精准前沿丨胸膜感染细菌学(TORPIDS)：基于NGS的探索性宏基因组分析

本期《精准前沿》栏目分享英国牛津大学Kanellakis研究团队发表于《Lancet Microbe》（IF =86.208）上的一篇研究^[1]，研究使用16S rRNA NGS分析流程，分析了243份由感染引起的胸腔积液的样本。结果显示胸膜感染主要是多菌型的；单菌型，多菌型，医院获得性（医院内感染）和社区获得性感染（住院前获得的感染）中均能观察到不同的细菌组成。在社区获得性多菌种感染中，厌氧菌（Anaerobes）和其他革兰氏阴性菌混合的情况较多；在单菌种感染中，感染的主要微生物是肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）。如果患者感染的微生物大部分是厌氧菌或咽峡炎链球菌（S. anginosus），则生存率较高，如果患者感染的微生物大部分是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）或肠杆菌科（Enterobacteriaceae），则生存率低。

 

研究背景

胸膜感染是一种常见的严重疾病，在世界范围内具有很高的发病率和死亡率。由于基于培养的病原体检测方法敏感性不足，且识别微生物有偏向性，因此人们对胸膜感染细菌学的了解仍不全面。作者设计该研究，目的是发现和调查感染胸膜的微生物组，并评估细菌模式与患者1年生存率之间的相关性。

研究设计

样本收集

TORPIDS（The Oxford Pleural Infection Metagenomics Studies）是2020年一个PILOT试验（探索性研究）的后续研究。263份胸腔积液标本进行了细菌DNA提取，然后进行16S rRNA NGS数据分析。这些样本中的243份来自确认的胸膜感染的成年患者，20份来自非感染性原因的胸腔积液患者。为了估计背景污染，作者对10个无模板对照样本（阴性对照组，PCR级水）采用了同样的方法进行分析。

16S rRNA NGS的数据分析

作者使用FastQC管线进行质量评估，并使用DADA2管线对原始16S rRNA NGS数据进行下游分析。对扩增子序列变体进行分类，如果无法分类到已知的门或只在阴性对照组的样品中发现，则将其删除。具有相同分类的扩增子序列变体被合并，那些少于100个reads的扩增子被删除。每个样品中X细菌的丰度计算公式为：样品Y中X细菌的reads数/样品Y的总reads数*100。丰度低于1%的细菌被删除。如果阴性样本中存在的细菌在PILOT样品中的丰度低于10%，则从每个PILOT样品中删除。

细菌分类

作者将确定的细菌分为九个不同的类型：厌氧菌(Anaerobes)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)菌群、肺炎链球菌(S. pneumoniae)、分枝杆菌(Mycobacterium)、其他革兰氏阳性菌、其他革兰氏阴性菌和不可知的细菌。与肠杆菌科、金黄色葡萄球菌、咽峡炎链球菌菌群、肺炎链球菌和分枝杆菌有关的细菌被归入相应的组别。这五种病原体外的病原体，如果是严格意义上的厌氧菌则被划归为厌氧菌。剩下的病原体被归为其他革兰氏阳性菌或其他革兰氏阴性菌。如果一种细菌，在一个样本中发现且分类信息不完整，则被划分为不可知。

样本分类

为了探索结果与物种丰度之间的联系，作者根据主要病原体的丰度将样品分为五组，1种单微生物组和4种多微生物组。单微生物组中，主要病原体的reads占总reads数的100%（MM组）。四个多微生物组分别为PM1组，PM2组，PM3组和PM4组。划分标准分别是：主要病原体的丰度大于等于1%且小于25%（PM1组）、大于等于25%且小于40%（PM2组）、大于等于40%且小于60%（PM3组）、大于等于60%且小于100%（PM4组）。使用这四个不同的多菌种分组来探讨多菌种情况与病原体和病原体产生的影响的关系。

无监督聚类、相关性和微生物距离分析

为了研究细菌之间的关联并确定细菌模式，作者进行了无监督聚类分析，使用了欧氏距离和最远距离法，并使用R包Pheatmap进行图形绘制。此外，还进行了UMAP分析。为了探索不同样品之间的相关性，并进一步比较细菌组成，作者使用Spearman方法进行相关性分析，并使用R包corrplot进行图形绘制。为了研究β多样性（样本之间的微生物的异同），使用weighted unifrac进行了微生物距离分析。

研究结果

2.  大多数的胸膜感染病例是多菌型

大多数胸膜感染样本是多菌型的（图1A）。在243个样本中，有192个（79%，PM1至PM4组）检测到两种或两种以上的病原体，其他51个样本（21%，MM组）只有一种病原体。多菌型胸膜感染模式多种多样；与MM组相比，多菌型组显示出更大的物种丰富度（α多样性）。无监督层次聚类、相关性分析和UMAP检测到不同的样本聚类（图1B，图1C）。以肺炎链球菌为主的样本聚类更加紧密。此外，观察到两个以厌氧菌为主的聚类，第一个离其他革兰氏阴性菌为主的样品较远，第二个较近。距离分析（β多样性）显示了样品之间微生物群落的不同模式。

3.  医院获得性感染和社区获得性感染的不同细菌组成

在PILOT研究的243份胸腔液样本中，221份（91%）来自社区获得性感染的患者，17份（7%）来自医院获得性感染的患者，5份（2%）的感染来源不明。作者在社区获得性和医院获得性胸膜感染中检测到不同的细菌组成。社区获得性感染的肺炎链球菌的含量比医院获得性感染高（P=0.049）。医院获得性感染患者的肠杆菌科含量是社区获得性患者的3倍（p=0.043），金黄色葡萄球菌含量的5倍（p=0.006）（图2C，图2D）。厌氧菌（p=0.30）和其他革兰氏阴性菌（p=0.48）的丰度在两批患者中相似。与医院获得性感染的样本相比，社区获得性胸膜感染的样本中有着更为丰富的物种，社区获得性感染的样本中发现了233种不同的病原体，而医院获得性感染样本中有55种不同的病原体（图2A，图2B）。社区获得性胸膜感染和医院获得性胸膜感染之间每个样本识别出的病原体总数没有显著差异（P=0.65）。

图2. 社区获得性和医院获得性胸膜感染显示出不同的细菌组成

4.  社区获得性胸膜感染患者中的多菌型和单菌型

在多菌型PM组（174[79%]）和单菌型MM组（47[21%]）社区获得性胸膜感染患者中发现了不同的细菌组成（图3）。厌氧菌和其他革兰氏阴性菌是PM组中最丰富的病原体（图3A）。在PM组的174个样品中，16S rRNA NGS在148个（85%）样品中检测到厌氧菌，在126个（72%）样品中检测到其他革兰氏阴性菌（图3B）。在PM组检测到的总共1089种细菌中，413种（38%）是厌氧菌，436种（40%）是其他革兰氏阴性菌（图3C）。此外，在60个（27%）PM组样品中发现了111种（10%）其他的革兰氏阳性细菌，但它们的丰度很低。PM组物种丰富度高，共有230种不同病原体。

肺炎链球菌是MM组中最丰富的病原体，而PM组的肺炎链球菌的丰度却较低。在MM组，咽峡炎链球菌菌群的平均丰度为19.1%（39.8），肠杆菌科为12.8%（33.7）。MM组物种丰富度最低，仅12种不同的细菌病原体通过16S rRNA NGS鉴定。

图3. 单菌型和多菌型社区获得性胸膜感染表现出多种细菌组成

5.  传统基于培养的病原体检测与NGS检测

在243个样本中，55个（22%）样本能够在传统的基于培养的病原体中检测成功，这低于临床实践报告的结果。这可能是由于之前使用了抗生素。在这些基于培养确定病原体的55个样本中，49个样本（89%）检测到一种病原体，6个样本（11%）检测到两种病原体。16S rRNA NGS检测中，平均每个样品能检测出3.2个（2.8）病原体。基于培养的病原体识别方法的识别率低于NGS的识别率。

6.  细菌组成与患者1年生存率之间的关系

根据RAPID评分因素进行多变量COX回归分析，发现细菌菌群是死亡率的独立预测因素。受厌氧菌和咽峡炎链球菌菌群患者的1年生存率更高，而受到金黄色葡萄球菌感染的患者有着明显较差的生存率，其他细菌种类没有发现明显的生存差异。此外，医院获得性胸膜感染的死亡率高于社区获得性胸膜感染。

细菌组成与诊断后3个月内是否需要手术或住院时间之间不显著相关。同时，没有发现牙齿卫生（临床报告的牙齿状况）和厌氧菌之间的联系。

图4. 一年生存率和细菌组成的关系

讨论

在这项研究中，作者使用16S rRNA NGS来调查分析造成胸膜感染的的微生物组，并将细菌组成与之前收集和记录的临床结果联系起来分析。研究结果表明，胸膜感染主要是多菌型的，在单菌型和多菌型疾病中都存在不同的微生物组成。引起感染的细菌类型是患者1年生存率的一个独立预测因素。

过去估计多菌型胸膜感染的发生率约为23%。而该项研究表明，过去很有可能大大低估了多菌型感染的发生率。以前的研究依赖于传统的基于培养的病原体检测方法，其假阴性率高。基于NGS的宏基因组学多项研究显示人类受多种微生物感染很常见。

过去依赖培养的分析报告表明，需氧革兰氏阳性菌是引起社区获得性胸膜感染的主要因素。而本次研究获得的数据与过去的结果相反，通过16S rRNA NGS的检测显示厌氧菌和革兰氏阴性菌的丰度最高。这种差异可能是因为厌氧菌较难使用常规方法进行培养，该结果可能也表明了胸膜的缺氧环境有利于厌氧菌的生长。

越来越多的证据表明，细菌生物膜基质作为支架，有利于特定细菌的附着，而阻碍其他细菌的附着。肺炎链球菌是社区获得性单微生物感染中最普遍的病原体，这表明，肺炎链球菌生物膜可能是由于激烈的竞争阻止其他细菌物种共生，或者由于其具有足够的毒力因素可能不需要和其他菌共生。相比之下，社区获得性多菌种群体的特点是，普遍存在其他革兰氏阴性菌和厌氧菌的混合物。这表明生物膜内可能存在复杂的细菌相互作用，以及细菌共同聚集的过程。

胸膜感染的细菌生态位内，细菌种类的混合模式可能指出了胸膜感染的起因。在该研究和以前的研究中，最丰富的胸膜厌氧菌病原体通常在口腔和牙齿微生物组中发现。咽峡炎链球菌菌群的成员是正常口腔菌群的一部分，而肺炎链球菌在上呼吸道定植。这些数据表明，口咽、口腔和牙齿病原体的吸入可能在胸膜感染的病原学发病机制中起着重要作用。

受厌氧菌和咽峡炎链球菌菌群感染患者的存活率较高，受金黄色葡萄球菌感染的存活率较差，这些结果与胸膜感染存活率预测分数（RAPID）无关。样本中主要菌群是金黄色葡萄球菌和肠杆菌科的患者死亡风险较高，可能是因为这些细菌的抗生素抗性较强。这表明需要对被金黄色葡萄球菌和肠杆菌科细菌感染的患者进行针对性的治疗。

与医院获得性疾病患者相比，社区获得性胸膜感染患者的样本中的物种丰富度（α多样性）更高。这可能是由于医疗机构中的病原体暴露于更广泛的抗生素或消毒剂，导致医院环境比社区环境的选择压力更大。

比较基于培养检测和16S rRNA NGS分析的结果，16S rRNA NGS能够快速批量分析。使用培养的方法仅能在胸腔积液中检测出一个或两个病原体物种，而NGS的方法有可能识别整个微生物组。

结语

总之，该研究对胸膜感染样本的宏基因组评估显示，多种微生物的存在与细菌病因类型的1年生存显著相关。未来的研究应关注早期诊断与宏基因组技术之间的关系，以及放射学和微生物组之间的关系。 END