科研丨西南交大＆成中医: 双侧脑室内注射Aβ(1-42)建立AD模型后大鼠肠道菌群的显著反应(国人佳作)

2022-10-08 16:25

本研究采用16S rRNA 高通量测序比较分析双侧脑室内注射Aβ(1-42)建立的阿尔茨海默病模型大鼠回肠和结肠微生物群的变化，表明正常大鼠不同肠段的微生物群存在空间异质性。

编译：微科盟yl，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

阿尔茨海默病(AD)是一种常见的神经退行性疾病。越来越多的证据表明肠道菌群与AD密切相关。此外，肠道微生物群在肠道的不同部位有所不同。本研究采用双侧脑室内注射β-淀粉样蛋白(1-42) [Aβ(1-42)]建立大鼠AD模型，研究大鼠的行为、海马Aβ(1-42)沉积和分析各组的回肠和结肠微生物群。本研究观察到模型大鼠有明显的记忆和认知障碍，Aβ(1-42)沉积增多，表明建模成功。通过16S rRNA测序分析，我们发现正常大鼠回肠与结肠微生物在α多样性、β多样性和优势菌群方面存在显著差异，表现出空间异质性。此外，手术和注射Aβ(1-42)会对大鼠的回肠和结肠微生物群造成不同程度的干扰。这些研究结果为AD大鼠肠道微生物群的研究提供了新的见解，并有助于推进通过肠道微生物群干预AD的治疗策略的发展。

论文ID

原名：Marked Response of Rat Ileal and Colonic Microbiota After the Establishment of Alzheimer’s Disease Model With Bilateral Intraventricular Injection of Aβ (1-42)

译名：双侧脑室内注射Aβ(1-42)建立阿尔茨海默病模型后大鼠回肠和结肠微生物群的显著反应

期刊：Frontiers in Microbiology

IF：6.064

发表时间：2022.2

通讯作者：闫智勇，张天娥

通讯作者单位：西南交通大学生命科学与工程学院；成都中医药大学基础医学院

DOI号：10.3389/fmicb.2022.819523

实验设计

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结果

1 手术和Aβ (1-42)注射对大鼠行为的影响

建模后，通过水迷宫实验，评估正常组、假手术组和模型组大鼠的空间记忆能力。根据结果(表1)，正常组和假手术组在平台潜伏期、目标象限停留时间和穿越次数、平台穿越次数等方面均无显著差异。而模型组大鼠的平台潜伏期明显延长(F=3.986，P<0.05)，目标象限停留时间( F = 7.974, P < 0.05, P < 0.01) 穿越次数( F = 7.459, P< 0.01)和平台穿越次数( F= 8.095, P < 0.05, P < 0.01)明显缩短。注射Aβ(1-42)而不是通过手术会对大鼠的记忆和认知功能造成损害。

表1. 手术和Aβ (1-42)注射对大鼠行为的影响。

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2 手术及Aβ(1-42)注射对大鼠海马中Aβ(1-42)含量的影响

水迷宫实验后，探讨手术及Aβ(1-42)注射对大鼠海马Aβ(1-42)含量的影响。正常组和假手术组大鼠海马Aβ(1-42)(pg/ml)水平无明显差异(图1)。相比之下，模型组中Aβ(1-42)的沉积显著增加(F = 48.51，P <0.0001，图1)。

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图1. 手术和Aβ(1-42)注射对Aβ(1-42)含量的影响。n= 6。**** P < 0.0001。

3 手术和Aβ(1-42)注射对大鼠回肠和结肠微生物群多样性的影响

本研究从24个样本中共读取了5,48,256个有效标签，平均每个样本读取了22,844个序列，用于后续分析。随着测序深度的增加，每组样本的物种丰富度增加，稀疏曲线(图2A)和Rank-Abundance曲线(图2B)趋于平缓。测序深度基本覆盖了样本中的所有物种，每个样本中的物种分布也比较均匀。维恩图显示了IN中的1,336个唯一OTU、IS中的763个唯一OTU、IM中的70个唯一OTU、CN中的17个唯一OTU、CS中的33个唯一OTU和CM中的472个唯一OTU。总共有202个OTU在所有组间共享(图2C)。

Chao1指数常用来估计物种总数，Shannon指数常用来评估微生物的物种数量和同质性。正常组和假手术组回肠菌群的Chao1指数(F =44.34，P <0.0001，图2D)和Shannon指数(F =20.67，P<0.0001，P<0.001，图2E)均显著高于结肠微生物菌群；而在模型组中，回肠和结肠微生物群的Chao1和Shannon指数没有统计学差异。在回肠样本中(图2D，E)，假手术组相比于正常组Chao1指数显著降低(F =44.34，P<0.001)，模型组和假手术组之间没有显著差异。三组的Shannon指数没有显著差异。在结肠样本中(图2D，E)，正常组和假手术组的两个指标没有显著差异，而模型组的Chao1(F = 44.34，P< 0.001)和Shannon(F = 20.67，P< 0.01)指数显著高于假手术组。利用非加权Unifrac距离矩阵分析每组样本之间的菌落结构，样本的群落组成越相似，它们在图中的距离越近。结果显示，正常组、假手术组以及模型组的回肠和结肠微生物群明显分离(图2F)。在回肠样本中，正常组、假手术组和模型组的菌群结构明显分离。在结肠样本中，正常组、假手术组和模型组的群落分布相对聚集。这表明正常大鼠的回肠和结肠微生物群存在显著差异，回肠微生物群的物种数量和多样性高于结肠微生物群。手术显著减少了回肠菌群的菌种数量并改变了其结构，但对结肠没有明显影响；注射Aβ(1-42)改变了回肠菌落结构，增加了结肠微生物菌群的种类数和多样性。

87191665011407131 图2. 手术和Aβ(1-42)注射对大鼠回肠和结肠微生物群多样性的影响。(A)稀疏曲线显示了每个样本的物种丰富度随测序深度的变化趋势。(B)Rank-Abundance曲线显示了每个样本中单个物种的丰度与单个物种的类型之间的关系。(C)维恩图显示了每个样本独有的OTU，以及不同样本共享的OTU。不同组中每个样本的16S rRNA测序的α多样性的Chao1指数(D)和Shannon-Wiener指数(E)。(F)β-多样性的主坐标分析(PCoA)显示了不同组中肠道微生物群落的聚类。IN：正常组回肠菌群；IS：假手术组回肠菌群；IM：模型组回肠菌群；CN：正常组结肠菌群；CS：假手术组结肠菌群；CM：模型组结肠菌群。**P < 0.01；*** P < 0.001和**** P < 0.0001。

4 手术和Aβ(1-42)注射对大鼠回肠和结肠细菌群落组成的影响

为了进一步探索回肠和结肠微生物群的变化，在门和属水平上分析了不同肠段群落的相对组成。在门水平(图3)，大鼠肠道中最重要的门是厚壁菌门(从26.56到83.72%)、拟杆菌门(从11.08到39.84%)、变形菌门(从0.45到40.82%)和放线菌门(从0.19到8.91%)。在正常组中，回肠菌群中变形菌(F = 29.41，P< 0.0001)和放线菌(F = 122.3，P< 0.0001)丰度显著高于结肠，而结肠菌群厚壁菌门的丰度显著高于回肠菌群(F = 35.32，P< 0.0001)。假手术组回肠菌群中拟杆菌门(F = 23.71，P< 0.001)和放线菌(F = 122.3，P< 0.01)的丰度高于结肠菌群，而结肠菌群中厚壁菌门显著高于回肠菌群(F = 35.32，P< 0.0001)。回肠和结肠中每个优势门的丰度没有显著差异。此外，在回肠样本中，假手术组与正常组比较，拟杆菌门(F = 23.71，P< 0.0001)相对丰度显著增加，变形菌(F = 29.41，P< 0.0001)和放线菌(F = 122.3，P< 0.0001)显著降低，模型组较假手术组厚壁菌门丰度显著增加(F = 35.32，P< 0.05)，放线菌丰度显著降低(F = 122.3，P< 0.05)。结肠样本中，假手术组厚壁菌门数显著低于正常组(F =35.32，P<0.05)，但模型组优势菌门与假手术组相比差异无统计学意义。

65221665011407266 图3. 手术和Aβ (1-42)注射对门水平细菌群落组成的影响。(A)门水平丰度最高的前50个菌种分布。(B)每组样本中门水平丰度最高的4个优势菌门的分布。IN：正常组回肠菌群；IS：假手术组回肠菌群；IM：模型组回肠菌群；CN：正常组结肠菌群；CS：假手术组结肠菌群；CM：模型组结肠菌群。数据报告为平均值±SEM。*P < 0.05；** P < 0.01；*** P< 0.001和**** P < 0.0001。

在属水平(图4)，大鼠肠道中最重要的是乳杆菌属(从1.68%到56.62%)、拟杆菌属(从0.77%到24.03%)、大肠埃希菌-志贺氏菌(从0.06%到21.91%)、毛螺菌科NK4A136(从1.13到10.94%)。正常组中，结肠菌群中乳杆菌(F =16.61，P<0.0001)和毛螺菌科NK4A136(F =14.27，P<0.01)丰度显著高于回肠菌群，而回肠中大肠埃希菌-志贺氏菌丰度显著高于结肠微生物群(F = 9.586，P< 0.001)。假手术组结肠中乳杆菌的丰度显著高于回肠菌群(F =16.61，P< 0.05)，回肠菌群的拟杆菌丰度显著高于结肠菌群(F=16.61，P<0.05)。 F = 124.1，P<0.0001)。模型组回肠和结肠各优势属的丰度无显著差异。此外，在回肠样本中，与正常组相比，假手术组拟杆菌属显著增加(F =124.1，P<0.0001)，而大肠埃希菌-志贺氏菌显著减少(F =9.586，P<0.01)；与假手术组相比，模型组毛螺菌科NK4A136的丰度显著增加(F =14.27，P<0.001)，而拟杆菌属的丰度显著降低(F =124.1，P<0.0001)。在结肠样本中，与正常组相比，假手术组乳杆菌显著降低(F =16.61，P<0.05)，模型组毛螺菌科NK4A136丰度比假手术组显著增加(F =14.27，P< 0.01)。

LEfSe分析可以在多个组之间进行比较，以找到组间丰度差异显著的生物标志物。利用LEfSe分析进一步识别三组间具有显著差异的物种(图5)，结果相似。在正常大鼠中，变形菌门、放线菌门、大肠埃希菌-志贺氏菌等在回肠中富集，厚壁菌门、乳杆菌等在结肠中富集。在假手术组的大鼠中，拟杆菌门和拟杆菌属在回肠中富集，但在结肠中未发现高丰度微生物群的富集。在模型大鼠中，毛螺菌科NK4A136在结肠中富集。

4021665011407444 图4. 手术和Aβ(1-42)注射对属水平细菌群落组成的影响。(A)属水平上丰度最高的前10个物种的分布。(B)各组样品中属水平上丰度最高的前4个细菌属的丰度分布。IN：正常组回肠菌群；IS：假手术组回肠菌群；IM：模型组回肠菌群；CN：正常组结肠菌群；CS：假手术组结肠菌群；CM：模型组结肠菌群。数据报告为平均值±SEM。*P < 0.05；** P < 0.01；*** P< 0.001和**** P < 0.0001。

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图5. 手术和Aβ (1-42)注射对显著富集物种组成的影响。(A)LEfse分析的LDA评分(LDA > 4.0)，用于显示各组显著富集的物种及其重要程度。(B)LEfse分析的Cladogram图，用于显示在每组样本中起重要作用的物种分支的进化规律。IN：正常组回肠菌群；IS：假手术组回肠菌群；IM：模型组回肠菌群；CN：正常组结肠菌群；CS：假手术组结肠菌群；CM：模型组结肠菌群。

讨论

Morris水迷宫是目前公认的研究啮齿动物空间学习和记忆的经典实验，是评估AD动物模型最重要的行为实验。行为学研究显示，模型组大鼠的水迷宫实验结果与正常组和假手术组相比有显著变化，表明双侧脑室注射Aβ(1-42)损害了大鼠的记忆和认知功能，成功建立AD大鼠模型。此外，模型组海马中Aβ(1-42)含量的显著增加也证实了这一点。

肠道中的微生物群具有空间异质性，不同的肠段观察到不同的群落。之前也有很多关于小鼠、鸡和猪肠道菌群分段分布的报道。在本研究中，我们通过分析正常大鼠回肠和结肠微生物群的α多样性、β多样性和群落组成，发现回肠和结肠微生物群在多样性和物种方面存在显著差异。这些结果表明，正常SD大鼠的回肠和结肠微生物群也呈现出空间异质性，回肠微生物群的物种数量和多样性显著高于结肠微生物群。

在探索AD模型大鼠回肠和结肠菌群差异的过程中，我们发现了一个有趣的现象：正常大鼠回肠和结肠菌群的几个指标存在显著差异，呈现出空间异质性，而仅进行手术组回肠菌群多样性降低、群落结构改变，使得回肠和结肠微生物群之间的差异缩小。Aβ注射模型组大鼠回肠和结肠菌群Chao1和Shannon指数、优势门、属相对丰度无显著差异(1-42)。因此，我们假设手术和注射Aβ(1-42)都会导致肠道微生物群的改变。

肠道菌群失调通常发生在大手术或肠道手术后以及危重患者身上。脑损伤改变了肠道微生物群的组成，降低了肠道微生物的多样性。在当前的研究中，利用假手术大鼠微生物群的变化再次证实了这一现象。此外，研究表明，创伤性额叶敲除性脑损伤可导致肠道结构和功能发生广泛变化，影响肠道通透性。特别是，本研究中的手术显著增加了假手术大鼠中拟杆菌的相对丰度，并显著降低了变形菌和放线菌的相对丰度，这表明这可能与手术对肠道菌群的影响有关。此外，该手术还显著增加了拟杆菌属的相对丰度，并显著降低了大肠埃希菌-志贺氏菌的丰度。

肠道微生物群偏离健康状态被认为是疾病发作和进展的标志。近年来，许多人更加关注肠道菌群与AD的研究。Harach等人发现同龄AD模型小鼠肠道菌群中厚壁菌门、疣微菌门、变形菌门和放线菌门的丰度显著低于野生型小鼠，而拟杆菌门的丰度则显著升高。肠道菌群在调节AD的神经炎症和神经退行性变中发挥重要作用。

由β-淀粉样蛋白(Aβ)组成的老年斑是AD的典型病理变化之一。Harach等人比较了无菌饲养的淀粉样前体蛋白转基因AD模型(APP/PS1)小鼠和常规饲养的APP/PS1小鼠的Aβ含量。他们发现，与常规饲养的小鼠相比，无菌小鼠的Aβ含量降低。此外，他们还将常规饲养的野生型小鼠和APP/PS1小鼠的菌群移植到无菌饲养的APP/PS1小鼠中，发现无菌APP/PS1小鼠的菌群定植于常规饲养的APP/PS1小鼠的菌群。增加脑Aβ病理学，并且Aβ沉积量与常规饲养的APP/PS1小鼠相似，而来自野生型小鼠的微生物群定植在增加脑Aβ水平方面效果较差。这些发现证实肠道微生物群可以影响Aβ的产生和沉积。

本研究发现双侧脑室内注射Aβ(1-42)建立的AD大鼠模型海马Aβ沉积明显增加。同时，与假手术小鼠相比，回肠微生物群落结构发生了显著变化，结肠菌群的数量和多样性也显著增加。因此，我们认为将Aβ人工注入动物大脑中也会导致肠道菌群失调。特别是，注射Aβ(1-42)显著增加模型大鼠回肠和结肠中毛螺菌科NK4A136的数量。毛螺菌科NK4A136是一种产生丁酸盐的细菌，已发现丁酸盐可维持小鼠肠道屏障的完整性，并且与肠道通透性呈负相关。作为微生物群产生的主要短链脂肪酸之一，丁酸盐对于维持胃肠道的健康至关重要，因为它可以增强上皮屏障的完整性并抑制炎症。值得注意的是，毛螺菌科NK4A136丰度的显著增加也突出了其在AD病变中的潜在机制。

结论

综上所述，本研究采用16S rRNA 高通量测序比较分析双侧脑室内注射Aβ(1-42)建立的阿尔茨海默病模型大鼠回肠和结肠微生物群的变化，表明正常大鼠不同肠段的微生物群存在空间异质性。手术和注射Aβ都会对大鼠的回肠和结肠微生物群造成不同程度的干扰。对建模过程中回肠和结肠微生物群的具体变化进行了更深入的分析和讨论，可以为更清楚地了解AD病变的潜在机制提供线索。本研究让我们清楚地了解AD病变对不同肠道菌群的影响，为从肠道菌群角度干预AD提供更多可能。基于脑-肠轴，肠道菌群失调可能对AD的发病机制具有重要意义，手术、Aβ(1-42)注射和肠道菌群紊乱之间的联系有待进一步研究。此外，Aβ(1-42)诱导的AD对雄性和雌性肠道微生物群的影响是否不同还有待进一步研究。