​Nature子刊：自组装三聚体重组蛋白疫苗高效预防Omicron变异新冠病毒感染

新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的新冠肺炎疫情仍在全球范围肆虐。世界卫生组织公布的最新数据显示，截至2022年9月16日，全球新冠确诊病例累计已超过6.08亿，死亡病例逾650万【1】。最新出现的奥密克戎（Omicron，B.1.1.529）变种已迅速超过Delta，成为主要的SARS-CoV-2变种【2】。

Omicron具有较高的传播率和免疫逃逸能力，还可导致已接种疫苗群体也出现突破性感染，因此需要开发针对Omicron变体的新一代SARS-CoV-2疫苗。

2022年9月17日， 四川大学华西医院生物治疗国重室魏霞蔚/逯光文/宋相容团队，中国医学科学院＆北京协和医学院彭小忠/鲁帅尧团队合作，在 Nature Communications 期刊发表了题为：A self-assembled trimeric protein vaccine induces protective immunity against Omicron variant 原创研究论文【3】。

研究团队开发了一种名为RBD-HR/三聚体的亚单位疫苗，该疫苗在小鼠和非人灵长类动物中可有效预防包括Omicron在内的SARS-CoV-2变体的感染。其是以串联方式直接连接Delta变体（包含L452R和T478K）的RBD序列和源自SARS-CoV-2 S2亚单位中的HR1和HR2序列自组装成的三聚体。体内实验表明，三聚体疫苗接种引发了持续和强烈的体液和T细胞免疫应答，产生高水平的针对奥密克戎变体的广谱中和抗体。

新冠病毒的刺突蛋白（S蛋白）负责病毒的受体识别和膜融合，是重要的疫苗靶点，激发中和抗体的产生，具有免疫聚焦的优势。高传播力的Omicron变种具有大量的突变，其可能包含增强病毒传播和损害中和作用的突变，这引起人们的严重担忧它可能会削弱目前市场上基于原始SARS-CoV-2毒株开发的疫苗所诱导的免疫保护。

事实上，确实观察到Omicron变体对许多广泛使用的新冠肺炎疫苗表现出广泛的耐药性【4-6】，在高度接种的人群中，由Omicron变体引起的突破性感染越来越多，即使是先前感染的个体也仍然面临再次感染的风险。因此，需要开发新一代SARS-CoV-2疫苗，用于抵抗针对包括Omicron在内的SARS-CoV-2变体。

一、重组RBD-HR/三聚体蛋白的表达和三聚体疫苗制备

作者以及其他研究者的前期成果表明，SARS-CoV-2的刺突蛋白RBD是亚单位疫苗开发的可行免疫原。为了进一步提高抗原性，针对RBD的抗原多聚化的多种策略进行了深入研究，然而或免疫原性不足，或潜在的临床应用复杂难以实现。基于SARS-CoV-2 S2亚单位的七肽重复序列1和2（HR1和HR2）的肽可以自动组装成6-螺旋束结构特性，作者将包括衍生自Delta变体的RBD（320-545个氨基酸，含有L452R和T478K）序列，以及HR1（916-966个氨基酸）和HR2（1157-1203个氨基酸）以串联方式直接连接，通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组蛋白，称为RBD-HR/三聚体（图1）。

Fig. 1 | Characterization of the recombinant RBD-HR/trimer protein. 

二、BD-HR/三聚体疫苗诱导持续的体液免疫应答和广谱中和抗体 

为了评估RBD-HR/三聚体的免疫原性，首先需要确定蛋白诱导的抗体应答。作者基于三聚体蛋白和MF59类佐剂，制备了RBD-HR/三聚体疫苗，并接种小鼠，分析各接种方案后免疫应答情况。结果表明，三聚体疫苗显示出良好的免疫原性，可诱导显著升高的RBD特异性IgG应答，以及高滴度的中和抗体（NAB），其可阻断 Alpha、Beta、Delta 和 Omicron 等所有假病毒的感染 （图2） 。在用免疫接种的人ACE2转基因小鼠、大鼠和非人灵长类动物的血清进行真实的病毒中和试验，得到同样的结论。疫苗诱导的血清抗体通过阻断受体结合和抑制随后的病毒细胞膜融合来中和病毒感染。值得注意的是，RBD-HR/三聚体疫苗同时包含452R和T478K突变，这两种突变都有利于疫苗诱导的针对Omicron和Delta的抗体响应，在多种动物的疫苗免疫都可诱导针对Omicron高中和抗体滴度。

Fig. 2 | Induction of sustained humoral immune response with broad-spectrum neutralizing activities by RBD-HR/trimer vaccine. 

三、RBD-HR/三聚体在体内诱导的强T细胞免疫应答 

细胞免疫反应在预防病原体感染中起着关键作用，CD4+和CD8+T细胞参与其中，引发高水平抗体反应。在新冠肺炎患者中检测到针对SARS-CoV-2棘突蛋白的CD4+和CD8+T细胞反应，并且与体内实验中和抗体的产生密切相关。因此，作者进一步研究了RBD-HR/trimer疫苗在激活T细胞响应中的作用，分离脾淋巴细胞，然后进行ELISA和细胞内细胞因子染色 （ICS） 分析，在RBD-HR/三聚体配制佐剂组中，RBD特异的IL-4、INF-γ以及记忆T细胞的平都显著增加 （图3） 。这些结果表明，RBD-HR/三聚体疫苗可以诱导高强度T细胞反应，有助于产生高水平的中和抗体。

Fig. 3 | RBD-HR/trimer vaccine induced strong T cell immune response in vivo. 

四、RBD-HR/三聚体疫苗对Omicron和Delta感染的完全保护 

最后，作者评估了RBD-HR/timer疫苗对Omicron体内效力。转基因hACE2小鼠用低剂量 （10μg） 或高剂量 （20μg） RBD-HR/timer免疫小鼠，分析原始SARS-CoV-2病毒感染前后，血清中抗体几何平均滴度，结果表明，原始病毒、Alpha, Beta, Delta 和Omicron的50%GMT分别为14886、10033、9563、17040和1408，都显示出较高的中和能力 （图4a） 。组织学检查显示，Omicron感染后的小鼠和其他非人灵长类动物，对照组可以观察到轻微的病理变化，而三聚体疫苗接种后的动物的肺组织学正常，显示完整的肺泡结构，无明显炎症 （图4e） 。这些数据表明，RBD-HR/三聚体疫苗可以有效保护，抵抗包括Omicron在内的SARS-CoV-2变体的感染。

Fig. 4 | RBD-HR/trimer vaccine completely prevented the infection of Omicron and Delta variants. 

综上所述，作者开发了一种含有L452R和T478K突变的RBD序列与HR序列直接融合而形成的RBD-HR/三聚体亚单位疫苗。该疫苗具有较强的免疫原性，可诱导高水平的中和抗体，在小鼠和非人灵长类动物中的可提供抗Omicron和Delta活病毒感染的完全保护。

此外，三聚体疫苗在两剂mRNA疫苗后对奥密克戎变体显示出强大的增强作用，并且具有疫苗规模生产可行性。总之，RBD-HR/三聚体疫苗是非常有希望的下一代候选疫苗，值得在临床试验中进一步评估，可作为独立疫苗或作为额外的加强针用于人类，广谱保护和预防覆盖Omicron在内的SARS-CoV-2变体感染。 以上项目受成都威斯克生物医药有限责任公司资助。 

参考文献 ： 1.https://covid19.who.int 2.Liu L. et al. Striking antibody evasion manifested by the Omicron variant of SARS-CoV-2. Nature 602, 676–681 (2022). 3.Cai H. et al. A self-assembled trimeric protein vaccine induces protective immunity against Omicron variant. Nature Communications. 2022 4.Planas D. et al. Considerable escape of SARS-CoV-2 Omicron to antibody neutralization. Nature 602, 671–675 (2022).  5.Cele S. et al. Omicron extensively but incompletely escapes Pfifizer BNT162b2 neutralization. Nature 602, 654–656 (2022).  6.Dejnirattisai W. et al. Reduced neutralisation of SARS-CoV-2 omicron B.1.1.529 variant by post-immunisation serum. Lancet 399, 234–236 (2022).