体生理、心理的一系列变化，孕期感染在妊娠期产妇中十分常见。孕期感染对子代神经发育存在不可忽视的影响。近年来的流行病学研究证实，感染诱导的孕期母体免疫激活是子代神经发育的重要危险因素。动物实验也表明，MIA可导致子代神经发育障碍性疾病，如自闭症、癫痫和精神分裂症，常表现出认知功能损伤。尽管关于MIA对子代认知功能的影响有较多报道，但其潜在机制仍知之甚少。因此，探索MIA子代神经-分子改变并分析这些变化与子代远期，尤其是青春期，疾病发生的关系尤为重要。

青春期是多种精神-认知障碍发生的关键发育阶段，这可能与PV+中间神经元的病理改变有关。PNN是一种特殊的细胞外基质，对PV+中间神经元起到保护和功能调节作用，进而参与认知相关行为表现。因此，PNN和PV+中间神经元的改变可能是MIA后代的认知功能异常的潜在机制。该研究通过腹腔注射LPS模拟孕期MIA，评估了子代青春期认知相关行为表现，检测了海马PNN、PV+中间神经元的变化及神经炎症反应，并分析了这些变化与MIA后代认知损伤的关系。   该研究发现孕期MIA可引起后代青春期认知功能损伤，并伴有海马PNN表达缺失、WFA+PV+神经元比例降低、小胶质细胞以及MMP-9的增加，而对海马PV+神经元、星形胶质细胞无明显影响。通过ChABC降解正常青春期小鼠CA1区的PNN，可模拟MIA后代的认知功能损伤，提示了CA1区PNN缺失可能介导了MIA后代认知功能损伤。另外该研究提示小胶质细胞及MMP-9的增加可能是PNN缺失的潜在原因。该研究的结果可为进一步探讨孕期感染对子代神经发育的影响提供了新的思路。   编译：颜齐齐   审校：毛明杰，冯善武  

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