ADC的优化之路

前言

在ADC的设计中，连接子稳定性、药物抗体比(DAR)和药物载荷分布对ADC质量、安全性和有效性至关重要。本文重点介绍关于这些关键质量属性的分析方法和设计策略。集中讨论了硫代琥珀酰亚胺连接子的降解途径，DAR对ADC聚集倾向的影响，以及ADC设计中的考虑因素，如pH和缓冲剂、抗氧化剂、表面活性剂的选择，以及关于冻干配方的问题。

硫代琥珀酰亚胺连接子稳定性

（一）降解机制

由于ADC结构和降解产物的复杂性，很难对连接子的稳定性单独进行研究。用合成的小分子模型化合物S-(N-乙基琥珀酰亚胺)-N-乙酰基-L-半胱氨酸(NEM-NACYS，图1)研究了硫代琥珀酰亚胺连接物的降解，确定了两条主要的降解途径：丁二酰亚胺的水解形成开环结构硫醇化合物存在下的逆迈克尔反应。

图1

模型化合物S-(N-乙基琥珀酰亚胺)-N-乙酰基-L-半胱氨酸(NEM-NACYS)的降解途径：在Michael供体(GSH=谷胱甘肽)存在下的a琥珀酰亚胺水解和b逆Michael反应 在体内外反应中，琥珀酰亚胺都是蛋白质或多肽中天冬氨酸(Asn)脱酰胺和天冬氨酸(Asp)异构化的关键中间体。其中丁二酰亚胺决定反应速度。 即使是在低PH环境下，ASN的脱酰胺化也依赖于氢离子的浓度，在中性和碱性条件下，脱酰胺作用随着琥珀酰亚胺水解率的加快而增强。 与琥珀酰亚胺的水解不同，在没有迈克尔供体的情况下，硫醚键相对稳定，如含硫化合物。逆迈克尔反应的动力学和硫醇交换的程度受迈克尔供体的反应性调节。而硫醚键在琥珀酰亚胺开环时是稳定的，因此即使在Michael供体存在的情况下也不能进行进一步的硫醇交换。 研究模型化合物中硫代琥珀酰亚胺部分的降解机理有助于了解硫代琥珀酰亚胺连接子在ADC中的稳定性。Alley等人报道了半胱氨酸连接的ADC药物自由释放过程中存在一个逆迈克尔交换反应，以形成白蛋白加合物。白蛋白是血浆中主要的含硫蛋白，在第34位有反应性半胱氨酸残基。白蛋白与附着在细胞毒素上的马来酰亚胺反应，形成白蛋白-药物结合物。然而，由于缺乏迈克尔供体，在磷酸盐缓冲的生理盐水中未观察到逆迈克尔反应。 连接子稳定性对ADC的安全性和有效性至关重要。例如TDC含有三种不同类型的单抗，半胱氨酸在每种单抗中的位置（可以是轻链、重链或Fc区）都不同。因此，电荷环境、通过Michael加成反应形成偶联物的溶剂可溶性会不同。在LC区偶联时带正电荷最多，而在FC区偶联时可溶性最大。 比较这三种变体中琥珀酰亚胺的水解度和白蛋白加合物的形成度。LC区正电荷环境中氢氧离子的局部浓度较高，琥珀酰亚胺在LC TDC中的水解速度比在HC和FC TDC中要快得多。 由于硫醚键在琥珀酰亚胺开环时稳定，能防止硫代马来酰亚胺进一步交换，因此LC TDC生成的白蛋白加合物最少。另一方面，Fc TDC变异体具有最大的溶解性，因此大部分白蛋白加合物是通过逆迈克尔反应形成的。 稳定的琥珀酰亚胺开环接头可以大大提高ADC的体内外稳定性和潜在的治疗活性。同时不会引起可逆的迈克尔交换反应。可以通过引入与马来酰亚胺相邻的碱性氨基，来制备一种改良硫代琥珀酰亚胺连接子。以引入一种在室温和中性环境中能对琥珀酰亚胺进行快速碱催化的反应。水解过程能在2h内快速完成。这种类型的ADC抗肿瘤活性和安全性大大提高。

（二）硫代琥珀酰亚胺水解ADC的表征

硫代琥珀酰亚胺连接子，丁二酰亚胺的水解的开环形式会产生额外的电荷，带动其电荷状态和疏水性的改变。鉴定和量化蛋白质中琥珀酰亚胺方法在ADC中也同样适用。用反相液相色谱质谱(rpHPLC-MS)检测血清中完整ADC的硫代琥珀酰亚胺接头水解物。 Schneiderheinze等人依靠一种新蛋白水解酶的专一性，建立了一种快速的Fabrica TOR®(Genovis AB)rpHPLC作图方法。这种酶在铰链区裂解，产生纯F(ab‘)2片段和Fc片段。在质谱学检测下，Fabrica TOR®rpHPLC方法还可以通过分离和定量开环和闭环形式来监测特定部位的硫代丁二酰亚胺水解情况。 另一种分析方法是成像毛细管等电聚焦(ICIEF)，这是一种常见的蛋白质电荷的高分辨率分离方法。为了准确测定iCIEF对硫代丁二酰亚胺连接子的琥珀酰亚胺水解度，必须减去ADC抗体部分的脱酰胺量。图2展示了半胱氨酸连接的ADC及其未结合的单抗前体的iCIEF图谱。

图2

(A)在pH=9条件下孵育48小时的未结合MAb溶液：脱酰胺产生的负电荷变体和(B)在pH 9孵育8、16、24和48小时的半胱氨酸连接的ADC：由脱酰胺化和琥珀酰亚胺水解产生的负电荷

酸性区域iCIEF图谱的不均一性是由于ADC去酰胺化和丁二酰亚胺水解时产生的负电荷造成的。假设电荷变体仅由脱酰胺化和硫代琥珀酰亚胺连接基水解引起，并且每个峰从主峰向酸性区域移动代表一个电荷的增益，可以利用考虑电荷状态和载药量的加权峰面积方法来量化硫代琥珀酰亚胺对ADC的水解作用。

DAR对ADC稳定性的影响

（一）确定DAR和药物载荷的分布

已经使用了多种分析方法来确定DAR（药物抗体比）。只要抗体和药物的光谱最大吸收波长不同，就可以使用一种简便的紫外-可见(UV/VIS)光谱测量方法，来分别确定二者的浓度，以计算平均DAR。该方法适用于半胱氨酸连接的ADC和赖氨酸连接的ADC。 值得注意的是，抗体和药物的吸光度可能会受到缓冲液、离子浓度或pH的影响。疏水作用层析(HIC)也能用来测定半胱氨酸连接ADC的DAR。HIC相对温和，不会影响ADC的结构，因此能测量具有不同DAR的ADC的药物载荷分布。根据每个峰面积的百分比及其各自的药物载荷来计算平均DAR。 用rphplc也可以得到类似结果，就DAR的测定，它是一种比HIC解析度更高的方法。然而，rphplc流动相中存在的有机溶剂和少量有机酸可能会破坏完整半胱氨酸连接的ADC。用还原剂处理，如二硫苏糖醇(DTT) 能对链间二硫键进行完全还原并产生稳定的轻链、负载一种药物的轻链、一条重链和一条连接一到三种药物的重链。根据每个峰面积的百分比及其相关的药物负荷来计算平均DAR。 Fabrica TOR®rpHPLC方法对rpHPLC方法进行了改进。另一种快速、直接测定DAR的方法是LC-ESI-MS(LC-ESI-MS) ，这种方法通过完整的质量测量来识别药物负荷分布，并使用每种物质的峰面积来确定DAR，通常需要去糖基化和去除C-末端赖氨酸的异质性来降低质谱学的复杂性。

（二）聚集性

半胱氨酸和赖氨酸连接的ADC通常会导致与抗体结合的药物分子不均匀分布。抗体链间二硫键非特异性还原生成的半胱氨酸连接的ADC，其结合部位位于巯基。例如brentuximab vedotin。通过抗体赖氨酸残基偶联的ADC，如曲妥珠单抗，其DARs范围为DAR 0至DAR 9。研究表明，由于疏水的细胞毒性药物附着引起的表面性质的改变，或由于药物负载引起的抗体的高级结构的改变，会出现新的分子间或分子内相互作用模式。 因此，与未偶联的单抗相比，这两种ADC更容易聚集。例如，对平均DAR为3.5的半胱氨酸连接的ADC来说，DAR较高的类型(如ADC DAR 6和DAR 8)是热应激条件下产生高分子量物种(HMWS)的主要原因。这些高DAR类型的ADC是不可逆的、非共价的和结构改变的ADC形式。通过差示扫描量热仪(DSC)，推测ADC分子的铰链区/CH2结构域在热应力作用下会丧失稳定性。

图3

平均DAR分别为2、3.5和6的非共轭ADC 1和ADC 1批次的DSC 温度自记曲线 CH2结构域的熔点随抗体平均DAR值成反比。在曲妥珠单抗中也有类似发现，抗体的修饰和结合显著影响了ADC的热稳定性，其中主要影响的是CH2结构域的热稳定性（如图3）。 离子强度也会影响ADC的稳定性。Adem等人发现，随着离子强度的增加，会形成大量聚集物。随着溶液离子浓度的增加，DAR对ADC物理稳定性的影响会加剧。DSC的热诱导展开与药物载量的相关性表明，同一DAR类型，在高离子强度(20 mM组氨酸醋酸酯pH 5.5,100 mM NaC l)溶液中的熔点显著低于低离子强度溶液(20 mM组氨酸醋酸酯pH 5.5；图4)。其他形式的应激也可以诱导聚集，如激动、光照、氧化应激或静脉注射(IV)时稀释成生理盐水，这与大多数单抗对这些应激的反应类似。

图4

离子浓度对半胱氨酸连接的ADC在低离子强度溶液(20 mM组氨酸醋酸酯pH 5.5)和高离子浓度溶液(20 mM组氨酸醋酸酯pH 5.5,100 mM氯化钠)中热稳定性的影响。(图片来自Adem等人。) 聚集可能会影响ADC的安全性和有效性。控制DAR和药物负荷分布可以促进分析表征和设计ADC, 在特定部位含有工程游离半胱氨酸残基的抗体，如tDCs，产生的主要是均一的2-DAR，这为改善ADC的质量和稳定性提供了一种新思路。

ADC药物配方考虑因素

ADC的配方改进与抗体生产过程类似。需要控制ADC产品的其他关键质量属性，如DAR和自由药物的释放，以向患者提供稳定、安全和有效的产品。开发ADC制剂需要综合考虑抗体、细胞毒药物、连接子的稳定性和结合物的特性。

（一） PH和缓冲液

与控制单抗的脱酰胺、裂解、异构化等降解途径类似，配方pH和缓冲液的选择在控制硫代丁二酰亚胺醚连接子的丁二酰亚胺水解中起关键作用。 用模型四肽建立了脱酰胺、异构化和琥珀酰亚胺水解的pH-速率曲线，如图4所示。 从图中可以看出反应对氢氧根离子浓度具有依赖性。在硫代琥珀酰亚胺反应中也可以发现类似的观察结果。已有在较低pH环境下发生脱酰胺化的例子。 随着pH值的升高，天冬氨酸的脱酰胺速率迅速增加，在pH 3~6范围内，天冬氨酸的脱酰胺速率随pH的升高而增加，在pH 7以上无明显影响，在接近相应羧基的表观pKa的pH处有最大值。

图4

四肽(Ac-Gly-x-Gly-NHMe)的pH值曲线：X=天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)或琥珀酰亚胺(Asu)。(图片来自Gieger和Clarke(1987)，Capasso等人) 在不同的温度下，由于溶液中氢氧根离子的变化，缓冲液会影响降解速率。在较高温度下，组氨酸、Tris等碱性缓冲液产生的氢离子比醋酸盐等酸性缓冲液产生的氢离子少。组氨酸缓冲液是商业单抗中最常用的缓冲成分之一，也被认为对ADC聚集提供了更好的保护。然而，由于氧化降解作用，在考虑组氨酸缓冲时需要谨慎。缓冲剂对pH条件和抗体的稳定性都会产生影响。

（二）抗氧化剂

氧化是影响生物药物稳定性的一个主要问题。蛋白质中可氧化的氨基酸残基有蛋氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、半胱氨酸和亮氨酸（通过自由基反应）。 过氧化氢、叔丁基氢过氧化氢(TBHP)、臭氧或紫外线辐射已用于应激蛋白，来预测蛋氨酸或色氨酸残基的氧化潜力。使用自由基生成物2，2‘-偶氮-2-甲基丙酰亚胺盐酸盐(AAPH)构建了一种特异性的、可重现的应激模型，以评估蛋氨酸和色氨酸的氧化倾向。 因为AAPH应激可应用于蛋白质和细胞毒性药物，可以用同样的方法研究ADC的氧化潜力。为了防止蛋白质氧化，通常用蛋氨酸作蛋白质配方中的稳定剂。其他几种抗氧化剂已被审查。部分抗氧化剂不适合用于蛋白质配方，原因如下：

已用螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）或二乙烯三胺五乙酸（DTPA）来防止金属离子引起的氧化。其他药用辅料如甘露醇或蔗糖也展示出一定的抗氧化作用。多元醇是防止物理化学降解的通用稳定剂。甘露糖醇是羟基自由基清除剂，但烷基过氧化物或H2O2除外。蔗糖与甘露糖醇效果类似，只是略逊于甘露糖醇。抗氧化剂作为稳定剂的效用应该在包括ADC在内的各种剂型的候选药物中进行进一步探索。

（三）表面活性剂

非离子表面活性剂，如聚山梨酸酯(PS)20和PS 80，由于其在低浓度、惰性和与蛋白质混合时的长效安全记录，已在生物制药配方中被广泛用作稳定剂，以防止其在制造、运输、储存、甚至在给药期间出现表面吸附和蛋白质聚集现象。 由于DAR分布不均，以及毒性载荷的疏水性，ADC聚集倾向比抗体更高。因此，ADC配方中可能需要更多的PS。给药时评价稳定性也很重要的。

（四）冻干工艺

除了ADC的高聚集倾向外， ADC产品中可能存在过量的游离药物，这可能会带来明显的副作用。出于稳定性的考虑，通常选择冻干工艺，如布妥昔单抗和曲妥珠单抗。

但冻干工艺不是解决所有稳定性问题的“灵丹妙药”。虽然通常认为在干燥环境下可以提高稳定性，但也有关于表面积对蛋白质物理和化学稳定性的影响的研究。结果表面暴露在表面的蛋白质更容易受到损伤，稳定性的提高与表面暴露量呈负相关，特别是在蛋白质含量较低的冻干产品中。

此外，聚集物、冻干产品外观、重建时间和药物释放等经常在稳定性测试中进行评估的关键质量属性，也对ADC冻干工艺至关重要。