文献精读 | 中性粒细胞介导的急性炎症反应可防止慢性疼痛的进展

本文由“山中麻署"授权转载

背  景

BACKGROUND

    慢性疼痛降低工作效率、影响生活质量，造成了大量的社会耗费。慢性腰背痛 (LBP) 是最常见的慢性疼痛。LBP 在所有慢性病中的与疾病共存时间最长，且患病率和造成损害是随着年龄的增长而增加的。目前LBP的治疗药物通常针对于免疫系统，包括非甾体抗炎药 (NSAID)、对乙酰氨基酚和皮质类固醇，效果均较有限。尽管人们已经对慢性LBP社会、心理、遗传因素，以及大脑相关病理过程的有了一定的了解，但对其急性疼痛慢性化转变的分子机制和镇痛策略仍不清楚。

    越来越多的研究证据提示，慢性疼痛的病理生理学，涉及神经系统和免疫系统之间复杂的相互作用，即慢性疼痛是一种由神经元和非神经元细胞介导的神经炎症性疾病。循环免疫细胞（如中性粒细胞、单核细胞和 T 细胞）被募集到组织损伤炎症部位，通常还浸润了周围神经中枢和中枢神经系统。这些细胞的激活导致各种炎症介质的表达，包括细胞因子/趋化因子、脂质和蛋白酶，它们既直接作用于外周感觉或中枢二级神经元，又间接作用于其他免疫细胞或局部细胞以调节疼痛。中枢神经系统中的小胶质细胞和星形胶质细胞也以类似的方式发挥作用，导致中枢敏化和疼痛。外周或中央活化的免疫细胞和神经胶质细胞参与了急性疼痛到慢性疼痛的转变 。

    在本研究中，作者在转录组水平研究了外周循环免疫细胞参与LBP急性转向慢性的分子病理生理机制，发现了急性炎症反应对慢性LBP发展的保护作用。接着作者在另一个肌肉骨骼疼痛疾病（颞下颌关节紊乱患者，TMD）的独立队列的队列中重复了上述的发现，并使用啮齿动物的疼痛模型阐明了急性疼痛转变为慢性疼痛的机制。最后，作者通过一个大型人群队列（UK Biobank）了解了背痛与NSAIDs使用之间的关系。

结 果

RESULTS

LBP队列中的差异基因表达

    研究纳入了98名LBP患者，对其急性发作 (t0) 和3个月后随访(t1)两个时间点的外周血进行全基因组转录组测序分析，并根据第二次就诊时疼痛评分将患者分为疼痛缓解组（“R”；n=49）和持续疼痛组（“P”；n=49），两组患者在用药方面无差异。

    在第一次就诊时，R组和P组患者之间未见明显的差异表达基因（图 1A）。到第二次就诊时，在 R组和P组患者之间的全基因组范围内检测到 1700多个差异表达基因（图 1B）。纵向两个时间点比较发现，P组患者两次就诊之间的未有显著差异表达基因（图 1C），而R组前后时间点比较存在超过5500个基因存在表达差异（图 1D）。校正血细胞类型丰度后，以上差异情况仍然存在。通过以上全基因组转录组学分析发现，随着时间的推移，LBP疼痛缓解的患者的血液中存在着活跃的生理变化过程，可能参与了疼痛的恢复。

▲ 图 1

血细胞类型差异

    作者接下来通过多重 RNA 测序检测，追溯了不同时间点和不同组患者的的细胞类型变化（图 2A）。在P组患者中，没有检测到血细胞类型随时间的任何变化（图2，I列）。而在R组患者中，作者发现在两次就诊之间有四类细胞群存在显著数量差异，其中差异最大的为中性粒细胞数量随时间减少（P = 1.4 × 10 -3；图 2B），其他显著差异包括CD8+T细胞数量增加（P= 1.5 × 10-3 ; 图2C）、静息状态NK细胞（P = 1.7 × 10 -3；图2D）和静息状态肥大细胞数量的减少（P = 4.4 × 10 -2；图2E）。

▲ 图 2

    作者还使用 CIBERSORT 的细胞类型表达矩阵，建立了每种细胞类型表达的基因列表。同样，发现t0和t1之间，最大差异为中性粒细胞特异性基因表达的下调。

通路分析

   作者发现许多通路在全基因组水平上存在差异表达，认为活跃的转录过程是疼痛随时间恢复的基础，因此针对于急性期的信号通路变化进行了分析。第一次就诊( t0 ) 时，两组之间比较，发现R组中大部分差异表达的信号通路与细胞活化和免疫反应有关（图 3A，I列）。且随着时间的推移，P组的炎症反应相关通路几乎没有任何变化（图3A ，III列)，R组则随时间明显下调（图 3A，IV 列）。

    R组炎症通路的表达增强可能与白细胞活化、脱粒相关，后者在t0时被显著激活。在白细胞中，中性粒细胞最活跃，其次是巨噬细胞和肥大细胞（图3B，I列）。与血小板或自然杀伤细胞相比，中性粒细胞的脱粒表现出差异最大（图 3C，I 列）。在两组中，中性粒细胞活化和脱粒途径都随着时间的推移而减少，但与P组患者相比，该种减少的现象在R组患者中更为明显（图 3)。

▲ 图 3

在独立队列研究重复上述结果

    作者使用类似设计的前瞻性队列研究再次验证了上述现象（图 S5A）。该队列纳入了颞下颌关节紊乱（TMD）患者，尽管TMD的病理生理学可能与 LBP 不同，但作者认为免疫系统在急性向慢性疼痛转变中的作用是共通的。在第一次就诊时，所有受试者都表现出 TMD的急性症状，而在第二次就诊时，一些受试者的疼痛得到缓解(R)，而另一些受试者疼痛持续存在(P)。同样地，在该队列中，观察到R组受试者外周血全基因组转录本差异表达基因数量多于P组（图 S5 B-C），并且 R组中炎症和中性粒细胞活化和脱粒途径的活性升高（图 S5D）。使用 CIBERSORT 的基因表达输入矩阵，作者确定了100个在中性粒细胞表达显著增高的基因。在LBP和TMD队列中，t0时期，这些基因中的80%在R组中表达更高；而基因中的75%在R组t 0时期表达比t 1时期更高。

▲ 图 S5

    此外，TMD 队列将健康对照和慢性TMD患者进行了比较（图 S6）。与健康对照组相比，R 组在急性期表现出显着更高的炎症反应 （ES = +0.32 > 0, P = 1.1 × 10 -5 ），而 P 组表现响应显著降低（ES = -0.32 < 0，P = 1.3 × 10 -7）。到第二次就诊时，与健康组相比，每个疼痛组的炎症反应显著降低（ R 组P = 3.1 × 10 -4；P组P = 1.1 × 10 -7)。中性粒细胞活化和脱粒通路也同样如此。

    健康对照组相比，慢性 TMD 受试者中性粒细胞活化和脱粒途径上调（ES = +0.19 > 0，P = 1.9 × 10 -2和 3.3 × 10 -2，），P组在t 0 (ES = +34 > 0, P = 4.6 × 10 -7 )时上调的程度低于 R 组。这些结果表明，在肌肉骨骼疼痛的急性期，炎症反应的上调在防止慢性疼痛发展的保护机制中起到重要作用。

▲ 图 S6

炎症反应受损可延长动物疼痛缓解过程

    上述的人类转录组学结果表明，活跃的炎症反应，尤其是中性粒细胞参与调节的炎症反应，有助于缓解疼痛。因此作者假设，抑制这种主动免疫反应，将导致疼痛的延长，并在小鼠中进行了验证。

    实验使用了经典的甾体抗炎药地塞米松和以下三种病理性疼痛造模：坐骨神经慢性压迫性损伤 (CCI)模型、神经生长因子 (NGF) 腰部肌肉注射模型、完全弗氏佐剂（CFA；油中灭活的结核分枝杆菌）的炎症损伤模型。在造模之前和之后的多个时间点评估机械疼痛敏感性。在CCI或CFA后，每天给予地塞米松或盐水载体6天。所有三种损伤均产生机械异常性疼痛，即对诱发机械刺激的超敏反应，在盐水处理的小鼠中分别持续约 30 至 60 天（时长取决于疼痛模型）（图 4、A、D 和 G）。在CCI组，类固醇治疗期结束时，后爪异常性疼痛没有变化（t 11 = 0.5，P = 0.63；图 4B），这正如预期，因为 CCI 不会产生后爪炎症。相比之下，地塞米松在注射后第 6 天对NGF（ t 10 = 2.4，P = 0.04；图 4D）和 CFA（t 13 = 3.0，P = 0.009；图 4H ）产生了强效的抑制异常性疼痛作用。然而，在三组疼痛模型中，使用地塞米松的动物出现疼痛延迟恢复（CCI组t 11 = 2.3，P = 0.04；图 4，A 和 C）、（NGF组 t 10 = 2.5，P = 0.03；图 4，D 和 F）、（CFA组 t 13 = 2.7，P = 0.02；图 4，G 和 I），即类固醇治疗增加了疼痛的持续时间，在 CFA 后平均增加了两倍。为了评估是地塞米松的抗炎作用还是单纯的镇痛作用导致了这种延长，作者测试了其他四种药物：非甾体抗炎药双氯芬酸，以及三种没有已知抗炎作用的镇痛剂：全身给药的加巴喷丁和吗啡，以及外周给药的利多卡因。所有四种药物在给药期间均减轻了异常性疼痛（F 4,49 = 6.1，P < 0.001；图 4，J 和 K），但只有双氯芬酸显着延长了由 CFA 产生的总体异常性疼痛发作的持续时间（F 4,49 = 7.5，P < 0.001；图 4，J 和 L）。双氯芬酸还能够延长 CCI 引起的异常性疼痛的持续时间（t 13 = 3.0，P = 0.01；图 S7）。

▲ 图 4

    为了直接评估中性粒细胞在疼痛生理的相关作用，作者首先使用抗Ly6G 抗体，特异性但不完全地去除中性粒细胞。虽然使用该抗体急性消耗中性粒细胞不会影响机械性异常性疼痛，但长期使用该抗体会加剧异常性疼痛（第 9 天：t 10 = 2.4，P = 0.04；图 5，A 和 B）并延长疼痛持续时间（t 10 = 8.7，P < 0.001；图 5，A 和 C) ，其模式与地塞米松相同。接下来，作者通过中性粒细胞或中性粒细胞释放的蛋白质 S100A8 或 S100A9 注射到地塞米松处理的小鼠的后爪（与 CFA 注射同侧）中，以此确定地塞米松效应是否依赖于中性粒细胞。尽管给予了地塞米松，中性粒细胞注射或注射 S100A8 或 S100A9 还是可以完全阻止异常性疼痛的进展（与地塞米松注射组比较：F 3,24 = 8.7，P < 0.001；图 5，D 和 E ）。在没有地塞米松的情况下，中性粒细胞和 S100A8/A9 均不会显着影响 CFA 异常性疼痛的持续时间（F 15,130 = 1.1，P = 0.36；图 S8）。

▲ 图 5

人群研究中的镇痛药使用

    最后作者在英国生物银行项目（UK Biobank project）的大型人群研究队列中，探究了镇痛药物使用与背痛之间的关系。作者假设抑制炎症的药物可能会干扰自然恢复过程，从而增加慢性疼痛的几率。结果作者发现在使用 NSAID后，急性背痛患者发生慢性背痛的风险高1.76 倍 ( P = 2.0 × 10-5；图6模型1)。

    鉴于前文中作者发现中性粒细胞与疼痛最终几句的相关机制有关，作者比较了急性背痛时白细胞数据，发现与预期一致，疼痛急性期的中性粒细胞百分比与慢性背痛呈负相关（OR = 0.98；P = 0.02）（模型6）。

总  结

CONCLUSION

    本研究通过临床和动物实验发现，抗炎药物的使用与急性转向慢性疼痛风险相关，提示持续性的抗炎药物可能对疼痛治疗起着消极的作用。

原始文献：

Parisien, Marc, et al. "Acute inflammatory response via neutrophil activation protects against the development of chronic pain." Science Translational Medicine 14.644 (2022): eabj9954.

打赏