科研丨中国农大: 纳米硒在镉胁迫下通过招募根际有益微生物和分配信号分子水平来整合土壤-辣椒植物平衡(国人佳作)

导读  

目前大多数研究都集中在镉(Cd)胁迫下响应外源硒的代谢途径的调节上，而不是土壤和辣椒植株中关键因子的变化。本研究利用根际土壤和辣椒植株的代谢组学和微生物多样性研究了纳米硒干预下环境变量、微生物、代谢途径、硒和镉形态的相关性。土壤中硒(Se)的主要形态为Se(VI)和SeCys，而与对照相比，纳米硒(5和20 mg/L)处理的根、茎、叶和果实中的主要成分是SeMet和MeSeCys。纳米硒强化显著增强了土壤酶、代谢物(荧光素二乙酸酯、脲酶、油菜素内酯和对羟基苯甲酸)和植物代谢物(芦丁、木犀草素、油菜素内酯和脱落酸)。纳米硒的生物强化可以促进根际土壤中的Gammaproteobacteria、Bacteroidia、Gemmatimonadetes、Deltaproteobacteria和Anaerolineae等有益微生物。微生物群落的变化与环境指数、酶、土壤代谢物、硒形态密切相关，从而降低了辣椒植株中镉的生物有效性和积累。综上所述，纳米硒的应用通过改善土壤质量和分配根际土壤及辣椒植株中的信号分子水平来整合土壤-植物平衡。

原名：Nanoselenium integrates soil-pepper plant homeostasis by recruiting  rhizosphere-beneficial microbiomes and allocating signaling molecule levels under Cd stress

译名：纳米硒在镉胁迫下通过招募根际有益微生物和分配信号分子水平来整合土壤-辣椒植物平衡

期刊：Journal of Hazardous Materials 

IF：14.224

发表时间：2022.3

通讯作者：李佳奇，潘灿平

通讯作者单位：中国农业大学理学院

实验设计

1. 根际土壤化学性质 

纳米硒(Nano-Se)干预后Cd对土壤化学性质的影响见表S2。与对照(CK)相比，Nano-Se处理未显著改变土壤的pH值、阳离子交换量(CEC)和亚硝酸盐氮水平。与对照(CK)相比，Nano-Se浓度的提高增加了OM和氨。纳米Se5(nano-Se5)和纳米Se20(nano-Se20)提高了OM(6/24%)和氨(95/530 %)的含量。它们还使土壤中的硝态氮水平分别提高了127%和87%。 

2. 硒和硒的形态 

图1A-J显示了不同处理下土壤、根、叶和果实中硒和硒形态的浓度。Nano-Se浓度的增加显著提高了土壤和地上部分的硒水平(图1A、B和C)。测定根际土壤和辣椒植株中Se(IV)、Se(VI)、SeMet、SeCys和MeSeCys的浓度。从图1D和E可看出，Se(VI)和SeCys是土壤中Se的主要形态。随着辣椒根部和茎部Nano-Se浓度的升高，硒形态的形成水平为SeMet＞Se(VI)＞MeSeCys。Nano-Se(5和20 mg/L)显著改变了辣椒叶(SeMet＞MeSeCys＞Se(VI)＞SeCys)和果实(SeMet＞MeSeCys＞SeCys＞Se(VI))中硒形态的顺序。

图1 Cd胁迫下，不同Nano-Se配比

(0、1、5、20 mg/L)对根际土壤和辣椒植株(根、茎、叶和果实)中硒(A-C)和硒形态(D-J)的影响。这些处理的不同字母表示P＜0.05的显著差异。RS：根际土壤；R：根；S：茎；L：叶子；P：辣椒；R/S/L/P(1、2、3、4)：根/茎/叶/辣椒(CK、nano-Se1、nano-Se5、nano-Se20)。

3. 镉和镉的形态 

辣椒植株不同处理的根、茎、叶和果实中Cd含量及形态见图2A-K。辣椒植株中Cd浓度的降低顺序为根＞茎＞叶＞果实。与对照处理相比，施用Nano-Se(5和20 mg/L)显著提高了辣椒根部的Cd水平，同时降低了辣椒组织(茎、叶和果实)中的Cd浓度。施用nano-Se5和nano-Se20后，与对照相比，植株根部Cd浓度分别增加28%和24%，茎部减少19%和20%，叶片减少27 %和25%，果实减少29%和28%。由图2E可知，果实Cd的浓度显著低于根、茎、叶，说明Cd主要积累在根、茎、叶中。

为了分析根际土壤中的总Cd含量和形态，研究者分析了不同处理对五种镉形态浓度和分布的影响(图2F-K)。酸可萃取、可还原和水溶性部分代表生物可利用Cd，但残留和可氧化部分代表土壤中固定化Cd。土壤中的Cd含量受到Nano-Se生物强化的影响。在土壤中施用Nano-Se5和Nano-Se20显著降低了酸可萃取(32/41%)、还原性(32/35%)和水溶性Cd(44/28%)的浓度，但显著提高了残留(44/28%)和可氧化部分(27/33%)的Cd，这意味着Nano-Se可以将可用的Cd转化为固定形式。同时，随着Nano-Se浓度的增加，酸可萃取和可还原部分的比例明显下降，而残留部分比例普遍增加。

图2 在Cd胁迫下，不同Nano-Se浓度

(0、1、5、20 mg/L)对根际土壤和辣椒植株(根、茎、叶和果实)中镉(A-E)和镉形态(F-K)的影响。这些处理的不同字母表示P＜0.05的显著差异。RS：根际土壤；R：根；S：茎；L：叶子；P：辣椒。R/S/L/P(1、2、3、4)：根/茎/叶/辣椒(CK、nano-Se1、nano-Se5、nano-Se20)。

4. 土壤酶活性

如图3A-F所示，土壤-荧光素二乙酸酯(FDA)、土壤-脲酶(S-UE)、土壤-多酚氧化酶(S-PPO)、土壤-脂肪酶(S-LPS)、土壤-过氧化氢酶(S-CAT)和土壤-过氧化物酶(S-POD)在土壤中发生了改变。尽管与对照相比，Nano-Se处理对酶活性(S-PPO、S-LPS和S-POD)的影响不显著，但Nano-Se处理后的FDA、S-UE和S-CAT水平明显高于对照。FDA(97和81%)、S-UE(35和29%)和S-CAT(89和40%)的活性高于Nano-Se5和Nano-Se20干预的对照。

图3 镉胁迫下，不同Nano-Se水平

(0、1、5、20 mg/L)对根际土壤FDA(A)、S-UE(B)、S-PPO(C)、S-LPS(D)、S-CAT(E)和S-POD(F)的影响。这些处理的不同字母表示P＜0.05的显著差异。S-FDA：土壤-荧光素二乙酸酯；S-UE：土壤-脲酶；S-PPO：土壤-多酚氧化酶；S-LPS：土壤-脂肪酶；S-CAT：土壤-过氧化氢酶；S-POD：土壤-过氧化物酶。

5. 糖类、黄酮类和酚酸分析 

研究者检测了不同处理下的土壤、根、叶和果实的糖类水平(图4A-D)。随着土壤中Nano-Se浓度(1、5和20 mg/L)的增加，葡萄糖、果糖和蔗糖等糖类化合物显著增强，而岩藻糖水平与对照相比无明显差异。nano-Se1、nano-Se5和nano-Se20分别增加了土壤中葡萄糖(120%、212%和86%)、果糖(0.8、4.6和6.8倍)和蔗糖(76%、90%和67%)的含量。根中岩藻糖、葡萄糖、果糖含量的变化趋势不明显，而蔗糖含量(47%)在Nano-Se(20 mg/L)处理下有所增强。叶片中的岩藻糖和蔗糖含量无明显差异，而果糖含量随着Nano-Se浓度的增加而增加，随后又减少。此外，不同的Nano-Se处理降低了叶片中的蔗糖含量。Nano-Se(1和5 mg/L)处理后葡萄糖和果糖的变化趋势保持上升趋势，但果实中的岩藻糖和蔗糖含量与对照相比没有变化。

研究者测定了土壤、根、叶和果实中黄酮类和酚酸类化合物的水平，包括绿原酸、咖啡酸、香草酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、阿魏酸、芹菜素、芦丁和木犀草素(图4E-M)。与对照相比，Nano-Se处理下土壤中绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、芹菜素、芦丁和木犀草素的含量没有变化。施用Nano-Se(5和20 mg/L)显著提高了土壤中香草酸(68/52%)、对羟基苯甲酸(46/34%)和丁香酸(107/106%)的含量。根中绿原酸、芦丁和木犀草素的含量没有改变，但随着Nano-Se浓度的增加，香草酸和对羟基苯甲酸含量增加。在Nano-Se干预(5 mg/L)下，根中的咖啡酸、丁香酸和阿魏酸等化合物分别增加了36%、30%和118%。在叶片中的这些代谢物中的咖啡酸、香草酸和阿魏酸的含量在Nano-Se处理后没有明显变化。此外，随着Nano-Se用量的增加(1、5和20 mg/L)，对羟基苯甲酸、丁香酸、芹菜素、芦丁和木犀草素的含量增加。与对照相比，果实中的咖啡酸、香草酸、对羟基苯甲酸、丁香酸和芹菜素水平没有显著改变。Nano-Se(5和20 mg/L)的增强提高了果实中阿魏酸(37/55%)的水平。Nano-Se5还显著提高了辣椒果实中芹菜素(39%)、芦丁(1830%)和木犀草素(480%)的含量。

图4 镉胁迫下，不同Nano-Se含量

(0、1、5和20 mg/L)对根际土壤和辣椒植株(根、叶、果实)中糖(A-D)、绿原酸(E)、咖啡酸(F)、香草酸(G)、对羟基苯甲酸(H)、丁香酸(I)、阿魏酸(J)、芹菜素(K)、芦丁(L)和木犀草素(M)的影响。这些处理的不同字母表示P＜0.05的显著差异。

6. 土壤和植物激素分析

如图5A-H所示，土壤、根、叶和果实中的玉米素(ZT)、核糖基玉米素(ZR)、脱落酸(ABA)、油菜素内酯(BL)、表油菜素内酯(EBL)、吲哚乙酸(IAA)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)等土壤和植物激素均发生了显著变化。与对照相比，ZT、ZR、SA和JA的含量不受Nano-Se(1、5和20mg/L)的影响，而Nano-Se5提高了土壤中BL(93%)、EBL(97%)和IAA(76%)的水平。根中ABA、EBL、IAA、SA、JA等代谢物无明显变化，但随着Nano-Se浓度的提高，ZT、ZR、BL的水平显著提高。在叶片中，Nano-Se1和Nano-Se5干预增加了ZR(136/161%)、BL(175/133%)、EBL(191/83%)和SA(110/101%)含量，但ZT、ABA、IAA、JA经Nano-Se处理后无明显波动。辣椒果实中ZT、ZR、BL、EBL、IAA和JA含量无明显变化，而ABA和SA含量通过Nano-Se5显著增加。

图5 镉胁迫下，不同Nano-Se配比

(0、1、5、20 mg/L)对根际土壤和辣椒植株(根、叶和果实)中ZT(A)、ZR(B)、ABA(C)、BL(D)、EBL(E)、IAA(F)、SA(G)和JA(H)的影响。这些处理的不同字母表示P＜0.05的显著差异。ZT：玉米素；ZR：核糖基玉米素；ABA：脱落酸；BL：油菜素内酯；EBL：表油菜素内酯；IAA：吲哚乙酸；SA：水杨酸；JA：茉莉酸。

7. 土壤非靶向代谢组学 

研究者检测了不同Nano-Se浓度(0、1、5和20 mg/L)的土壤，以确定Cd胁迫下的代谢过程(图6A-J)。采用非靶向代谢组学测定代谢物的种类和含量，探索Nano-Se对根际土壤代谢途径的调控机制。基于GC-TOF-MS在不同处理组(T1vs CK、T2 vs CK和T3 vs CK)中检测到68、72和45种代谢物。主成分分析(PCA)表明，不同浓度的Nano-Se处理和对照处理具有不同的趋势，表明Nano-Se的施用显著调节了植物代谢。不同处理的PCA和OPLS-DA模型参数表的R2X、R2Y、Q2如表S3所示。t检验的P值小于0.05，OPLS-DA模型的第一主成分在项目中的变量重要性(VIP)大于1。不同处理的差异代谢物显示在表S4。火山图用来说明上调、下调和无差异代谢物。

对于每组比较组，研究者计算了差异代谢物定量值的Euclidean距离矩阵，还通过完全连锁方法对差异代谢物进行了聚类并用热图显示出来(图7)。此外，通过京都基因和基因组百科全书(KEGG)来分析对照(CK)和Nano-Se处理中的物质，发现这些代谢物主要参与脂肪酸生物合成、半乳糖代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成等多种途径。

图6 Nano-Se对不同处理根际土壤变化趋势及差异代谢物的影响

(A：T1、T2、T3 vs. CK；B、C、D：T1 vs. CK；E、F、G：T2 vs. CK；H、I、J：T3 vs. CK)。A、B、E、H：主成分分析(PCA)；C、F、I：验证模型的排列图(PLS-DA)；D、G、J：火山图；T1：Nano-Se(1mg/L)；T2：Nano-Se(5 mg/L)；T3：Nano-Se(20mg/L)。

图7 根际土壤中差异代谢物的热图和KEGG通路成对比较

(A/B)T1和CK；(C/D)T2和CK；(E/F)T3和CK。A、C、E：热图；B、D、F：KEGG通路；T1：Nano-Se(1 mg/L)；T2：Nano-Se(5 mg/L)；T3：Nano-Se(20 mg/L)。

8. 根际土壤微生物群落 

如图8所示，研究者检测了不同处理(0、1、5、20 mg/L)下的土壤根际微生物群落。结果显示：16S群落结构发生了显著变化，表明增加Nano-Se浓度对土壤细菌群落具有调节作用(图8A)。在图8B中，维恩图显示不同组在单个OTU上没有差异。与对照相比，Nano-Se生物强化对土壤根际的Ace、Simpson、Shannon、ACE和Chao1指数没有明显影响(图8C-F)。

图9A中所有处理在纲水平上以Gammaproteobacteria为主，其次是Alphaproteobacteria、Bacteroidia、Clostridia、Gemmatimonadetes、Acidobacteriia、Anaerolineae、Actinobacteria、Deltaproteobacteria和Saccharimonadia，占80%以上，表S5显示了相对丰度排名前10位的物种。热图用于详细说明对照(CK)和Nano-Se处理中前74种微生物属的趋势、分布和丰度(图9B)。与对照相比，Nano-Se可以显著提高这些细菌的丰度。

图9C-D描绘了环境指数(土壤性质、酶和代谢物)与Nano-Se引起的前10种微生物群落结构变化之间的联系。与对照相比，Nano-Se能够显著改善这些细菌微生物的结构和丰度。在图9C中，研究者发现微生物群落结构的变化与Cd(可还原部分、水溶性部分、酸可提取部分、残留部分和可氧化部分)形态、环境指数(OM、硝态氮和氨)和酶(FDA和UE)密切相关。Se(Se(IV)和SeCys)、土壤代谢物(丁香酸、对羟基苯甲酸、BL和IAA)和Cd形态参与了根际土壤微生物群落结构的调控(图9d)。

图8 Nano-Se对根际土壤微生物群落结构的影响。

(A)微生物群落分布统计；(B)β指数的多样性表示根际土壤微生物组成的变化。(C-F)样本中平均纲水平的微生物相对丰度。“*”表示P＜0.05时差异显著。A：CK；B：Nano-Se(1 mg/L)；C：Nano-Se(5 mg/L)；D：Nano-Se(20 mg/L)。

图9 根际土壤微生物群落分布。

(A)前10个细菌门的相对丰度；(B)差异微生物属的热图。(C-D)微生物群落、环境指数、酶、代谢物变量的冗余分析(RDA)。

讨论

已有研究发现硒通过影响土壤特性和光合作用、刺激抗氧化系统、修复细胞结构、调节植物的初级和次级代谢来保护植物免受Cd胁迫。然而，在解释硒为何以及如何限制辣椒植物中Cd的摄入时，很少着重于代谢程序和重要成分的重新平衡。

综上所述，纳米硒(Nano-Se)应用通过改善土壤质量(环境指数、酶活性、微生物群落、代谢物、硒和镉形态)和分配根际土壤和辣椒植株中的信号分子(植物激素和酚酸)水平来加强土壤-植物微环境。 

在用Nano-Se进行生物强化后，根际土壤和辣椒植株中硒的含量和形态发生了显著变化。图1A-J显示了不同处理下土壤、根、叶和果实中硒和硒形态的浓度。

当Nano-Se浓度增加时，土壤和辣椒植株中的硒含量显著增加(图1A、B和C)。

Se在碱性土壤中主要以Se(VI)的形式存在，而在酸性土壤中主要以Se(IV)的形式存在。这两种形式的硒被代谢形成含硒成分，并且在植物内的运输和吸收方面有所不同。

Se(VI)和SeCys是Nano-Se处理土壤中主要的硒类型，前者的浓度高于后者。Se(VI)和Se(IV)可以被植物根部吸收，但它们都不能被Se特异性转运体吸收。Se(VI)通过硫酸盐转运机制吸收，Se(IV)通过磷酸盐转运和水通道蛋白吸收。

土壤还含有大量的有机硒化合物，例如SeCys。

随着土壤硒含量的增加，根、茎、叶和果实中Se(VI)、MeSeCys和SeMet的含量升高。叶和果实中同时存在的SeCys也随着Nano-Se处理显著增加。当植物吸收无机硒时，几种酶的激活会将无机硒转化为有机硒，首先转化为SeCys，然后转化为其他形式，例如SeMet。施用硒纳米颗粒后，植物中硒形态的差异可能与剂量或种类有关，这些可能性需要进一步研究。 在镉胁迫下施用Nano-Se可以改善土壤性质并影响土壤根际中镉的迁移率和生物有效性。

Cd与外源物质组分的络合以及土壤特性(如pH、CEC和OM)的变化与Cd固定的差异有关。

由于Cd2+在较高pH值下的溶解度降低，其在碱性土壤中的迁移率和生物可及性低于酸性土壤。

pH值升高导致土壤中有机组分官能团解离，从而提高了不同Nano-Se浓度下的CEC含量。与对照相比，随着Nano-Se水平的增加，OM含量显著增加。由于预计有机硒颗粒具有与硒氧阴离子不同的迁移率和生物有效性，特定土壤OM的组成和数量会影响OM与Se结合的比例。

OM结合Se分解释放更多生物可利用的Se到土壤溶液中。从图2F-J可以看出，土壤施用Nano-Se会降低有效态(酸可提取、可还原和水溶性Cd)含量，但提高了固定态(残留和可氧化部分Cd)水平。

OM含量高的土壤具有较高的吸附能力，这有助于形成稳定的Cd-腐殖质复合物。施用硒有助于降低镉污染土壤的镉含量，同时也会提高水稻籽粒中的硒含量，因为硒可能会降低镉的生物利用度并限制镉从根部转移到地上部，从而降低水稻中镉的积累。

根据本研究结果，Nano-Se处理提高了根中的镉含量，同时降低了茎、叶和果实中的镉含量(图2A-D)。

Nano-Se处理显著提高了根际土壤中S-UE的浓度(图3B)。在Nano-Se处理的根际土壤中，氨、亚硝酸盐氮和硝态氮等氮代谢途径较对照丰富。有研究发现螯合剂中的氮含量更高，修复效果更高，在螯合剂增强的植物修复中对代谢活性和微生物结构的抑制更少。

根据Shahid等人的说法，在马铃薯中添加硒可以降低镉的积累，有助于最大限度地减少氧化应激并调节碳水化合物和氮代谢，这表明硒抑制植物Cd积累是缓解的直接原因。 根系分泌物包括糖类、脂肪酸、有机酸、氨基酸、激素、类黄酮和酚酸，通过根系释放到土壤中。土壤中的Cd可被根系分泌物螯合结合，抑制植物对Cd的吸收，同时增强对必需养分的吸收。然而，目前大多数研究关注的是土壤或植物中初级和次级代谢物对重金属胁迫/外源干扰的反应，而不是对土壤、根、叶和果实中靶向代谢物的整体调控。

镉胁迫下，各种形式的硒补充可以减少氧化应激，增加光合作用，改善氮或碳水化合物代谢，所有这些都可能是植物中镉积累降低的适应性反应或间接结果。本研究发现Nano-Se不同程度地提高了土壤、根、叶和果实中糖的浓度，特别是土壤中的葡萄糖、果糖和蔗糖(图4A-D)。

目前的研究表明，这些金属的毒性会导致糖的积累，尽管这种积累更多地发生在用Se处理的植物中，但在植物组织中Cd、As和Cd/As积累较少和Se较多的情况下，植物生长得更好。植物通过根间水平的主动和被动运输通道释放次生代谢物，通过植物-土壤界面的化学特性影响它们的分泌。施用Nano-Se显著提高了土壤和根系中的酚酸水平。在叶片和果实中的这些代谢物中，类黄酮和酚酸随着Nano-Se施用量的增加而增强(图4E-M)。Okem等人估计，酚类物质可能会在植物中产生有效的耐受机制，以平衡增加的Cd浓度。在各种Cd方案下，地上部氧化应激的降低和根中次生代谢物的增加有助于植物在早期生长阶段更快地发育并增加生物量。

为了减少镉对可栽培植物的负面影响，植物激素如BR、MeJA、ABA和SA被广泛使用。从图5A-H可以看出，与对照相比，土壤(BL、EBL和IAA)、根(ZT、ZR和BL)、叶子(ZR、BL、EBL和SA)和果实(ABA和SA)中的土壤和植物激素水平显著提高。

我们之前的研究结果表明，Nano-Se提高了辣椒植物对镉胁迫的耐受性，这与辣椒植株中硒/镉吸收和转化、细胞内稳态以及植物激素(BR、ABA和JA)/木质素相关途径的协同控制密切相关。然而，代谢物和植物激素及相关基因主要针对根和叶的变化。

本研究更系统地调查了土壤Cd污染下土壤、根、叶和果实中激素水平的变化。

有趣的是，已在土壤、根和叶中不同程度地检测到BL，它与其他植物激素协同作用以调节植物对Cd胁迫的耐受性。

BL与IAA、SA、JA和ABA等其他植物激素具有协同作用，因此以多种方式调节植物代谢。 植物可以调节根系中与胁迫相关的微生物组，并通过释放根系分泌物来招募潜在有益的根际细菌，以帮助抵抗重金属胁迫。Nano-Se的生物强化显著提高了FDA含量，这是确定土壤质量的有用生化生物标志物。值得注意的是，一些潜在的有益细菌丰度在根际环境中显著增加。

Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Bacterodia、Clostridia、Gemmatimonadetes、Acidobacteriia、Anaerolineae、Actinobacteria、Deltaproteobacteria和Saccharimonadia是在非生物胁迫(重金属、杀虫剂、废水和阻燃剂)下对植物生长、防御和质量有益的微生物。纳米硒的生物增强可以不同程度地增加Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Bacterodia、Gemmatimonadetes、Deltaproteobacteria和Anaerolineae的丰度(表S5)。

环境指数、酶、土壤代谢物(激素和初级和次级成分)、Se和Cd形态都与微生物群落的变化有很大关系(图9C-D)，降低了各种辣椒植物(茎、叶和果实)中Cd生物利用度和Cd积累。

结论

Nano-Se生物强化显著改变了根际土壤和辣椒植株中硒的含量和形态。

Nano-Se的应用显著改善了土壤酶和化感化学物质(脲酶、荧光素二乙酸酯、油菜素内酯、对羟基苯甲酸、吲哚乙酸和丁香酸)以及植物信号物质(芦丁、木犀草素、芹菜素、玉米素、核糖基玉米素、油菜素内酯和脱落酸)。在土壤、根和叶中均测定出BL，并与其他激素(ZT、ZR和ABA)水平协同作用，调节植物对Cd胁迫的耐受性。

Nano-Se处理揭示了大量的有益微生物，包括Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Bacterodia、Gemmatimonadetes、Deltaproteobacteria和Anaerolineae，这些微生物与土壤特性、Se形态和信号分子显著相关，以将有效Cd转化为固定化形式。

综上所述， Nano-Se 的应用通过改善土壤质量和分配根际土壤和辣椒植株中的信号分子水平，限制了镉的吸收和转化，增强了植物的防御能力。

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