孙超主任团队解读：桑黄酮通过TRIM31/Nrf2信号通路抑制肝纤维化

2019年肝病领域顶刊JOH指出，世界范围内每年大约有200万例患者死于肝脏疾病，我国约有700万肝硬化患者，每年新发肝癌46万，乙丙肝感染者逾1亿，为社会带来沉重的医疗和经济负担。

为契合《“健康中国2030”规划纲要》中提出的将重大慢性疾病过早死亡率较2015年下降30%的目标，肝胆相照平台与天津医科大学总医院消化内科联合打造“肝研撷萃”精品栏目。

“肝研撷萃”由天津医科大学总医院孙超主任担任总编辑，范晓飞博士、惠洋洋博士、王晓雨博士、崔膑心博士任执行编辑，通过研读分享各种肝脏疾病诊断、治疗、预防和发病机制的前沿进展，结合团队自身的工作，为广大医生提供精进学术、助力临床的交流平台。

“肝研撷萃”第十二期，孙超主任团队对发表于Redox Biology的一篇学术成果进行解读，以启迪临床。

研究背景

肝纤维化发生在多种类型的肝病中，其特征是细胞外基质蛋白过度沉积，而活化的肝星状细胞(HSCs)可以转化为肌成纤维样细胞，表达α-SMA并分泌由各种蛋白多糖和蛋白质组成的细胞外基质；肝纤维化的一个关键因素是肝细胞中促炎NF-κB信号通路的激活；另一个主要促纤维化因素则是氧化应激。

桑黄酮(Mulberrin，Mul)是中药桑枝的重要成分之一，具有抗炎、抗氧化等生物活性；然而，Mul对肝纤维化的影响目前尚不清楚。

Nrf2作为一个关键的转录因子，通过促进多种抗氧化基因的表达，对细胞的氧化应激起着至关重要的保护作用；TRIM家族由一个环指结构域、一个或两个B-box结构域和一个卷曲螺旋结构域组成，参与了广泛的生物学过程；TRIM31是TRIM蛋白家族的成员，可介导多种病理状态，包括炎症性疾病、病毒感染和肿瘤进展。

本研究体内实验部分利用CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型，体外实验应用人肝细胞系(L02)、人肝星状细胞系(LX-2)、小鼠原代肝细胞，探究Mul是否通过TRIM31/Nrf2轴抑制HSCs的活化，从而减轻肝纤维化。

研究结果

1 桑黄酮改善CCl4诱导的小鼠肝功能损伤和肝纤维化

A：使用CCl4建立了小鼠肝纤维化模型。

B：CCl4造模组小鼠体重显著降低，但在较高剂量(30和60 mg/kg) Mul处理组，小鼠体重有所恢复。

C：与对照组相比，CCl4造模组小鼠的存活率较低，而Mul处理组小鼠的存活率有所回升。

D-F：CCl4造模组小鼠血清总胆红素(TBIL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)含量显著升高，但上述变化可被Mul剂量依赖性的逆转。

总结：初步揭示了Mul对CCl4诱导的肝损伤具有保护作用。

2 桑黄酮抑制CCl4诱导的小鼠肝脏TGF-β1/SMADs信号传导以改善肝纤维化

A-D：H&E染色显示，CCl4可引起小鼠肝组织明显的组织学改变，证实存在肝损伤。天狼星红和Masson’s三色染色显示，与对照组相比，CCl4造模组小鼠肝组织中胶原沉积和纤维化程度更严重；Mul通过剂量依赖的方式，显著减轻了这些组织学改变和肝纤维化。

E-G：造模组中，三个关键的肝纤维化标志物，包括透明质酸、PC III（III型前胶原）和胶原IV的水平显著升高，而Mul处理组的明显改善。

另外通过免疫荧光染色，同时在蛋白或基因水平验证了Mul可抑制TGF-β1/SMADs信号转导，从而减轻肝纤维化。

3 桑黄酮通过调控TRIM31/NLRP3信号通路减轻肝脏的炎症反应

A、B：CCl4造模组中肝脏的TRIM31表达显著降低；而Mul处理组较其明显增加。

C：RT-qPCR结果显示Mul显著上调了CCl4处理后小鼠肝脏中TRIM31的mRNA表达水平；并且Mul可显著降低NLRP3及其下游信号ASC表达。

D、E：Mul处理组小鼠肝组织受CCl4抑制的TRIM31蛋白表达水平得到了有效恢复；但Mul可显著降低肝组织中NLRP3及其相关炎症小体的表达水平，表现为NLRP3、ASC、Caspase-1、mIL-1β和mIL-18的表达显著降低。

I：体外WB结果显示，在TGF-β1或脂多糖作用下，Mul处理组显著提高了L02细胞和小鼠原代肝细胞中TRIM31和总IκBα的表达水平，而降低了NLRP3、ASC、Caspase-1、p-IκBα、p-NF-κB、mIL-1β和mIL-18的表达水平。

结论：Mul通过调控TRIM31/NLRP3信号通路减轻肝纤维化。

4 桑黄酮通过促进Nrf2激活来抑制肝脏氧化应激

A-C：CCl4造模组小鼠肝组织中的氧化应激标志物：包括过氧化氢、丙二醛和总胆红素受体显著升高，而Mul呈剂量依赖性的抑制其表达。

D-F：经Mul处理，肝组织中的抗氧化物质如CAT、GSH和SOD明显恢复。

F-H：免疫组织化学染色：造模组肝组织中脂质过氧化产物4-HNE显著增加，而Mul处理组显著降低。

I：与造模组相比，Mul处理组表现出更高的抗氧化基因表达水平，包括HO-1、NQO1、GCLC和GCLM。

J：NAD(P)H氧化酶亚基NOX1、NOX2、NOX4和p22Phox在CCl4造模组小鼠肝组织中的mRNA表达水平显著上调，而Mul处理组则下降。

K-M：免疫组化染色和WB结果：与对照组相比，CCl4造模组肝组织中Nrf2的核转位明显减少；与造模组相比，Mul处理组Nrf2核转位增加。

N：CCl4造模组的小鼠表现出比对照组更高水平的细胞色素P450 2E1(CYP2E1)表达，而Mul通过剂量依赖的方式显著抑制这一作用。

同时在体外实验(L02细胞和小鼠原代肝细胞)中同样验证了Mul可以促进Nrf2的激活，从而减轻肝纤维化过程中的氧化应激。

5 桑黄酮可抑制HSCs的活化、炎症和氧化应激

A：RT-qPCR结果显示，肝纤维化标志物α-SMA、COl1a1、COl3a1和纤连蛋白在LX-2细胞中的表达明显上调，而Mul处理后显著降低并呈剂量依赖关系。

B、C：免疫荧光染色显示，在TGF-β1刺激后，Mul处理降低了LX-2细胞中α-SMA的表达。

D：WB结果显示，与TGF-β1/Veh组相比，经Mul处理的细胞在TGF-β1刺激后，LX-2细胞中α-SMA和p-SMAD2/3的蛋白表达水平降低。

E：TGF-β1刺激可引起LX-2细胞的炎症反应，主要表现为TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和CXCL10的基因表达水平显著升高；但在Mul处理后，这种由TGF-β1引起的炎症反应显著降低。

F：HO-1和NQO1基因在TGF-β1刺激的LX-2细胞和小鼠原代HSCs中的表达水平显著降低，而Mul共同作用后表达水平升高；相反，Mul以剂量依赖的方式显著降低NOX2和NOX4的表达水平。

G：随着TGF-β1的作用，核内Nrf2蛋白表达水平显著降低，而在Mul处理后恢复；在LX-2和原代小鼠HSCs中，胞质Nrf2的表达呈现相反的趋势。

6 桑黄酮在体外抑制HSCs的激活与TRIM31-Nrf2轴相关

A：从TGF-β1孵育的L02细胞中提取的条件培养基(CM)促进了LX-2细胞中α-SMA、COL1a1、COL3a1和纤连蛋白的表达，并且在siTRIM31和siNrf2处理后更为显著；另外，在siTRIM31和siNrf2处理后，Mul失去了对上述纤维化基因表达的抑制作用。

B、C：在L02细胞中，siTRIM31和siNrf2处理后，CM-TGF-β1对LX-2细胞的激活作用进一步加剧，α-SMA的表达增加；siTRIM31和siNrf2处理后，Mul不再抑制α-SMA的表达。

D、E：WB结果显示，纤维化时siTRIM31和siNrf2处理的L02细胞来源的CM明显促进LX-2细胞TGF-β1、p-SMAD2/3和α-SMA的表达，Mul作用消失。

F：来源于TGF-β1孵育的L02细胞的CM可诱导细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α、IL-18和CXCL-10的含量增加，siTRIM31和siNrf2处理后，上述炎症反应相关产物含量增加，Mul抗炎作用减弱。

G：WB结果显示，CM-TGF-β1处理可显著降低LX-2细胞中TRIM31和核Nrf2蛋白的表达水平，当TRIM31和Nrf2蛋白敲除后，这种作用进一步减弱，且Mul促进TRIM31和Nrf2的表达作用显著减弱；相反，TRIM31和Nrf2缺失时，CM-TGF-β1处理后的NLRP3、ASC、Caspase-1和p-NF-κB蛋白表达水平增加明显，而Mul抑制作用减弱。

7 桑黄酮的抗肝纤维化作用依赖于TRIM31

为证实肝纤维化时肝细胞与肝星状细胞的相互作用，建立了肝细胞特异性TRIM31基因敲除小鼠(TRIM31Hep-CKO)。

1A：在TRIM31Hep-CKO小鼠中，Mul处理组小鼠的体重不增加。

B-D：CCl4/TRIM31Hep-CKO小鼠中，Mul处理组血清TBIL、LDH、ALT、AST和GGT升高。

2A：组织学染色显示，Mul处理未能抑制CCl4诱导的TRIM31Hep-CKO小鼠肝脏胶原沉积。

3E：Mul不能抑制肝组织中α-SMA、COl1a1、COl3a1和TGF-β1基因的表达。

F：Mul抑制CCl4/TRIM31Hep-CKO小鼠TGF-β1、p-SMAD2/3和α-SMA蛋白表达水平的作用也显著减弱。

另外，通过免疫染色、血清学检测，从基因及蛋白层面验证了桑黄酮在CCl4小鼠体内的抗炎作用同样是依赖于TRIM31。

8 桑黄酮在原代HSCs中的抗纤维化作用是Nrf2依赖的

A：建立了一个来自Nrf2WT或Nrf2KO原代肝细胞的体外CM系统，无论是否有TGF-β1刺激，收集后在存在或不存在Mul处理的情况下用于原代培养小鼠HSCs。

B：在TGF-β1刺激后，Mul能显著增加Nrf2WT原代肝细胞核Nrf2的表达，但降低胞浆Nrf2的表达；在Nrf2KO肝细胞中检测不到Nrf2。

C-E：TGF-β1刺激后的Nrf2KO原代小鼠肝细胞中 ，Mul不能降低α-SMA、COl1a1、COl3a1和纤连蛋白的表达水平。

F：在TGF-β1刺激后的Nrf2KO原代小鼠肝细胞中，Mul下调TGF-β1、p-SMAD2/3和α-SMA蛋白表达水平的作用也显著减弱。

9 TRIM31和Nrf2之间可能存在蛋白质相互作用

A、B：内源性免疫沉淀和WB实验证实了TRIM31与Nrf2在人肝细胞中的相互作用。

C：在L02细胞中，在TGF-β1刺激下，TRIM31与Nrf2的相互作用减弱。

D-F：在人HSCs中，在TGF-β1刺激下，TRIM31和Nrf2之间相互作用减弱。

G：通过siRNA抑制TRIM31的表达进一步减少了经TGF-β1处理后L02和LX-2细胞中Nrf2的核转位。

H：TRIM31以浓度依赖的方式上调Nrf2的核表达。

I-K：免疫组化染色显示，在肝脏特异性的TRIM31基因敲除后，Mul不能恢复CCl4处理的小鼠肝脏中Nrf2的核表达。

总结：TRIM31和Nrf2之间可能存在蛋白质相互作用。

研究结论

在CCl4诱导的小鼠模型和体外TGF-β1刺激的HSCs中，Mul治疗显著改善了HSCs的活化和胶原沉积。

本研究阐明了Mul主要通过调控TRIM31/Nrf2信号通路，来减轻受损肝细胞的炎症反应和氧化应激，进而抑制HSCs的活化，从而最终改善肝纤维化。

Mul靶向TRIM31/Nrf2轴来治疗肝纤维化的作用，无疑为今后临床上防治肝纤维化提供了一种新的思路和策略。

主编点评

孙超主任✦

对于各种类型的慢性肝病来说，阻断和逆转肝纤维化的进展，是降低肝硬化和肝癌发生率，改善患者生活质量和延长生存时间的关键环节。目前临床上包括扶正化瘀、安络化纤等中成药物被证明确有抗肝纤维化的作用，现代分子生物学技术的发展也有助于阐明其作用机理和治疗靶点。另外，借助我国丰富的中医药资源，挖掘药效确切的天然单体成分，深入开展机制研究，同样是药物改进与研发过程中的创新思路。本期分享的文章有以下亮点：

1. 本研究体内实验部分，一方面利用CCl4诱导的小鼠肝纤维化经典模型，阐明Mulberrin呈剂量依赖性的逆转纤维化进程，这一作用是通过调控TRIM31/NLRP3信号通路减轻受损肝细胞的炎症反应，同时促进Nrf2核转位对抗氧化应激实现的；另一方面，构建肝脏特异性敲除TRIM31基因的小鼠，证实Mulberrin的抗纤维化作用依赖于TRIM31/Nrf2轴，最终遏止肝纤维化进展。

2. 本研究体外实验部分，利用TGF-β1刺激的肝细胞条件培养基孵育肝星状细胞系，证明Mulberrin抑制TGF-β1/SMAD2/3信号通路、以及TRIM31依赖的NF-κB和NLRP3炎症信号通路，并且促进Nrf2介导的抗氧化作用，从而有效抑制肝星状细胞的体外激活。

3. 内源性免疫沉淀和WB结果证实了TRIM31和Nrf2存在蛋白质相互作用，验证了Mulberrin抗肝纤维化的治疗机制和靶点。

展望：

本研究证明了Mulberrin能够促进TRIM31/Nrf2轴发挥抗肝纤维化作用，但是TRIM31和Nrf2的蛋白相互作用机制仍不明确，可以借助分子对接等实验进一步探究，同时生物信息学手段例如RNA-seq测序有助于鉴定更多的Mulberrin药效机制和作用位点。

作者简介

李一凡

天津医科大学临床医学专业，硕士研究生在读。以共同第一作者身份发表SCI文章3篇，目前研究方向为慢性肝病与体成分异常之间的关系，以及调节性细胞死亡在不同肝损伤中的作用机制。

专家简介

孙超

副主任医师，本科毕业于北京大学医学部，天津医科大学医学/理学博士，日本兵库医科大学研究员。全国疑难及重症肝病攻关协作组成员。主持完成国家自然科学基金一项。担任SCI期刊Journal of Clinical and Translational Hepatology编委、2021年度杰出编委，任职Portal Hypertension & Cirrhosis首届学术委员会，Frontiers in Pharmacology/Mediators of Inflammation客座编辑。2020年在EASL（欧洲肝脏研究学会）年会做口头发言，2021年在AASLD（美国肝病研究协会）年会做壁板展示。获得EASL的“Full Bursary”和APDW的“Travel Grant”奖励。以通讯作者在Clinical Nutrition, Liver International, Cell Death & Disease, Hepatology Communications等杂志发表SCI文章50余篇，他引620余次，h指数14，研究成果被ASGE（美国胃肠内镜学会）和EASL发布的临床实践指南引用。目前研究方向为调节性细胞死亡在急慢性肝损伤中的作用机制，体成分异常、营养不良、衰弱、睡眠障碍以及微量元素对肝硬化预后的影响及干预措施。

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