科研丨Nature子刊(IF:30.9): 膳食胆固醇与鼠和人类肠道微生物组相互作用的表征

编译：微科盟梧魚

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

摄入膳食脂类(如胆固醇)可通过产生微生物衍生代谢物来调节肠道微生物群，从而对宿主健康产生影响。尽管这对宿主代谢会产生影响，但肠道微生物组与膳食衍生脂质的特定相互作用数量有限。部分原因是，获得负责分类群的物种水平分辨率具有挑战性，需要通过额外的方法来确定胆固醇-微生物相互作用产生的与健康相关的代谢物。

本研究采用生物正交标记排序序列光谱法探究胆固醇特异性宿主-微生物相互作用。小鼠暴露于一种炔基功能化的胆固醇变体，其粪便样本采用16S核糖体RNA基因扩增子测序，鉴定出了膳食来源的胆固醇相互作用微生物，来自于拟杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属和副拟杆菌属。鸟枪法宏基因组分析提供了膳食来源的胆固醇相互作用微生物的物种水平分辨率，富含胆汁酸样和硫酸转移酶样活性。利用非靶向代谢组学，我们确定了胆固醇通过BT_0416酶以拟杆菌特异性方式转化为硫酸胆固醇。

与野生型小鼠相比，使用缺乏Bt_0416的多形拟杆菌单定殖的小鼠显示宿主胆固醇和胆固醇硫酸盐发生改变，确定了一种先前未被表征的胆固醇微生物群转化和微生物群依赖于宿主表型的机制。

此外，在拟杆菌中发现的一种胆固醇反应型硫酸转移酶表明，膳食依赖机制改变了微生物特异性胆固醇代谢。

综上，本研究确定了大量与胆固醇相互作用的微生物，这对使用特定物种调节宿主胆固醇稳态提供了指导。

论文ID

原名：Characterization of interactions of dietary cholesterol with the murine and human gut microbiome

译名：膳食胆固醇与鼠和人类肠道微生物组相互作用的表征

期刊：Nature Microbiology

IF：30.964

发表时间：2022.8.18

通讯作者：Elizabeth L. Johnson

通讯作者单位：美国康奈尔大学

DOI号：10.1038/s41564-022-01195-9

实验设计

结果

1、分离与膳食衍生胆固醇相互作用的微生物

为了更好地了解膳食胆固醇如何与肠道微生物组相互作用，我们将小鼠暴露于一种改良形式的胆固醇[胆固醇炔烃(CholAlk)]中，该胆固醇已经常用于研究现有系统中的胆固醇代谢，并可使用BOSSS工作流程通过膳食-微生物组相互作用进行追踪(扩展数据图1)。将CholAlk每天灌胃小鼠一周，从盲肠内容物中分离微生物种群。

口服天然胆固醇也可作为在下游代谢组学分析中观察到的由炔修饰引起的脱靶效应的对照。微生物组样本随后被分为两个种群：与CholAlk或任何炔持久性代谢衍生物(Alk+)相互作用的种群；与CholAlk相互作用无效的种群。因此，在体内条件下，我们的Alk+组分包括与膳食胆固醇直接相互作用的微生物，以及膳食胆固醇的宿主(或微生物)修饰，我们将这些统称为膳食衍生的胆固醇相互作用体。为了识别这些群体，我们通过成熟的铜催化“click”环加成反应，用含叠氮化物的AF647标记Alk+微生物(图1a)。荧光显微镜鉴定微生物盲肠内容亚群为Alk+(图1b)。

为了进一步研究膳食中与胆固醇相互作用的微生物特性和代谢能力，我们使用FACS将膳食中与胆固醇相互作用的Alk+菌群与非相互作用的Alk-菌群进行了分类(图1c及补充表3)。为了获得Alk+和Alk-的流式细胞仪分选参数，我们用CholAlk培养了Eubacterium coprostanoligenes(E. cop)，一种已知的能够通过将胆固醇转化为粪甾烷醇与胆固醇相互作用的细菌(扩展数据图2)。显微镜检查证明E. cop吸收了大量CholAlk。因此，根据E. cop+ CholAlk样品中检测到的荧光信号，确定为Alk+。

使用未标记的粪便样本中分离的微生物来确定Alk-。利用Alk+和Alk-种群参数，通过流式细胞术分离膳食来源的胆固醇相互作用群体和非相互作用群体，并通过显微镜证实微生物群被正确分离(图1d)。代表性的FACS密度图如补充图1所示。本研究中的所有样本都使用了建立的Alk+和Alk-，并可靠地鉴定了Alk+膳食胆固醇的相互作用菌群(扩展数据图2)。

图1 利用生物正交标记和流式细胞仪分离膳食来源的胆固醇相互作用微生物。

a，示意图显示用CholAlk处理小鼠，以确定摄入膳食胆固醇的微生物和膳食胆固醇的衍生物。

b，共聚焦显微镜从小鼠盲肠内容物中检测到CholAlk-相互作用的细菌(n=6，显示了一只小鼠的代表性图像)。

c，基于流式细胞术将微生物群落分离为与胆固醇相互作用(Alk+)或不相互作用(Alk−)的群体。

d，共聚焦显微镜检测使用FACS分离的微生物组样品中CholAlk衍生物的存在(Alk+)或缺失(Alk−)(n = 4，仅显示一只小鼠的代表性图像)。

共聚焦显微镜染色：蓝色，Hoechst 33342；红色，Alexa Fluor 647叠氮化物(AF647)。比例尺，20 μm。

2 确定与膳食衍生胆固醇相互作用的微生物 

接下来，我们试图从Alk+ FACS分类的微生物组样本中识别胆固醇相互作用的微生物。FASC排序的群体(Alk+和Alk−)(图1)和预先排序的输入样本首先进行16S核糖体RNA基因扩增子测序(16S测序)分析以确定细菌群落的组成。将DADA2去噪分析法应用于测序数据，以提高识别的微生物种群中分化序列变异的敏感性。

为了避免少量与胆固醇相互作用的微生物流失，根据每个样品的Alk-和预输入计算Alk+组分的富集倍数(图2a)。从该分析中，有10个不同分类分辨率的扩增子序列变体(ASVs)富集在Alk+部分(图2a)。 为了更好地了解膳食胆固醇相互作用是依赖于胆固醇的宿主转化还是微生物与胆固醇的直接相互作用，我们开发了一个体外系统将纯微生物与依赖宿主作用的胆固醇相互作用分离开来。为了实施该过程，我们利用BOSSS管道进行粪便培养(补充图2)。由于体外培养不能完全模拟宿主肠道，我们使用了两种不同的培养条件。

第一种培养基(胆固醇基础培养基(BCM))来自Kenny等人，利用已知的支持胆固醇利用的E. coprostanoligenes生长的条件。由Li等人开发的第二种培养基(肠道模拟培养基(GMM))试图保留微生物组分，并尽可能支持更广泛的胆固醇相互作用细菌。与我们的盲肠样品内容物类似，胆碱酯酶处理的细菌子集从任一培养基中标记为阳性，就可表明部分胆固醇相互作用的细菌在体外培养中存活(扩展数据图3)。体外培养物在与体内的粪便样本相同的条件下进行FACS分类，用于鉴定胆固醇相互作用(Alk+)和非相互作用(Alk−)微生物。

然后，我们根据它们的排序分数汇集了体外和体内16S测序数据，并进行差异分析以识别相互作用细菌。在Alk+组分中显著富集的7个ASVs与富集倍数分析中确定的类群相对应，进一步证实了胆固醇的相互作用物。总体而言，Alk+组分的群落概况包含的微生物与先前的研究一致，这些研究分析了与膳食胆固醇含量相关的微生物群落组成的变化。

在我们的Alk+样本中，假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)被确定为最显著的富集细菌，表明与膳食来源的胆固醇具有显著的相互作用。来自梭菌属(Clostridium)、副杆菌属(Parabacteroides)、颤螺旋菌属(Oscillospira)和Turicibacter的微生物，已知能吸收胆汁酸，也在Alk+群体中富集。肠球菌(Enterococcus)在体内和体外系统中显著富集。

研究表明，肠球菌的各种分离株在体内和体外均可作为胆固醇的载体，帮助宿主通过排便从而排出胆固醇。值得注意的是，通过相对丰度和褶皱富集度测量的关联不同。例如，乳杆菌(ASV3和ASV2)的总体丰度很高，因此可能在胆固醇相关活动中发挥作用，而其在Alk+中的富集不明显，这表明其与胆固醇相互作用的代谢能力或空间有限(图2a和补充图3)。

综上所述，我们在FACS指导下的16S测序工作确定了小鼠肠道微生物群中膳食来源的胆固醇相互作用亚群，所有这些都可能在胆固醇生物学中发挥宿主相关作用。

图2 与膳食衍生胆固醇相互作用的肠道微生物。

a，采用BOSSS工作流程，16S rRNA扩增子基因组测序确定通过FACS富集的胆固醇相互作用微生物的分类。Alk+组分的相对丰度与Alk-组分的相对丰度呈倍数富集，热图代表ASV的相对丰度平方根转换。在体内和体外实验中，分别取Alk+和Alk−样品的平均相对丰度(每个排序群体n=3)。

b，宏基因组分析确定UniRef蛋白簇与胆固醇互作微生物相关。左侧条形图显示了每个富集簇的相对丰度，其中背景根据其分组的生物化学注释进行颜色区分，条形图和点颜色表示样本来源(n=3，来自体内生物独立动物，n=3来自体外生物独立粪便培养)。

右边的条形图显示了Alk+中确定的物种对相应UniRef蛋白簇的平均贡献。每个物种集群的丰度值被归一化到每个样本中的每个集群中，并进一步在个体中获取平均丰度值。

c，体内和体外样本中，Alk+、胆固醇相互作用的微生物群中所有注释的硫酸化过程的每属贡献，如b所述。条形图值为平均值±标准差。

3 某些与胆固醇相互作用的微生物具有硫酸转移酶活性 

为了提高我们的分类鉴定和映射微生物类群的代谢活动，我们对FACS排序的微生物群进行了鸟枪宏基因组测序。为了了解吸收外源性胆固醇的微生物的代谢反应，我们评估了Alk+和Alk−之间的差异基因簇(显著性阈值错误发现率(FDR)P<0.05)。这两个群体之间的差异确定了与膳食来源的胆固醇相互作用的肠道菌群中胆固醇相关的基因功能。

我们鉴定出28个UniRef簇，与Alk−相比，它们的丰度在Alk+部分显著富集(FDR，P<0.05)(图2b、补充图4和补充表4)。将鉴定出的生物化学过程进行分组，以推测Alk+种群的活动。进一步的分析确定了一组利用硫酸盐相关过程的细菌，其中一些暂定在CholSulf的生物合成中发挥作用(图2b)。

为此，我们绘制了Alk+排序中已确定的磺化相关簇的平均属水平微生物贡献(图2c和补充表4)。我们注意到这些贡献主要存在于拟杆菌属(~25%)、双歧杆菌属(~7%)、乳杆菌属(~8%)和Anaerostipes spp.(~1%)(图2c)。 

4 非靶向代谢组学确定了与微生物相关的胆固醇转化 

在FACS辅助处理的同时，收集并制备了喂食胆固醇或CholAlk的小鼠的盲肠内容物，如Lee等人所述，通过LC-MS进行分析。利用Metaboseek软件中的XCMS软件包进行对比分析。在阳性模式下检测到的几个主要特征反映了在分离的E. cop培养物中检测到的特征，验证了肠道微生物群积极地将CholAlk转化为coprostanolAlk(图3a和补充表5)。

此外，这也证明了CholAlk是一种合适的胆固醇替代品，能够监测肠道微生物中A环的转化，但可能更普遍的是监测类固醇的转化。由于使用BOSSS方法确定真正的营养相互作用物还需要深入验证，我们基于以下标准，重点定义了先前未表征的膳食胆固醇微生物群转化：

(1)在体内和体外培养条件下，代谢过程在膳食衍生胆固醇相互作用微生物的基因组中富集；

(2)在炔烃形式(补充表6)和天然胆固醇条件下的体内和体外比较代谢组学分析中检测到转化的代谢产物；

以及(3)属于生物合成途径的基因可以在鉴定的相互作用物种中进行遗传操作。负模式分析盲肠内容物的评估显示，与化学式C28H44O4S对应的m/z 475.2879分子特征上调(图3b)。

总体而言，比较代谢组学分析初步确定该特征为含炔CholSulf(CholAlk-Sulf)，表明肠道微生物促进胆固醇转化为CholSulf。

我们之所以选择关注胆固醇向CholSulf的微生物转化，是因为它符合上述微生物转化膳食胆固醇的标准，适合进一步研究。

图3 小鼠肠道菌群可以将胆固醇转化为CholSulf。

a，粪甾烷醇炔烃的代表性结构。离子色谱图描述了从盲肠内容物、大肠杆菌培养物和体外粪便培养物中检测的粪甾烷醇炔烃。

b，CholAlk-Sulf的代表性结构。离子色谱显示检测盲肠内容物和体外粪便培养的CholAlk-Sulf。

c，从宏基因组分析中鉴定出的细菌胆固醇硫酸转移酶候选者被筛选用于CholSulf的产生。用胆固醇处理物种特异性培养物。离子色谱图代表了对CholSulf的检测(每个物种重复2次) 。

5、体外粪便培养可将胆固醇转化为CholSulf 由于胆固醇转化为CholSulf已经被确定为宿主转化，我们决定对小鼠粪便进行体外培养，以确定粪便微生物是否也可以进行这种转化。为了实现该过程，我们在粪便培养物上使用了BOSSS管道。对两种培养基的体外培养分析表明，CholAlk能够转化为CholAlk-Sulf(图3b和扩展数据图3b)。

此外，体外培养显示未标记的胆固醇有效转化为CholSulf(扩展数据图3c)，证实观察到的转化不是由炔官能化的异常引起的。粪便培养物中的CholSulf与CholSulf标准品的峰形状、保留时间和MS/MS裂解模式相匹配。有趣的是，虽然我们在盲肠样本中检测到粪甾烷醇的形成，但我们的离体培养未能产生粪甾烷醇(图3a)。

虽然许多参数可以优化培养粪甾烷醇的生物合成肠道微生物，因此我们将集中研究在肠道微生物组产生CholSulf的能力。长期以来，饮食、外来生物和微生物衍生代谢物的硫酸化被认为是由肝脏解毒驱动的宿主过程。据我们所知，这些结果证明了一个先前没有特征的例子，外源性代谢物被肠道微生物群硫酸盐化。

6、拟杆菌将胆固醇转化为CholSulf 

宏基因组分析确定了CholSulf生物合成的几个候选者。为了筛选CholSulf生物合成候选菌株，我们培养了Bacteroides ovatus、Bacteroides fragilis、Bifidobacterium longum subsp. infantis、Bifidobacterium pseudolongum、Lactobacillus amylovorus、Anaerostipes caccae和Ruminococcaceae sp.与胆固醇或CholSulf混合。靶向代谢组学分析显示，拟杆菌属可分别将胆固醇或CholAlk转化为CholSulf或CholAlk-Sulf，而非拟杆菌候选菌不能将Chol转化成CholSulf(图3c和扩展数据图5)。

为了确定这些结果是否为广义拟杆菌引起的，我们随后筛选了B. caccae、B. uniformis、B. vulgatus和B. thetaiotaomicron。事实上，所有拟杆菌都能成功地将胆固醇转化为CholSulf(图3c)。此外，由于胆汁酸也被认为是硫酸盐，我们用糖胆酸、甘氨熊去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸和石胆酸培养B. thetaotaomicron。

在本研究中测试的初级和次级胆汁酸(补充图5和6)都不能转化为其相应的硫酸盐，这表明了胆固醇是首选的底物。有趣的是，微生物来源的胆固醇衍生物粪甾烷醇也被转化为相应的硫酸盐(扩展数据图6)，这表明粪甾烷醇产生菌和拟杆菌之间的代谢相互作用，因为拟杆菌本身不会将胆固醇转化为粪甾烷醇。

最后，由于胆固醇和鞘脂在自然界中通常是串联存在的，我们推测鞘脂可能在胆固醇转化为CholSulf中发挥作用。基于此，我们培养了含胆固醇的B. thetaiotaomicron鞘脂合成零突变体。然而，终点分析表明CholSulf的产生没有显著差异，表明鞘脂不是产生胆磺的必要条件(补充图7)。 

为了确定拟杆菌中负责产生CholSulf的生化机制，我们寻找了人类SULT2A1和SULT2B1的同源物，这两种酶之前被证实可以合成CholSulf。B. thetaiotaomicron是一种基因组测序和基因可操作的代表性拟杆菌，对其进行BLAST分析，确定了几种候选硫酸转移酶，我们选择了其中六种用于进一步表征(图4a)。

以B. thetaiotaomicron为代表，我们研究了拟杆菌的胆固醇代谢，因为已经验证了拟杆菌将胆固醇转化为CholSulf的能力以及在该微生物中操纵假定CholSulf合成基因的能力。从B. thetaiotaomicron基因组中扩增候选基因，并克隆到pET28 Escherichia coli表达载体中，保留N-末端多组氨酸标签。

然后用胆固醇或CholAlk处理用胆固醇磺基转移酶候选物转化的BL21大肠杆菌培养物。

由于大肠杆菌产生3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸酯(PAPS)是产生CholSulf所需的第二种潜在底物，我们设想活大肠杆菌将在体内完成CholSulf生物合成，无需额外干预。事实上，对重组表达的候选培养物的靶向分析显示，BT_0416可将胆固醇转化为CholSulf(图4a)。固定化金属亲和层析富集多组氨酸标记的BT_0416也可在体外重组活性(图4b和补充图8)。

最后，从B. thetaiotaomicron中删除Bt_0416，在体内消除了胆固醇硫酸转移酶活性(图4c)。对邻近基因Bt_0411~Bt_0415进行分析，确定Bt_0411~Bt_0415为PAPS生物合成酶。我们设想BT_0412从环境中吸收硫酸盐，可能从硫酸盐聚糖的分解代谢中，BT_0413到BT_0415完成PAPS生物合成(图4d)。

然后BT_0416利用PAPS与胆固醇串联产生CholSulf。对B. ovatus和B. fragilis基因组的分析得到了相同的生物合成簇，表明拟杆菌属中CholSulf生物合成较为保守(图4e和扩展数据图7)。

图4 拟杆菌中的一个基因簇将胆固醇转化为CholSulf。

a，用CholAlk或胆固醇处理的BL21大肠杆菌中胆固醇硫酸转移酶候选基因的异源表达和分别表示CholAlk-sulk或CholSulf检测的离子色谱图(每个候选基因重复2次)。

b,体外通过富集His6_BT_0416将胆固醇转化为CholSulf和CholAlk再次转化为CholAlk-sulf(每个条件下重复2次)。

c，离子色谱图显示Bt_0416缺失突变体不产生CholSulf。

d，假定PAPS生物合成，然后在拟杆菌中合成CholSulf。基因产物根据e图的分类进行着色。

e，生物合成簇代表了B. thetaotaomicron、B. ovatus和B. fragilis中假定的CholSulf生物合成基因。

色谱图按比例缩放到每个数据集中的最大峰值。红色文本突出了BT_0416的代谢功能。 

7、微生物群硫酸转移酶活性改变宿主CholSulf和胆固醇水平 

为了测试微生物的硫酸转移酶活性如何参与宿主与微生物组之间的相互作用，我们首先试图了解拟杆菌属的硫酸转移酶活性表达是否对外源性胆固醇有反应。Bjursell等人先前的研究发现，PAPS合成基因Bt_0412至Bt_0415在哺乳期小鼠中上调，表明PAPS生物合成可能受到调节。

为了模拟它们在体内的结果，对B. thetaiotaomicron进行了体外分析，分别在含或不含乳糖的10%色氨酸中培养，前者是增加PAPS簇表达的条件。由于Bt_0416紧邻假定的PAPS簇，所以我们希望通过RT-qPCR确定Bt_0416是否也被乳糖或胆固醇诱导。虽然乳糖确实诱导了Bt_0412(图5a)，但Bt_0416没有改变(图4b)。

有趣的是，胆固醇处理显著上调了这两个基因，表明通过胆固醇的PAPS和CholSulf生物合成的调节模式趋同(图5a，b)。在确定Bt_0412和Bt_0416是胆固醇反应基因后，我们希望确定Bt_0416是否在体内将胆固醇转化为CholSulf以及影响宿主CholSulf水平方面发挥作用。为了实现该过程，我们利用具有硫酸转移酶活性(BtΔtdk)或无活性(BtΔtdkΔ0416)的B. thetaio-taomicron菌株单定植无菌(GF)小鼠。

通过粪便菌落形成单位(CFU)计数和盲肠细菌负荷的16S rDNA测定发现，两种菌株之间的定殖效率没有显著差异(扩展数据图8)。定殖后两周，处死小鼠并收集样本。用BtΔtdk(野生型(WT))对GF小鼠进行定殖，导致盲肠内容物(图5c)和粪便样品(图5d)中CholSulf显著升高，这两种样品与常规小鼠(CONV-D)相当或高于常规小鼠，表明肠道细菌是肠道和粪便CholSulf的主要贡献者。为了确定肠道拟杆菌依赖性CholSulf产生是否会影响系统宿主生物学，我们测量了全血中的CholSulf。

事实上，与BtΔtdkΔ0416(敲除(KO))相关的小鼠的全血CholSulf水平低于与BtΔtdk(WT)相关的小鼠(图5e)，这揭示了此前未明确的微生物群在类固醇代谢中的相关扰动。因为类固醇和类固醇硫酸盐代谢通常是有联系的，所以我们决定确定血清总胆固醇是否会在有无活性的BT_0416与拟杆菌属的单关联之间发生改变。

与先前的报告一致，与CONV-D小鼠相比，缺乏微生物组导致GF小鼠的血清胆固醇显著降低(图5f)。

我们还注意到，除了血清胆固醇低于具有BT_0416活性(BTΔtdk)的小鼠外，BTΔtdkΔ0416定殖小鼠显示出与GF小鼠相似的胆固醇水平，表明通过肠道微生物群将胆固醇转化为CholSulf会影响CholSulf和胆固醇稳态。

图5 在无菌小鼠模型中，B. thetaiotaomicron硫酸转移酶活性影响宿主CholSulf和胆固醇水平。

a、b，在10%胰蛋白酶中培养的B. thetaiotaomicron的Bt_0412(a)和Bt_10416(b)的表达，随后用赋形剂(Veh)、乳糖(Lac)或胆固醇(Chol)处理(每个条件n=6)。c–f、对GF小鼠、用含有BT_0416活性(WT:BTΔtdk)或无活性(KO:BTδtdkΔ0416)B. thetaiotomicron菌株单定殖的GF和CONV-D小鼠(每种条件n=10)进行靶向代谢组学分析。GF、KO、WT和CONV-D小鼠盲肠内容物(c)、粪便(d)和全血(e)中的CholSulf。f，GF、KO、WT和CONV-D小鼠的血清总胆固醇测定。

条形图值为平均值±标准差，采用Tukey多重比较校正的单因素方差分析进行统计分析。NS，P > 0.05；*P ≤ 0.05；**P ≤ 0.01；***P≤ 0.001。 

8、B. thetaiotaomicron通过肝门静脉循环向宿主组织提供CholSulf

为了了解在具有常规胆固醇代谢的小鼠模型中，微生物群产生的CholSulf对宿主代谢的贡献，我们使用CholAlk在B. thetaiotaomicron培养物中标记CholSulf，并将这些菌株口服灌胃给小鼠。我们先前已经使用过该技术以了解棕榈酸衍生的细菌脂质转移到宿主组织。

BtΔtdk(WT)菌株容易产生CholAlk-Sulf，而硫酸转移酶缺失菌株BtΔtdkΔ0416(KO)则不会。当口服进入小鼠体内时，在WT灌胃小鼠的肝门静脉循环中观察到B. thetaiotaomicron衍生的CholAlk-Sulf，而在KO灌胃的小鼠中观察不到(图6)。

这一观察结果表明，膳食胆固醇的微生物依赖转化可以通过与细菌来源的CholSulf直接相互作用影响宿主途径。

图6 B. thetaiotaomicron衍生的CholSulf被引入肝门静脉血液循环。

产生CholAlk-Sulf的B. thetaiotomicron菌株中CholAlk-Sulf的离子色谱图(WT：BtΔtdk(CholAlk)细胞颗粒，黑色)，小鼠接触无硫酸转移酶活性的B. thetaiotomicron菌株(KO:BtδtdkΔ0416，灰色；n=4)，以及接触具有硫酸转移酶活性的B. thetaiotomicron的小鼠(WT：BtΔtdk，粉色；n=5)。

讨论

虽然CholSulf是50多年前从人体样本中分离出来的，但其来源在很大程度上被认为来自宿主进程。通过BOSSS(一种追踪膳食脂肪的方法)，我们确定了一部分肠道微生物与膳食产生的胆固醇有关。体内外研究的非靶向代谢组学揭示了胆固醇通过微生物转化为CholSulf。

此外，宏基因组分析表明，拟杆菌属是造成胆固醇硫酸化的原因，突出了之前CholSulf未被表明的起源。有趣的是，在无菌培养中，拟杆菌属也可将粪甾烷醇硫酸化。对CholAlk处理小鼠盲肠代谢组的靶向分析鉴别出了粪甾烷醇炔烃硫酸盐，表明在产粪甾烷醇的微生物和拟杆菌属之间存在交叉关系，可以作为未来研究的代谢网络。

最后，缺乏胆固醇硫酸转移酶活性的单相关拟杆菌小鼠的盲肠、粪便和血液中CholSulf水平发生显著变化，证实了微生物组在代谢外源性胆固醇方面发挥着重要作用。此外，追踪来自B. thetaiotaomicron的CholAlk-Sulf表明，微生物组可以直接影响宿主的CholSulf水平。 肠道菌群产生的CholSulf对宿主生物学的潜在影响较为广泛，CholSulf已被证明可以抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，并且有效地减少类固醇合成。CholSulf也可以抑制胰弹性蛋白酶(一种负责帮助消化各种膳食成分的酶)。胰弹性蛋白酶的抑制可能通过肠道中拟杆菌的CholSulf调节消化。 肠道中的CholSulf抑制胰弹性蛋白酶可能表明拟杆菌属能够调节消化。

此外，CholSulf已被证明与白细胞相互作用，从而影响免疫反应。因为拟杆菌不产生胆固醇，胆固醇的硫酸化似乎是一个适应性作用。使用饱和胆固醇的培养基对BtΔtdk和BtΔtdkΔ0416进行体外分析，发现存活率没有差异，表明CholSulf的产生不是胆固醇解毒的方式。

总之，这些结果表明拟杆菌生物合成CholSulf可能通过许多靶点调节宿主状态值得进一步研究。 BOSSS方法的局限性包括，目前无法完全区分直接膳食胆固醇和膳食依赖性胆固醇的相互作用，这涉及到在微生物接触前的转化。在本研究中，这一局限性通过使用体外培养物来消除部分胆固醇宿主转化的因素。

此外，通过在微生物和宿主系统的验证加强了BOSSS发现的胆固醇相互作用。虽然我们关注与微生物胆固醇转化为CholSulf相关的生物学内容，通过进一步探索通过BOSSS识别出的与胆固醇相互作用的微生物，为阐明新的生物学提供了多种机会。

值得注意的是，在BOSSS工作流程中，必须要控制天然代谢物，确保在自然状态下也可以观察到使用改良代谢物识别的过程。 通过16S rRNA基因扩增子和鸟枪宏基因组测序分析都表明了复杂胆固醇相互作用的特异性。但仍存在一些未解决的问题，包括涉及微生物将胆固醇转化为粪甾烷醇，以及通过BOSSS工作流程进一步探究与胆固醇相互作用的微生物的功能效应。最后，人类粪便培养也显示胆固醇能够转化为CholSulf，这表明人类体内胆固醇稳态机制值得进一步研究。

有鉴于此，最近的研究发现，独特的类固醇硫酸盐与减肥手术有关，以微生物依赖性方式调节葡萄糖耐量。

综上所述，本研究展示了胆固醇特异性微生物组学的一个独特方面，在这项研究中确定的各种胆固醇相互作用可能揭示了额外的类固醇特异性肠道微生物组范式。