科研丨华中大: 多组学分析揭示甘草的微生物-植物-代谢物调控模式 (国人佳作)

导读   甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)是一种欧洲和亚洲广泛用于治疗多种疾病的药用植物，其功效很大程度上取决于甘草苷和甘草酸。野生和栽培甘草功效差异的调控模式在很大程度上仍不确定。本研究收集了野生(WT)甘草以及种植一年(C1)和三年(C3)甘草的根和根际土壤，生成了根的代谢物和转录本数据、根际微生物群数据，并进行了综合多组学分析。我们更新了甘草中所有40 091个基因的基因结构，并基于52个差异表达基因绘制了甘草苷和甘草酸生物合成的路径图，其中与甘草酸生物合成有关的关键基因BAS、CYP72A154和CYP88D6在野生甘草中的表达显著高于栽培甘草。此外，多组学网络分析发现，Lysobacter与甘草酸生物合成所必需的CYP72A154密切相关。最后，我们建立了一个整体的多组学调控模型，证实了根际微生物群落结构在甘草苷积累中的重要性。本研究深入解析了甘草苷和甘草酸的关键调控机制，并为植物关键代谢物与其转录组、根际微生物和环境的相互作用提供了新的见解，对今后甘草的栽培具有指导意义。    

论文ID

原名：Multi-omics profiling reveals comprehensive microbe-plant-metabolite regulation patterns for medicinal plant Glycyrrhiza uralensis Fisch.

译名：多组学分析揭示药用植物甘草的微生物-植物-代谢物综合调控模式

期刊：Plant Biotechnology Journal

IF：13.263

发表时间：2022.6

通讯作者：宁康＆白虹

通讯作者单位：华中科技大学生命科学与技术学院

实验设计

结果

1 甘草代谢组学、转录组学和微生物组学资源的生成 为了调查野生甘草和栽培甘草的基因表达、代谢和微生物谱，我们从代表性位置收集了25个野生、25个C1和25个C3甘草的根系组织和土壤(图1a，补充表S1)。我们使用高效液相色谱法(HPLC)测定每个根样品中甘草苷和甘草酸的含量(图1b)，并对同一根样品进行RNA测序(图1c)。此外，我们对根际和土壤中的微生物进行了16S rRNA测序(图1d)。 我们对野生甘草和栽培甘草进行了比较植物化学分析，以揭示甘草苷和甘草酸的积累，这对于确定药用植物的药用质量至关重要。HPLC实验表明，野生甘草中甘草苷和甘草酸积累量均高于栽培甘草(t检验，p<0.01；图2a,2b)。栽培甘草中甘草苷和甘草酸的含量在C1和C3间无统计学差异。 为了确定所需的生物合成基因是否遵循类似的类型特异性(野生和栽培)表达模式，我们对根组织的转录组进行了测序、组装和注释(图1c)。我们总共从55个样本中获得了2,758,648,920条高质量reads(补充表S2)，产生了4,091个独特的组装转录本(详细信息见方法)。当与之前对甘草基因组的全基因组测序组装和注释比较时，我们发现新增的1052个新注释基因是基于转录组学证据定义基因结构改进的结果，这在之前的研究中没有获得。 改变根系微生物群可以影响甘草的生长和产量。为了更好地了解甘草根系微生物招募的模式，我们对从根际和相关非根际土壤样品中提取的微生物群落进行了16S rRNA测序(图1d)。69个根际样品获得了14,740,616条高质量reads，73个非根际土壤样品获得了14,921,664条高质量reads(补充表S2)，并在这142个样本中获得13,820个操作分类单元(OTUs)。

图1 分析流程概述。三种不同的甘草(野生(WT)、栽培1年(C1)和3年(C3))，每种采集了25个样本。收集甘草植株的地下部分并分为三部分，(a)根系代谢物测序，(b)根系转录组测序，(c)根际和土壤微生物采集和测序。

图2 不同生长状态的甘草代谢物积累的差异。(a)三种类型甘草中甘草苷的积累差异：野生(WT)、栽培1年(C1)和3年(C3)。(b)野生、C1、C3甘草中甘草酸的积累差异。

2 野生与栽培甘草的转录组比较 我们比较了野生、C1和C3甘草的表达谱，并鉴定了8369个显著上调或下调的差异表达基因(DEGs)，其中104个DEGs在这三种类型甘草中显示出不同的表达谱(图3a)。野生甘草和栽培甘草(C1和C3)之间的DEGs数量高于栽培甘草(C1和C3)之间的DEGs数量。与野生甘草相比，C1和C3甘草中分别有3,298和3,450个基因上调，3,094和3,621个基因下调(图3b)。然而，在C1和C3甘草之间仅发现269个DEGs(图3a，3b)。简而言之，野生甘草与栽培甘草之间的表达差异大于不同生长年限的栽培甘草之间的表达差异。功能富集分析显示，DEGs在与次生代谢物合成相关的功能中显著富集，如黄酮类、苯丙烷类和二萜类化合物(图S1a、S1b和S1c)。

为了深入了解次生代谢物特征的分子机制，我们研究了可能参与黄酮类和萜类化合物的P450单加氧酶(CYP450s)和UGTs的生长类型特异性表达模式。我们的研究结果显示，这88个CYP450s在野生甘草和栽培甘草中具有显著不同的基因表达模式，其中20个参与萜类和聚酮化合物的代谢(图3c)。这些编码CYP450的DEGs用于萜类化合物代谢，包括5个甘草酸生物合成基因、3个油菜素内酯生物合成基因、2个二萜类合成基因、1个倍半萜和三萜类生物合成基因，其在野生甘草中的表达高于栽培甘草。另一方面，编码CYP450的DEGs用于类胡萝卜素生物合成，其在栽培甘草中表达更多。类胡萝卜素是重要激素(如脱落酸(ABA))的前体，在应对胁迫时合成脱落酸。有7个编码CYP450的DEGs具有类黄酮生物合成功能，其中2个在野生甘草中表达更高，5个在C1和C3甘草中上调(图3c)。对于UGTs，编码参与类胡萝卜素合成和玉米素生物合成的DEGs在野生甘草中表达下调(图3d)。在新注释的DEGs中，CYP450s中涉及2个新注释基因，UGTs涉及6个新注释基因。这些新注释的CYP450s和UGTs的DEGs可能有助于研究甘草酸和甘草苷生物合成途径。综上所述，CYP450和UGT基因的表达可能积极促进萜类和黄酮类化合物的合成和积累。

图3 野生、C1、C3甘草之间差异表达基因的比较。(a) C1与WT、C3与WT、C3与C1组中差异表达基因的维恩图分析。(b) C1与WT、C3与WT、C3与C1组中显著上调和下调的基因数量(p<0.05，至少2倍的变化)。(c)(d)编码P450s(c)和UDP依赖性糖基转移酶(d)的基因在野生、C1和C3甘草中的表达模式。热图显示log2 (FPKM+1)值。(c)和(d)的热图基于基因的FPKM在行方向上缩放。WT：野生型；C1：栽培一年；C3：栽培三年。

3 野生与栽培甘草间甘草苷和甘草酸生物合成途径的基因表达模式比较 为了解释野生和栽培甘草中甘草苷和甘草酸积累的差异，比较了参与甘草苷和甘草酸合成途径的基因的表达谱。其中一些被发现在野生甘草中表达更高，而另一些则没有(图4)，这意味着它们可能在甘草苷和甘草酸生物合成的调控中发挥不同的作用。 在所有参与甘草苷生物合成的基因中，有27个DEGs在野生、C1和C3甘草中表现出不同的基因表达模式(图4a)。乙酰辅酶A羧化转化为丙二酰辅酶A需要ACC酶的催化，并为此鉴定了一个新基因(HUST_Glyur000019113)。此外，我们还鉴定出一个参与甘草苷生物合成的新UGT编码基因(HUST_Glyur000024239)。甘草苷途径中的许多基因编码相同的酶，但表达方向不同。例如，尽管3个4CL基因在野生甘草中更特异性地表达，但另外4个4CL基因在C1和C3甘草中均上调(图4a)，表明这些基因转录反应的方向和幅度并不保守。尽管如此，野生甘草中编码相同关键酶(包括ACC、PAL、4CL、CHS、CHR、CHI和UGTs)的基因的总体表达水平显著高于栽培甘草(t检验，p<0.05;图4a)，这与甘草苷在甘草中的积累模式一致。这些结果表明，甘草中甘草苷生物合成是通过多种酶的协同作用完成的，这可以解释为什么野生甘草中甘草苷的总含量高于栽培甘草。

甘草酸含量高可能是由于甘草酸途径中编码关键酶的基因恒定且高表达，这些基因在野生、C1和C3甘草中差异表达(图4b,4c,4d)。IPP和DMAPP是形成萜类主干的重要中间体，可通过MVA或MEP途径合成。在我们的转录组数据中，我们发现了编码这两种途径的必需酶的基因，表明这两种途径在甘草中都是活跃的。在MEP途径中，参与IPP和DMAPP生物合成的DXS和HDR在C1和C3甘草中表达较多(图4c)。ISPE编码基因(HUST Glyur000023999)在野生甘草和C1甘草中表达差异不显著，但在C3甘草中表达显著下调。MVA途径中HMGS、HMGR和PMVK的DEGs在野生甘草中的表达较高。这表明，野生和栽培甘草对IPP和DMAPP平行但分隔的生物合成途径的调节可能不同，其中MVA途径在野生甘草中更为活跃。此外，编码FDPS、GGPS、SQS和SQE的参与2,3-氧化角鲨烯合成的DEGs在野生甘草中的表达水平高于栽培甘草。另外，编码BAS、CYP72A154、CYP88D6和UGTs的DEGs参与了甘草酸生物合成的最后阶段，它们在野生甘草中的表达比在栽培甘草中更多(图4d)。这些关键酶基因在野生甘草中的高表达可能会增加主要生物活性成分的积累，从而有助于在治疗实践中发挥根系的功效，这与之前研究表明野生甘草比栽培甘草更有效的结论一致。

图4 甘草苷和甘草酸生物合成的示意图。(a)甘草苷生物合成途径，(b) MVA途径，(c) MEP途径。(d)甘草酸生物合成途径。由差异表达基因编码的酶标记为红色，热图显示每个DEGs的log2 (FPKM+1)值。热图的每一行代表一个基因，每一列代表一个组(从左到右，WT，C1，C3)。热图中的绿色箭头分别表示C3相对于C1的上调(箭头向上)或下调(箭头向下)，而黑色箭头分别表示C1和C3相对于野生的上调(箭头向上)或下调(箭头向下)。条形图显示了编码相同酶的基因的平均FPKM。WT：野生型；C1：栽培一年；C3：栽培三年。

4 激素信号通路相关基因表达模式的比较 激素信号转导通路，如茉莉酸(JA)信号通路、乙烯信号通路、细胞因子信号通路、脱落酸(ABA)信号通路，调节植物生长以响应非生物胁迫和响应微生物的攻击和共生。这些途径在甘草中表达上调有望增强其抗逆性。与野生甘草相比，栽培甘草中与这些信号通路相关的大部分DEGs均上调，尤其是JA和ABA信号通路(图S2)。编码关键蛋白JAZ、AHP、PYR/PYL和PP2C的基因的表达上调可能会促进栽培甘草中茉莉酸、细胞分裂素和类胡萝卜素的代谢。茉莉酸、类胡萝卜素和细胞分裂素的生物合成可能在植物驯化中发挥重要作用，协调植物对胁迫的总体反应。因此，在栽培甘草中，这些激素合成基因的高表达可能导致两种后果：调节生长，以及限制甘草苷和甘草酸的生物合成。 除激素编码基因外，73个DEGs参与了植物-病原体相互作用，并在不同的甘草中具有类型特异性表达模式(图S1，S3)。这些差异表达模式可能代表不同类型的甘草对各自环境微生物的响应。甘草中的这些DEGs可能在抑制病原菌感染中起重要作用。

5 野生和栽培甘草根际微生物的分类特征 植物-微生物相互作用在植物生长中发挥重要作用，本项关于药用植物甘草的研究支持了这一点。植物招募特定的根系相关微生物，这些微生物允许植物将光合产物和根系分泌物输送到其根系微生物组，从而刺激植物的生长和生产力。许多植物根际微生物是有益的，如促进植物生长的固氮细菌(PGPR)，而其他微生物(如病原微生物)对植物生长有害。植物根际从土壤中招募各种微生物，帮助它们应对特定的非生物或生物胁迫。非根际土壤与甘草根际的微生物多样性存在显著差异，非根际土壤微生物多样性高于根际(基于Shannon多样性的t检验，p<0.05；图S4)。根际微生物群落多样性降低表明甘草根际可能选择性地招募非根际土壤中的微生物。C1甘草根际微生物多样性显著低于野生甘草和C3甘草(基于Shannon多样性的t检验，p<0.01；图S5)，但野生甘草和C3甘草之间无显著差异。 不同类型的甘草招募了一组特定的根际微生物。本研究比较了野生甘草和栽培甘草根际微生物的分类特征，以更好地了解不同类型甘草的标志分类群及其生境特征。我们获得了194个不同类型甘草根际微生物的类型特异性标志属(图S6)，反映了甘草的类型特异性根际微生物招募模式。9个植物病原菌属在不同类型甘草中的相对丰度存在显著差异(Kruskal-Wallis检验，p<0.05)，其中大部分在C1甘草中的富集度更高(图S7)。许多标志病原体的富集模式，如农杆菌(Agrobacterium)、节杆菌(Arthrobacter)和链霉菌(Streptomyces)，与植物-病原体相互作用相关基因的表达模式呈正相关(图S8)。在C1甘草中定殖的大量病原菌的胁迫可能会增加参与植物-病原体相互作用的关键基因的表达。 生长状态(野生或栽培，不同栽培年限)在决定招募哪些PGPRs中起着重要作用。在根际微生物群落的物种水平上，我们获得了34个PGPR标志物种，这些物种在野生甘草和栽培甘草中都有富集。代表性PGPRs(如Bacillus badius和Bacillus firmus)在野生甘草中较为丰富(Kruskal-Wallis检验，p<0.05；图S9)，并已被证明通过提高地上和地下生物量对作物产生积极影响。PGPR豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)在C3甘草根际富集(图S9)，可通过产生植物激素和固氮促进植物生长。PGPR Stenotrophomonas geniculate和Streptomyces purpeofuscus已被证明可以通过产生葡萄糖酸通过培养基酸化来调动锌(Zn)，在C1甘草中富集(图S9) 

6 甘草代谢物产生、基因表达与微生物群落的相关性 我们应用加权基因共表达网络分析(WGCNA)来识别共表达的基因模块和共丰度微生物模块，揭示基因表达、微生物群落以及甘草苷和甘草酸生物合成之间的联系。我们鉴定出32个共表达基因模块(图S10a)和10个共丰度微生物模块(图S10b)，其中7个基因模块(基因模块1、2、3、4、5、23和29)和4个微生物模块(微生物模块1、2、3和4)与甘草苷和甘草酸积累、温度和pH呈正相关或负相关(图S10a、S10b)。在这些模块中，5个基因模块(基因模块1、2、3、4和5)中的80个DEGs和4个微生物模块(微生物模块1、2、3和4)中的39个标志微生物与代谢性状和环境因子相协调(图5a)。基因模块1中两个具有保守结构域PF12515和PF03372的共表达DEGs与甘草苷和甘草酸的积累呈正相关(图5a)。基因模块2中的6个DEGs与甘草酸积累呈负相关，表明其在甘草酸消耗中起关键作用。基因模块3中的5个DEGs与pH呈显著负相关(图5b)。编码MEP和MVA途径相关酶的DEGs(如基因模块4中的ACC、HDR、SQS)与其他10个与其他次生代谢物(如类胡萝卜素、油菜素内酯和玉米素)生物合成相关的DEGs共表达(图5a)。基因模块5中参与甘草苷和甘草酸生物合成的DEGs与一组胁迫耐受性相关的DEGs共表达，如AUX/IAA信号通路和病原体防御(图5a)。其中许多参与甘草酸生物合成的DEGs与温度呈负相关，而一些与胁迫耐受性相关的DEGs与温度呈正相关(图5b)，表明甘草在代谢物生物合成和积累的协调中具有复杂的表达调控模式。 然后，我们研究了根际微生物如何影响甘草的基因表达和代谢物积累。环境因子、甘草苷和甘草酸的积累以及参与甘草苷和甘草酸生物合成的基因均与微生物模块1、2、3和4中的标志微生物相关。根际促生菌Lysobacter的相对丰度不仅与温度呈正相关，而且与模块5中共表达的DEGs呈正相关(图5b)。该微生物与激素信号通路相关基因(如PYL、PP2C和CRE1)呈正相关，与参与甘草苷和甘草酸合成的基因(如CYP72A154、CHI和PAL)呈负相关，表明该菌可能在降低甘草苷和甘草酸合成的同时增强激素代谢。 比较分析表明，与野生甘草相比，栽培甘草根际中Lysobacter显著丰富(图S11a)。此外，Rhodoplanes被发现与甘草苷和甘草酸积累均呈正相关，表明其在刺激这些代谢物的产生方面具有潜在作用。与栽培甘草相比，野生甘草中Rhodoplanes的比例过高(图S11b)。虽然关键生物合成途径中的基因与甘草苷和甘草酸的生物合成有关，但此处鉴定的根际微生物也可能在调节甘草苷和甘草酸积累中起重要作用。

图5 微生物-植物-代谢物综合关联的多组学网络。(a)与代谢物和环境因素相关的基因共表达模块。(b) 与代谢物和环境因素相关的微生物共丰度模块。高度相关模块(p<0.05)与一条线相连。 7 生物和非生物驱动因素对代谢物积累的影响

利用结构方程模型(SEM)研究了生物组分(微生物多样性、微生物群落结构和植物基因表达)和非生物因素(温度、pH、生长时间)对代谢物(甘草苷和甘草酸)积累的影响。该模型假设非生物因素(温度、pH、生长时间)可以驱动甘草苷和甘草酸的积累，而生物因素(微生物多样性、群落结构和植物基因表达)也可以间接驱动代谢物的积累。我们的结构方程模型显示，生长时间是甘草苷和甘草酸积累的最重要驱动因素(图6)，这意味着生长时间越长，药理活性成分的含量越高。此外，pH是甘草苷积累的强正向驱动因子，但对甘草酸的积累无显著影响。温度通过改变甘草苷生物合成相关的微生物群落结构和基因表达来影响甘草苷的积累。我们发现，甘草苷的积累与某些基因的表达有关：甘草苷生物合成途径的差异基因表达深刻影响甘草苷的积累，而甘草酸生物合成途径的差异基因表达对甘草酸的积累没有显著影响。这种差异可能与代谢物生物合成和积累的复杂调控有关。这些结果强调了非生物因素(如温度和pH)、微生物群落(结构和多样性)和基因表达如何相互作用影响甘草苷和甘草酸的积累。

图6 显示非生物和生物因素对代谢物积累影响的结构方程模型。如果为正相关，则路径显示为红色，如果为负相关，则显示为绿色。路径宽度对应于左下角所示的显著性程度。

讨论

利用药用植物代谢组学、转录组学和微生物组学资源生产药用生物活性成分的研究仍然缺乏。甘草苷和甘草酸是评估甘草品质的标志性成分，促进这两种主要生物活性成分的积累已成为甘草分子育种的目标。复杂的代谢途径、基因调控网络和根际微生物是提高甘草苷和甘草酸积累的关键。在本研究中，我们测定了野生、1年栽培和3年栽培生长条件下甘草的根系代谢物、对根系转录本进行测序，并对根际和非根际土壤微生物进行了测序。我们利用代谢物含量、基因表达和微生物群落的组合研究了野生和栽培甘草中甘草苷和甘草酸的调控模式，确定了多种基因和微生物对甘草苷和甘草酸代谢的调控。 已经开展了大量的研究来阐明栽培甘草的遗传信息和次生代谢物，野生型为改良栽培植物育种方案提供了遗传多样性资源。我们证实，与栽培甘草相比，野生甘草产生的甘草苷和甘草酸明显更多(图2)。影响基因表达的两个最重要的因素是植物类型和发育阶段。通过进一步的转录组数据分析，我们发现甘草在不同生长类型之间(野生和栽培)、不同栽培时间(栽培1年和栽培3年)之间存在显著的表达差异，尤其是与次生代谢生物合成相关的基因。野生和栽培甘草之间的基因表达差异大于不同生长年限的栽培甘草之间的差异，说明植物类型对基因表达的影响可能大于栽培时间。此外，还揭示了野生甘草与栽培甘草之间甘草苷和甘草酸含量差异的分子机制。与之前报道的数据相比，我们证明了与栽培甘草相比，参与甘草苷和甘草酸生物合成的大部分基因在野生甘草中高表达(图4)。 以往的研究表明，植物驯化通常伴随着次生代谢产物的减少，导致野生植物的质量优于栽培植物，这可以解释为什么栽培甘草中甘草苷和甘草酸的含量以及相应生物合成基因的表达比野生甘草低。在野生甘草中，BAS、CYP72A154和CYP88D6的表达水平较C1和C3甘草高(图4)，这与甘草根中甘草酸的积累模式相对应(图2)。这些基因的低表达可能限制了栽培甘草根中甘草酸的合成。此外，由于其他底物竞争者(类胡萝卜素生物合成途径和二萜生物合成途径)的影响，甘草酸的合成可以受限于香叶基香叶基二磷酸(GGPP)的分支产物。甘草中的3种主要OSC酶是BAS、羽扇豆醇合酶(LUS)和环阿屯醇合酶(CAS)，它们分别负责甘草酸、桦木酸和植物甾醇的分支。LUS、CAS和BAS基因之间的2,3-氧化角鲨烯竞争效应可能进一步抑制甘草酸的产生。植物驯化还释放了甘草中参与病原相互作用和胁迫耐受等防御过程的基因的表达，这些基因在不同类型的甘草中有不同的表达模式。例如，与野生甘草相比，栽培甘草ABA信号通路中PYL和PP2C的表达显著上调(图S2)。因此，提高生物合成途径不同阶段基因的表达，同时抑制竞争途径中基因的表达，可能是一种提高甘草苷和甘草酸产量的有效技术。 本研究还建立了基于高质量转录本组装和注释的甘草更新基因结构，从中我们能够确定与活性成分积累有关的必需基因。我们还在野生甘草中发现了5个高表达水平的CYP450s参与甘草酸的生产。值得注意的是，两个编码ACC和UGT的新注释基因在野生甘草中大量表达(图4)，这两个基因在甘草苷生物合成中发挥着关键作用，为探索甘草苷生物合成调控提供了新的方向。此处揭示的两个基因，以及其他新注释的基因(包括ISPE、CYP450和UGT)被发现参与次级代谢物的合成，这在以前仅使用基因组数据的研究中没有报道过。总之，我们发现了可能编码参与甘草苷和甘草酸生物合成的酶的新基因。因此，我们发现的新注释基因对于进一步研究甘草的药用质量和栽培甘草的改良具有重要价值。这些结果将用于表征与甘草苷和甘草酸生物合成相关的新基因，以及提高栽培甘草中甘草苷和甘草酸含量。 甘草中共表达基因和共丰度根际微生物与甘草苷和甘草酸的积累以及环境因素有关(图5)。之前的研究已经确定了甘草苷和甘草酸合成途径的相关基因，但之前的研究都没有揭示代谢调控途径和微生物相互作用模式。我们的研究在分子水平上揭示了与甘草苷和甘草酸相关的微生物和基因的微生物-植物-代谢物调控网络。参与甘草苷和甘草酸生物合成的关键基因(如CYP72A154、CHI和PAL编码基因)有共表达的趋势，并且与细菌Lysobacter的丰度呈强负相关(图5b)，说明Lysobacter富集可能抑制甘草苷和甘草酸生物合成。与栽培甘草相比，野生甘草根际中Rhodoplanes更丰富，这与甘草苷和甘草酸的积累有关。因此，这些菌群对根的影响可能会对甘草苷和甘草酸合成的整个途径产生更广泛的影响。此外，我们在野生和栽培甘草中检测到许多不同的标志微生物，尤其是PGPR，包括根瘤菌(Rhizobium)、链霉菌(Streptomyces)、亚硝化弧菌(Nitrosovibrio)等，这些标志微生物也与甘草苷和甘草酸的基因表达或积累显著相关。通过操纵根际环境来调控这些PGPRs与甘草的相互作用将极有利于提高甘草苷和甘草酸的产量。 SEM建模使我们能够建立一个多组学模型，该模型描述了甘草的微生物-植物-代谢物综合调控模式(图6)。甘草苷的积累与基因表达、微生物群落结构和环境条件有关。微生物群落结构对甘草苷积累有正向影响，表明调节微生物群落结构可能会改变甘草苷的积累。温度影响甘草苷的积累，通过微生物群落结构和甘草苷生物合成途径的基因表达发挥作用。然而，基因表达和微生物群落对甘草酸积累都没有显著影响。必须强调的是，模型中仍有相当一部分代谢物的累积变化无法解释，这意味着需要对其他因素进行更多的研究。 综上，我们的研究结果表明，甘草的土壤性质、根际微生物群落、基因表达与甘草苷和甘草酸的积累有关，可直接或间接影响甘草苷和甘草酸的积累。在野生甘草中观察到甘草苷和甘草酸生物合成的富集，这可能会提高其药用质量。这一发现应该成为未来微生物-植物-代谢物相互作用研究的关键考虑因素，该研究旨在整合药用植物代谢组、转录组和微生物组，以了解环境因素、根际微生物群落和植物基因表达如何共同影响代谢物积累和药用植物质量。

结论

甘草是一种重要的多年生药用植物，在欧洲和亚洲具有悠久的药用历史，但其微生物-植物-代谢物调控模式在很大程度上仍未确定。本研究收集了甘草在3种不同生长条件下(野生、栽培1年和栽培3年)的根和根际土壤。基于这些样本，我们在代谢物、转录组和微生物组水平上探索了野生和栽培甘草中甘草苷和甘草酸的调控网络。我们首先确定了甘草在不同生长状态下代谢物和转录组水平的差异：我们已经证实，野生甘草中甘草苷和甘草酸的积累显著高于栽培甘草；我们更新了甘草的基因结构，并补充了甘草苷和甘草酸生物合成的路线图；与栽培甘草相比，野生甘草中BAS、CYP72A154、CYP88D6等甘草酸生物合成基因表达上调。其次，基于多组学网络分析，我们对微生物-植物-代谢物的综合关联有了更好的了解。这一发现以根际微生物Lysobacter和Rhodoplanes为例，它们分别与甘草苷和甘草酸的基因表达和积累密切相关。第三，基于SEM模型发现，生长时间对甘草苷和甘草酸积累有正向影响，而根际微生物群落结构对甘草苷积累有较强的影响。 据我们所知，这是首次尝试将代谢物产生、表达谱和微生物群落结合起来，研究它们对甘草药理活性成分的调控模式，并探索生物和非生物胁迫如何影响这种药用植物的微生物-植物-代谢物调控模式。综上所述，挖掘植物代谢组学、转录组学和微生物组学资源，建立微生物-植物-代谢物调控模式，对今后甘草的栽培具有指导意义。