科研 | 中国农大: 中国使用抗菌药物50年来，动物源大肠杆菌耐药基因剧增(国人佳作)

导读   

畜牧生产中的抗菌药物使用 与抗菌素耐药性(AMR)的出现和传播有关，但关于牲畜分离株中AMR变化的大规模研究仍然很少。

本研究对1970s至2019年 收 集的982份动物源 性 大肠杆菌样本进行全基因组序列分析，发现每个分离株的AMR 基因(ARGs)数量增加了一倍，其中包括对两种兽用药物(氟苯尼 考 和诺氟沙星)和人用药物(粘菌素、头孢菌素和美罗培南)等重要药物产生耐药性的基因。 

在过去50年中，不相容性组 IncC、IncHI2、IncK、IncI和IncX质粒明显增加，成为ARG传播的 高 效载体。使用同一类 别 甚至不相关类别的抗菌药物 ， 可以共同选择携带多个共存ARG的 可移动遗传元件 。因此， 迫切需要禁止或严格限制在牲畜中使用抗菌药物 ，以减少日益增长的AMR威胁。    

论文ID

原名：   Distinct increase in antimicrobial resistance genes among Escherichia coli during 50 years of antimicrobial use in livestock production in China     

译名：中国畜牧业使用抗菌药物50年来，大肠杆菌耐药基因显著增加   

期刊：Nature Food   IF：20.43   发表时间：2022.3   通讯作者：汪洋 ＆ 沈张奇   通讯作者单位：中国农业大学动物医学院   DOI：10.1038/s43016-022-00470-6                                   

实验设计

结果

1 中国牲畜大肠杆菌种群动态

截至2019年12月，共有982株分离株(450株来自本实验室，532株来自国家生物技术信息中心(NCBI)数据库)来自中国26个省份的牲畜及其养殖环境(图1和补充表1)。大多数分离株来自中国华南和华东地区(n=572)，以肉制品生产为主。分离株从鸡(567)、猪(258)、羊(62)、牛(46)、鸭(4)、鹅(1)和家禽养殖场环境中的苍蝇(44)中收集。所有分离株按时间顺序分为4个时期：1970s-1980s(n=113)、1990s(n=33)、2000s(n=169)和2010s(n=667)。

982株大肠杆菌分离株的系统发育树在测试群体内显示出很大的多样性，并使用 基于贝叶斯模型的种群结构分析确定了9个谱系 （L1-L9，扩展数据图1）。除L2和L5外， 所有谱系都包含来自各个时期的分离株 。8个常见的系统发育组(A、B1、B2、C、D、E、F和进化支I)分别占检测群体的42.97%、37.07%、1.63%、5.60%、4.89%、3.05%、4.68%和0.10%。A组(n=422)和B1组(n=364)占80.04%。选择两个进化支(C1, n=31；C2, n=32)进行进一步分析，因为它们由相对较宽的时间范围和宿主特异性的分离株组成。 1970s-1980s 分离株中，C1和C2进化支的比例分别为62.5%和38.7%。结果表明，ARGs( bla CTX-M 、bla OXA 、bla NDM 、oqxAB、qnrS、mcr 和 floR )和复制子(IncHI2、IncI2、IncX1、IncX3和IncB/O/K/Z)主要存在于C1和C2进化支的晚期分离株中。在1970s-1990s，含有任何这些ARGs和质粒的分离株的百分比分别为0%和3%，而在2000s-2010s分别为80%和70%(补充图1b)。

图1 中国26个省982株大肠杆菌分离株的来源。所有分离株均按采样时间和宿主进行分组。两个饼图显示了分离株的时间和宿主的总体分布；该地图显示了各省的分布情况。

2 多位点序列类型多样性和模式

多位点序列分型将982个分离株划分为226个不同的序列类型(STs)，其中67个分离株具有新的STs(扩展数据图2)。超过一半的STs（54.0%，n=122）由单个分离株代表。在所有四个按时间顺序排列的数据集中，ST10检测频率最高，包含79个分离株(8.0%)。ST48的流行率在2010年之后逐年上升(补充图1)。相反，ST88、ST5086、ST351、ST90、ST345、ST1、ST100和ST56在2000年以前较多，ST156、ST354、ST224、ST101和ST46在2000年以后较多(补充图1)。最近时期更普遍的STs通常具有相对较高的ARG含量(扩展数据图3)，如ST156和ST354分离株的平均ARG计数为23.9，显著高于整体平均值15.0(P＜0.01，补充表1)。

3 泛基因组分析

对982株大肠杆菌分离株的泛基因组分析显示，开放泛基因组中有66 767个基因，且没有显示出达到平台期的迹象(补充图2a)，这表明基因的数量随着样本量的增加而增加。根据mlplasmids的预测结果，Contigs被归类为最可能源自染色体或质粒。使用99%的阈值预测染色体核心基因组包含1724个基因，并鉴定出57 434个附属基因，平均每个基因组有2837个基因(补充表1)。根据染色体泛基因组积累曲线，发现1970s-2000s的分离株更保守（补充图2b），而2010s的分离株似乎具有更开放的泛基因组，这可能是由于更大的空间和宿主代表性。每个基因组的附属基因数量随时间变化，范围从2311到3731不等。1970s-1980s和1990s采集到的分离株的染色体附属基因(均值=2223)高于2000s和2010s采集到的分离株(均值=2152, P<0.001)，而质粒携带的附属基因从1970s-1980s分离株的平均193个增加到2010s分离株的平均292个(P<0.001;补充表1和补充图3)。

质粒复制子标记分析还表明， 质粒数量随着时间的推移略有增加 ，1970s-1980s收集的分离株中，质粒的平均计数为10.0，而2010s收集的分离株中，质粒的平均计数为12.5 ( P ＜0.001，扩展数据图4a)。几种ARG相关质粒，如IncX3、IncX4、IncI2和IncHI2的不相容性组，在2010s的流行率明显高于1970s-1980s(扩展数据图5)。IncX3、Inc2和IncB/O/K/Z质粒在1970s-1980s间很少出现(0-6.06%)，但在2010s收集的分离株中呈上升趋势(14.54-31.78%)。一般来说，不同采样区分离的菌株的质粒谱是相似的。

图2 AMR的时间变化。

a，AMR表型的时间变化（n=450）。不同的颜色代表不同的抗菌剂。这些值列于补充表2中。b，不同采样周期内每个基因组的ARGs数量分布(n = 982)。记录每个周期的平均ARG计数。右边的星号表示使用Wilcox检验的成对周期的P值，***P < 0.001。c，按采样期和宿主分组的ARG流行率(n = 982)。显示了在任何一个采样组中以>5%的流行率检测到的ARG。它们因对不同组抗菌剂的耐药性而聚集在一起，并按左侧的抗菌剂类别着色。

4 AMR、ARG和毒力基因谱的时间变化

对450株大肠杆菌分离株的抗菌药物敏感性试验和对982株大肠杆菌基因组的ARG筛选显示，在近50年的时间跨度内，AMR呈上升趋势(补充表8和图2)。我们观察到对最近批准和/或不太常用的兽药（如氟苯尼考、安普霉素、诺氟沙星和头孢噻呋）以及专门用于人类医学的药物（如氨曲南和美罗培南）的耐药性增加(P＜0.01)（图2a)。基因组分析中，在相应的ARGs中也观察到了类似的趋势(扩展数据图6)。相比之下，自1970s以来普遍使用的抗菌药物(例如四环素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑和氯霉素)的耐药性在整个1970s-2010s仍然相对较高(48.67和79.78%；图2a及补充表2)。因此，相应ARGs的存在也很高（图2c和扩展数据图6）。

我们检测了对β-内酰胺类和霉素类药物的耐药性，它们是人类和/或兽药中的关键抗菌药物。氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸耐药率在1970s-1980s均较低(分别为24.39%和13.41%)，1990s后迅速上升(分别为67.86%和71.43%)，2010s维持在较高水平(分别为72.86%和53.77%)。对头孢菌素和氨曲南的耐药性随着时间的推移而增加(分别从1.22%和1.22%增至52.24%和34.17%)，对美罗培南的耐药性在2010s最为明显(1.01%；图2a及补充表2)。全基因组集中，每个时间组的每个基因组的超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因的平均计数分别为0.24、0.73、0.83和1.16(图3a)；70.37%的分离株(n=691)至少携带1个ESBL基因，各时期的比例由1970s-1980s的22.12%增加到1990s-2010s的69.70-77.66%。总共有28.08%的携带ESBL基因的分离株呈blaNDM阳性(n=194)。尽管中国于2002年禁止在食用动物中使用氯霉素(http://www.moa.gov.cn/ztzl/ncpzxzz/flfg/200709/t20070919_893091.htm)，但氟苯尼考（氟甲砜霉素）仍在使用。氯霉素耐药率保持较高水平，2000s略有下降(60.71-43.26%，图2a)，最常见的氯霉素耐药基因已从catA1变为catB3、cmlA和floR，后者可介导对氯霉素和氟苯尼考的耐药性(图2c和补充表3)。霉素抗性基因的遗传背景分析表明，catA仅与少数编码假定蛋白质的开放阅读框相关，并且可能与IncP质粒相关，而catB，cmlA和floR基因被发现与IncHI2质粒以及其他ARGs相关。

截至2016年，四种氟喹诺酮类药物(诺氟沙星、培氟沙星、洛美沙星和氧氟沙星)禁止在食用动物中使用，粘菌素于2017年4月被禁止作为动物生长促进剂使用。因此，我们使用这两个时间点对分离株进行进一步分组，以研究这些限制如何影响AMR和ARG谱。对诺氟沙星的耐药性在1990s至2000s迅速增加，然后在2010s下降(扩展数据图7a)。同一时期，每个时间组的质粒介导的喹诺酮类药物耐药(PMQR)基因平均计数分别为0.02、0.18、0.45和0.73(补充表3)。oqxAB和qnrS的流行率增加，qnrB和qepA的流行率继续保持在较低水平，aac(6’)-Ib-cr的流行率略有下降(2016年前为19.39%，102/526，2016年后为17.02%，24/141)。相比之下，粘菌素耐药性和mcr-1基因的流行率在2000s期间迅速增加(扩展数据图7b)，但在禁止使用粘菌素作为生长促进剂后，从2010-2016年的44.27% (n=278/628)下降到2017-2019年的23.08% (n=9/39)。

在毒力基因(VG)谱中，大多数分离株被检测为低毒力，769个VGs(补充表3)聚类成16类100组(补充图4)。VGs无明显变化趋势。与鸡分离株相比，猪分离株与粘附、自转运体、侵袭和铁摄取相关的VGs流行率较低。绵羊分离株的VGs水平最高，但ARGs数量最少(图2c)。

图3 全基因组中ESBL和PMQR基因谱的时间变化（n = 982）。

a，采样时间内每个分离株的ESBL基因数量。b，ESBL基因在采样时间内的流行率。c，采样时间内每个分离株的PMQR基因数量。d，PMQR基因在采样时间内的流行率。a和c中每个圆圈的大小对应于分离株的比例（百分比）。blaTEM*仅指产生ESBL的blaTEM基因。

5 兽药总产值与ARGs和VGs的相关性分析

总体而言，不同时期中国兽药总产值(补充表5)与检测出的平均ARG计数呈正相关(rPearson=0.95, P=0.004;图4a)，与平均VG计数呈负相关(rPearson=-0.86, P=0.028;图4b)，与平均质粒相关复制子计数没有相关性(rPearson=0.18, P=0.733;图4c)。我们观察到ARGs和VGs之间没有相关性(rPearson =-0.04, P=0.243)，而质粒复制子数与ARGs (rPearson =0.35, P<0.001)以及VGs (rPearson =0.30, P<0.001;扩展数据图8)之间呈正相关。

图4 抗菌素生产与耐药基因含量的相关性。

a，兽药总产值与基因组检测到的ARGs平均数的相关性。b，兽药总产值与基因组检测到的VGs平均数的相关性。c，兽药总产值与基因组质粒复制子平均数的相关性。CI95%，95%置信区间。

6 ARGs的转移

一些质粒复制子与ARGs相关(图5)，如IncC与AmpC基因blaCMY、IncI2与mcr、IncX3与碳青霉烯酶基因blaNDM、IncHI2与7个抗性基因类。当分析被限制在不同的时间组时，ARGs和质粒复制子的共现在很大程度上保持稳定。IncC质粒是个例外，因为它们在1970s-1990s与甲氧苄啶耐药基因dfrA23相关，但在2000s后与AmpC基因blaCMY相关(扩展数据图9)。ARG遗传背景分析显示，1970s-1990s收集的分离株具有较小的簇，ARG之间的联系较少，而2000s-2010s分离株的ARG区域逐渐更密集(如β-内酰胺酶基因或氨基糖苷类耐药基因)(图6和补充图2)。例如，我们发现catB和cmlA与基因blaOXA-1、blaOXA-10、blaNDM、aph(3’)-XV、ant(2’’)-Ia、aadA和ant(3’’)-Ia，以及PMQR基因aac(6’)-Ib-cr和利福平耐药基因arr共存(图6a-c)。此外，oqxAB操纵子是1970s-1990s检测到的第一个PMQR基因，而2000s出现的aac(6’)-Ib-cr是唯一一个与catB、blaOXA-1和arr等其他ARGs共存的PMQR基因。mcr-1基因总是与IS30家族转座酶ISApl1相关，但其侧翼区域随着时间的推移而多样化。

图5 ARGs与质粒复制子共现。

该算法将错误发现率阈值定义为0.05；显示了从1(蓝色)到-1(红色)的显著成对值(即共现和互斥)。标记为“ARG-ARG”的蓝框显示ARGs的成对共现和互斥性，标记为质粒的红框显示质粒复制子的成对共现和互斥性。用数字标记的金色框表示ARGs和质粒复制子之间的共现和互斥性，这些在左下角进行了标注。

 图6分离株间霉素、氟喹诺酮和多粘菌素耐药基因的ARG共现网络。

a-i，节点表示基因，并被着色以表示ARGs的抗菌类别：红色表示氨基糖苷类药物，蓝色表示β-内酰胺类药物，青色表示甲氧苄啶，绿色表示霉素类药物，粉色表示利福平，黄色表示氟喹诺酮类药物，橙色表示多粘菌素，灰色表示非ARGs。未标记的节点被注释为假定的蛋白质。分离株按采样时间分组：1970s-1990s (n=146, a,d,g), 2000s (n=169, b,e,h)和2010s (n=667, c,f,i)。边根据其连接的节点着色。边宽表示由Roary计算的连接权重。

讨论

本研究提供了一份全国性的监测报告，涵盖了从1970s到2019年从不同食用动物收集的分离株，在上世纪70年代，抗菌药物很少用于兽医学，此后在很大程度上取代了传统中草药。在全球范围内，中国现在是兽用抗菌剂的最大用户之一。AMC在此期间随着人口规模和人均肉类消费量的增加而增加(扩展数据图10和补充表7)。在本研究中，我们观察到兽医AMC与ARGs富集之间存在显著关联，进一步证明在动物中长期使用抗菌药物是AMR的关键驱动因素。

为了解决这一关键问题，中国政府宣布了一系列旨在减少动物AMR的指令。同时，启动了若干AMR监测项目。然而，AMR谱和相应ARGs的总体流行率在2010s并未下降，但呈现出不同的趋势(图2)。在停用粘菌素后，大肠杆菌中粘菌素耐药性的传播显著减少，这与我们之前的研究一致。这种减少可能是由以下因素介导的：(1)mcr介导的脂质A部分的靶向修饰是大肠杆菌中粘菌素抗性的唯一可转移机制，(2) mcr-1的表达可对携带含mcr质粒的大肠杆菌施加相当大的适应性成本，(3)禁止粘菌素作为生长促进剂显著降低了mcr-1的选择压力，(4)观察到mcr基因很少与其他ARGs一起出现在相同的可移动遗传元件上，这降低了其他抗菌剂共同选择的可能性（图6）。

相比之下，禁用氯霉素和四种氟喹诺酮类药物并未导致表型AMR降低或相应ARGs的减少。这可能归因于几个原因：首先，同类别的其他抗菌药物，包括氟苯尼考以及环丙沙星、达诺沙星、恩诺沙星和沙拉沙星(氟喹诺酮类)，仍然用于牲畜，并可能提供了相关的选择压力。其次，其他抗菌药物的共同选择可能导致对霉素类和氟喹诺酮类药物耐药性的持续和传播，例如，本研究中64.1%(91/142)的分离株中PMQR基因aac(6’)-Ib-cr与catB、blaOXA和arr一起位于第1类整合子中。第三，由于通过可移动遗传元件积累了更多的ARGs，直接遗传环境变得越来越复杂(图6)。这些基因可能被动员在一起，暴露于任何一种相应的抗菌药物都可能导致整个基因簇或质粒的共同选择。第四，介导氯霉素和氟喹诺酮类抗性的不同机制的多个可移动抗性基因使得这些抗性性状的丧失比单一抗性机制(如mcr-1)更难。第五，氟喹诺酮类药物耐药通常由特定染色体靶基因(如gyrA、gyrB、parC或parE)中非常稳定的突变介导。第六，氟喹诺酮类药物可进一步诱导突变，导致对其他种类抗菌药物产生耐药性。因此，AMR的流行取决于需要考虑的多个因素，以更好地对抗对特定抗菌剂的耐药性。

另一个阻碍AMR控制的困难是通过可移动遗传元件进行大量水平基因转移。ARGs的获得很大程度上得益于多种可移动遗传元件，其中质粒发挥着关键作用。迄今为止，已有27个主要的质粒不相容性组与肠杆菌科的ARGs相关。在我们的分离株中，经常检测到ARGs和几种质粒复制子类型的共现(图5)。Inc2、IncX3、IncHI2、IncC和IncF类型与ARGs相关，其中一些关联在之前的研究中已被强调。IncF、IncC和IncX质粒类型最近被确定为耐碳青霉烯类大肠杆菌中最常见的类型，而IncI2、IncHI2和IncX4类型通常与mcr-1传播有关。由于ARG的日益流行与这些质粒复制子的检测增加一致(图2c和扩展数据图5)，因此任何AMR遏制都需要缓解这些多重耐药质粒。因此，应进一步探讨抑制其传播的策略。

本研究存在一些局限性。几十年前收集了一些分离株(n=60)，但它们的收集细节(例如，确切位置)已不再可用。除NCBI下载的菌株外，其余1990s收集的分离株(n=28，84.85%)均来自江苏省某养鸡场，可能存在抽样偏差。考虑到对具有特定耐药性和/或ARGs的分离株的测序偏好，来自在线数据库的可用数据也可能导致额外的抽样偏差。然而，鉴于本研究涉及的广泛资源和这些基因组明显的巨大多样性，这种偏差可能很小。

在牲畜中更严格地使用抗菌剂开始成为一种全球趋势。因此，欧盟于2006年禁止使用抗菌生长促进剂(法规(EC)NO.1831/2003)，最近，中国农业农村部发布了一项条例(NO.194)，规定自2020年7月1日起停止使用促生长药物作为饲料添加剂。值得注意的是：(1)抗菌药物在治疗和预防由细菌引起的传染病方面仍是不可替代的，(2)只有健康的牲畜才能为人类消费提供高质量的肉制品，这是一个日益增长的全球趋势。因此，受细菌感染的患病牲畜也需要适当的抗菌治疗，以治愈牲畜并防止致病菌在整个畜群中进一步传播。然而，考虑到抗菌药物会选择特定的耐药基因型，因此设计降低AMR的策略至关重要，该策略应考虑ARG的共存和共转移，以及探索用于人类和动物的不同种类抗菌药物的干预措施。