蛋白质影响草酸钙肾结石形成的机制探讨

Berger GK, Eisenhauer J, Vallejos A, Hoffmann B, Wesson JA. Exploring mechanisms of protein influence on calcium oxalate kidney stone formation. Urolithiasis. 2021 Aug;49(4):281-290. doi: 10.1007/s00240-021-01247-5. Epub 2021 Feb 15. PMID: 33587148; PMCID: PMC8316271.

蛋白质影响草酸钙肾结石形成的机制探讨

一水草酸钙 (COM) 晶体是大多数肾结石的主要成分，但结石基质中的尿蛋白被认为是这些晶体形成结石的关键元素。最近的数据表明，石头基质中出现了数百种蛋白质，但没有解释包含如此多的蛋白质。我们提出了一种基于聚阴离子-聚阳离子聚集的蛋白质刺激 COM 聚集的结石形成模型，发现基质高度富含强阴离子和强阳离子蛋白质，这得到了支持。由于它们在水中的有限溶解度或电荷效应，许多其他蛋白质可能会被这些聚集体吸引。在聚精氨酸 (pR) 诱导的尿蛋白聚集体和 COM 结石基质中发现相似的蛋白质富集将支持这一假设。通过超渗滤从六名健康成人的随机尿液样本中获得纯化蛋白 (PP)。通过向 PP 溶液中添加两种浓度的 pR 来诱导蛋白质聚集；0.25 和 0.5 μg pR /μg PP。将每个级分的样品和原始 PP 混合物冻干并通过串联质谱法进行分析。将 pR 添加到 PP 样品中诱导的聚集体收集了一种蛋白质混合物，该混合物模拟了在 COM 基质中观察到的蛋白质分布，支持了我们的假设。某些丰富的阴离子蛋白质优先加入 pR 聚集体的明显不一致行为，当它们在 COM 结石基质中表现出降低的丰度时，表明该模型被过度驱动以聚集。在低 pR 添加时白蛋白总体偏好的逆转支持了这种解释。

肾结石是一种高度流行的疾病，研究引用的发病率从 1994 年的 5% 上升到 2012 年的近 9%。[ 1 ] 由于这种流行，它给患者和医疗保健系统带来了沉重的负担。存在多种此类结石，尽管绝大多数 (79%) 含有钙盐晶体。 [ 2 , 3 ] 然而，尽管其影响和普遍性很大，但除了钙晶体过饱和的要求之外，结石形成的根源仍然难以捉摸.[ 4 - 6 ] 虽然无机化合物草酸钙 (CaOx) 是罪魁祸首，但据推测，有机根的尿液成分可作为这些无机晶体的管道。 [ 2, 3 ] 按质量计，大约 65% 的有机成分由蛋白质组成，尽管糖胺聚糖甚至 DNA 和 RNA 等其他分子的含量较低。 [ 7-10 ]总的来说，这种有机成分占 2-3石料的重量百分比。 虽然结石形成者和正常患者的尿液蛋白质组非常相似，但结石基质蛋白质组与两种尿液蛋白质组显着不同。 [ 4 , 7 , 11 ] 最近的数据表明，数百种蛋白质出现在结石基质中，没有对包含如此多蛋白质的解释。[ 12 - 15 ] 我们已经提出，这些大分子的物理特性，由它们的相对丰度加权，可能会定义蛋白质在 CaOx 结石发病机制中的作用。[ 7] 较早的本体结晶研究和较新的表面科学研究都表明，阴离子蛋白质对 CaOx 结晶过程有很强的影响，长期以来，人们一直认为这种蛋白质在结石形成中很重要。 [ 7 , 16 , 17 ] 另一方面，阳离子蛋白在体外研究中几乎没有显示出对结晶过程的影响，尽管它们在几乎所有的石基质蛋白质组学研究中都被观察到。 [ 7 , 18 ] 此外，研究表明，蛋白质聚集体在石基质的设置中形成（相分离）聚阳离子-聚阴离子混合物，并且这些蛋白质聚集体可以促进 CaOx 晶体聚集和成核。7 , 18 , 19 ] 一旦这些蛋白质聚集体形成，许多尿蛋白就表现出对这种单独环境（阶段）的偏好。这些发现，当作为一个整体考虑时，表明强聚阴离子和强聚阳离子蛋白的聚集可能是一水草酸钙 (COM) 结石形成的触发因素。通过发现 COM 结石基质富含强阴离子和强阳离子蛋白来支持该模型。由于在水中的有限溶解度或电荷效应，许多其他蛋白质可能会被此类聚集体吸引，而其他蛋白质将保持分离（溶解在水中）。因此，我们预计尿蛋白对诱导的蛋白质聚集体或上清液表现出摄取选择性。通过质谱对这些馏分进行彻底分析对于解释这些数据至关重要。

方法

在 IRB 批准（协议编号 9305-03）后，从六名健康成人获得多个随机尿液样本。首先对样品进行尿液试纸测试以记录比重和 pH 值，并排除血液的存在。然后将样品离心以去除任何细胞碎片（1000 RPM x 5 分钟）。通过超渗滤从尿液样品中提取纯化蛋白 (PP)。首先，将 12 mL 样品通过 10 kDa 过滤器（6000 G x 70 分钟）离心。然后用 10 mM NaCl (6000 G x 60 min) 将 PP 洗涤 3 次。此时使用市售蛋白质染料试剂（BioRad Protein Assay Dye Reagent #5000006；Bio-Rad，Hercules，CA）测定每个样品中的蛋白质浓度，使用运行的 Bio-Tek PowerWave XS 读板器在 595 nm 处检测吸光度Gen5 1.11 软件。使用牛血清白蛋白作为标准对每个样品进行三次蛋白质测定。生成的 PP 储存在 -80 °C。在蛋白质结合实验之前，蛋白质溶液在室温下解冻。通过将 0.0158g NaCl 添加到 3 mL PP 溶液中来产生 100mM NaCl 溶液。通过以两种 pR 与 PP 的比例分别将 pR 添加到 PP 溶液中来诱导蛋白质聚集；0.25 和 0.5 μg pR /μg PP，使用分别从 6 名患者中收集的尿液样本。基于净电荷分析中的发现选择这些比率用于测试。

净电荷测定基于称为胶体滴定的胶体科学方法。在该方法中，制备的混合物含有不同比例的带电粒子或聚合物和带相反电荷的聚合物。通过带相反电荷的组分之间的静电吸引力形成聚集体，然后通过分光光度计中的浊度（吸光度）测量（我们的实验在 400 nm）进行定量。理论上，当来自每个组件的总电荷相等时，在这样的系统中会出现最大浊度（吸光度）。将每位患者的 PP 蛋白样品与不同量的 pR 混合的结果见于图1，其中吸光度相对于 pR 与 PP 的质量比 (g/g) 绘制。对于这 6 个样品，在平均电荷比 0.53±0.10 处观察到峰值吸光度。因此，本研究中使用的比率（0.5 和 0.25 μg pR /μg PP）应分别产生大致最大和半最大的聚集体形成。我们预计，当在较大的 pR 添加量下进行测试时，静电力可能会压倒其他蛋白质相互作用，从而产生在石基质中看到的选择性蛋白质包涵体。因此，较低的 pR 添加被包括在内，因为它应该更接近于在石头基质样品中展示的选择性。

图1：

吸光度与 pR/PP 混合比：

受试者样品和分光光度法在 400 nm 处的吸光度读数分别显示为每个受试者样品，如方法部分所述。样品 N1002D 的最大吸光度指定为 pR/PP 比率为 0.70。平均最大吸光度计算为 0.53±0.10。纳米：纳米

通过将适当体积的 pR 储备溶液添加到每种 PP 混合物中，然后使用磁力搅拌棒低速搅拌 60 分钟以避免湍流，以适当的混合比制备每种混合物。然后通过离心 (12000 G x 60 分钟) 在每个样品中分离聚集相。小心倒出上清液以避免干扰沉淀。将沉淀分散在 3mL 蒸馏 H 2 O 中，首先在室温下放置 60 分钟，然后剧烈摇动。然后将其置于温水浴 (45°C) 中 60 分钟。在此步骤之后，使用相同的蛋白质测定方案测量蛋白质聚集体含量，然后在 -80°C 下储存。同样，在-80°C 储存之前，类似地测定上清相的蛋白质含量。

凝胶内样品消解

将每个级分的样品和原始 PP 混合物冻干并送到 Mayo Clinic 的蛋白质组学核心实验室进行分析。根据蛋白质测定数据，将样品重新溶解在 0.1% SDS/20 mM Tris 中，最终浓度为 1 μg/μL。每个样品总共上样 3 μL，并在 18 孔 4-15% Criterion XGT 凝胶上分离，然后进行 BioSage 胶体蓝染色和银染色。然后对每个样品的泳道进行光密度分析，以确保凝胶上的标准化加载以进行质谱分析。所有归一化的 pR 结合、pR 上清液和 PP 样品根据之前凝胶上的最低样品产量调整为等量，然后加载到 AnyKD MiniProtean TGX 凝胶上，并用 BioSafe 胶体考马斯蓝染色。切下相等面积的泳道片段并在 200uL PCR 管条内进行凝胶内消化。将每个凝胶切片切成 1-2mm 的小块。样品最初在 200mM Tris (pH 8.2) 中重新水合，用 40% 乙腈/200mM Tris 脱色，在 60°C 下用 50mM Tris 中的 50mM TCEP 还原 30 分钟，用乙腈洗涤，然后烷基化 30 分钟（暗，室温）与 50mM Tris 中的 25mM 碘乙酰胺。烷基化样品用 25mM Tris 洗涤并用乙腈脱水，然后在 37°C 下用 80uL 的 2ng/uL 胰蛋白酶溶液在 25mM Tris (pH 8.2) 中和 0.0002% Zwittergent 3-16 中消化过夜。消化后，加入 15uL 4% TFA 和 60uL 乙腈后，将肽在室温下孵育 30 分钟。将提取的肽回收到干净的 PCR 管中。将用 60uL 乙腈进行的第二次萃取与第一次萃取相结合。提取物在-80°C下冷冻，在真空离心机上浓缩至干，并储存在-20°C直到LC-MS/MS分析。

液相色谱串联质谱分析 (LC-MS/MS)

在与 Dionex Ultimate 3000 RSLC Nano 液相色谱仪连接的 Q-Exactive 质谱仪上通过 nanoLC-MS/MS 分析在 0.2% 甲酸、0.1% 三氟乙酸 (TFA) 和 0.001 Zwittergent 3-16 水溶液中重新溶解的消化样品（均来自马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔 (Thermo Fisher)。自动进样器进样在装有 Halo 2.7um 肽 ES-C18 固定相（Optimize Technologies, Oregon City, Oregon）的 0.33uL EXP2 捕集阱上进行预浓缩。将肽转移并用 0.2% 甲酸 (FA)、0.05% TFA 的水溶液以 8 uL/min 的速度洗涤 6 分钟。然后将阱与自填充有 2.7um Poroshell 120S EC-C18 固定相（Agilent Technologies）的 32cm x 100um id PicoFrit nano LC 柱在线切换。使用从 5% B 到 50% B 的线性梯度在 60 分钟内以 400nL/min 的速度从阱和柱中洗脱肽。流动相 A 为 2% 乙腈的 HPLC 级水中，含 0.2% FA，流动相 B 为乙腈，含 10% 水、10% 异丙醇和 0.2% FA。捕集阱和 LC 色谱柱均加热至 40°C。

使用数据相关采集 (DDA) 方法，从 m/z 340 到 1800 以 60,000 分辨率（AGC=3e6，最大填充时间 50ms）收集 MS1 母离子扫描数据，选择电荷 (z) 为的前 20 个母离子2、3 或 4 用于 MS2 光谱，分辨率为 15000（AGC = 2e5，最大填充时间 = 60ms，HCD 归一化碰撞能量为 27，隔离宽度 = 2.5m/z，偏移 = 0.3m/z，固定第一质量 = 140，动态排除 = 30s）。

LC-MS/MS 生物信息学和统计分析

使用 Comet 搜索算法提取 RAW 文件中的所有蛋白质光谱峰并针对 UnitProtKB 人类数据库（16,890 个蛋白质，9,512,957 个氨基酸）进行搜索。数据库搜索中的参数包括甲硫氨酸的氧化 (+ 16-Da)、半胱氨酸的烷基化 (+ 57-Da)、1.5-Da 的肽耐受性以及最多 3 个错过的胰蛋白酶切割的允许。使用既定标准确定蛋白质峰，并将数据导出为 .EZ 文件，以使用蛋白质组学 Visualize 软件进行进一步分析。 [ 20] 在 Visualize 中删除冗余并应用软件概率分数 ≤ 0.85 (5% FDR) 来过滤数据以确保适当的严格性。然后将过滤后的数据集导出到 Excel，并使用 RStudio 和 Tidyverse ( https://www.tidyverse.org/ ) 提供的工具在 R 中对数据进行分数分析。 [ 21 , 22] 在每次样品运行中，蛋白质分数计算为识别蛋白质的扫描次数与导致阳性识别的扫描总数的百分比。然后聚合每种样品类型，并计算平均蛋白质分数，以比较不同样品类型的蛋白质相对丰度。GRAVY 是使用 Python 编写的自定义代码计算的，使用来自 ExPASy ( https://web.expasy.org/protscale/pscale/Hphob.Doolittle.html )的氨基酸和来自 UniProt 的蛋白质序列的假设 GRAVY。[ 23 ] 假设等电点使用 BioPython 提供的工具进行计算。[ 24 ]

所有数据均报告为平均值加上或减去标准偏差 (SD)，并使用非配对 t 检验报告统计显着性以报告统计显着性 (p<0.05)。

结果

收集的 6 名患者的人口统计数据和 12 份随机尿液样本（每位患者 2 份）的尿液特征总结在表格1. 从平均年龄为 51 ± 11 岁的健康患者（3 名男性；3 名女性）中收集随机尿液样本。在试纸测试中，所有样本的血液均为阴性。比重范围为 1.005-1.020（平均 1.008 ± 0.005），pH 范围为 6.0-7.5（平均 6.7 ± 0.4）。该人群与结石前尿 (SFU) 人群的人口统计数据相当匹配，具有相似的年龄、种族和性别分布。

表格1：

受试者人口统计学和尿液特征：

报告了所有 12 个样本（6 名受试者各 2 个样本）的尿液 pH 值和比重以及性别和年龄数据。所有六名受试者都很健康，没有 COM 结石形成的个人或家族史。0.25 pR 和 0.5 pR 代表通过将聚精氨酸 (pR) 添加到纯化的蛋白质 (PP) 溶液中诱导聚集的两个比率；0.25 和 0.5 μg pR /μg PP。

性别

年龄（岁）

0.25 pR pH

0.25 pR 比重

0.5 pR pH

0.5 pR 比重

在单独的窗口中打开

我们之前研究的 CaOx 石基质和 SFU 的原始质谱数据使用上述相同的彗星搜索算法重新分析，然后用于生成参考数据，用于与 pR 诱导聚集体的蛋白质富集数据进行比较。 [ 4 ] 在在此重新分析中，一个 CaOx 结石基质样品 (M2) 被淘汰，因为总扫描计数相对较低且识别的蛋白质数量较少，然后使用每种蛋白质的所有样品的百分比扫描计数的平均值计算平均蛋白质组分布观察到。 [ 4] 以相同方式重新分析全套 SFU 样品，并用于确定平均 SFU 蛋白质组。在每次添加 pR 时，计算每个部分（聚集体和上清液）中的平均蛋白质相对丰度（扫描计数百分比）。所有数据均以平均值±标准差表示。数据汇总于表 2对于 COM 基质中高度丰富和普遍存在的蛋白质，并与早期研究中的 SFU 相比，[ 4 ] 而表3包含在 COM 基质中发现的蛋白质数据，与 SFU 相比，这些蛋白质显示出对尿液的偏好。[ 4 ] 请注意，在记录新尿液样本的质谱时使用更大的动态排除窗口会导致相对丰度降低一些高度丰富的蛋白质（例如，白蛋白和尿调节素），但将新尿液样本中鉴定的蛋白质数量扩大到 981 种；几乎是之前分析的三倍。三组尿液蛋白质组（新尿液样本、SFU 和正常尿液 - NU - 早期出版物的样本）[ 11 ] 的等电点分布非常相似（见补充数据 SD1）。

表 2：

COM 石基质和 pR 聚集体之间蛋白质富集模式的比较。

在重新分析的数据中确定了在 COM 结石基质和尿液样本中发现的 20 种最丰富的蛋白质。 [ 4] 在表中，COM 结石基质的蛋白质选择性是通过比较 COM 基质和 SFU 中的相对丰度（光谱计数百分比）来定义的。在添加两次 pR（0.25 和 0.5 g pR/g PP）时测试了 pR 诱导的聚集体的蛋白质选择性，并在右侧的四列中报告。与在 COM 结石基质中观察到的行为一致的对 pR 聚集体显示选择性的蛋白质以绿色突出显示。与 COM 基质相比，对 pR 聚集体的选择性不一致的蛋白质以红色突出显示。对 pR 聚集体或上清相（差异小于 2 倍）没有明显选择性的蛋白质保持白色。ND 表示在该样本中“未检测到”。绿色突出显示的优势表明该模型中的行为基本一致。

表3：

COM 结石基质和 pR 聚集体之间蛋白质富集模式的比较，对于更喜欢尿液的蛋白质。

本表中列出了在 COM 基质中发现的丰富蛋白质，但显示出对尿液的偏好。如在表 2，COM 结石基质的蛋白质选择性是通过比较 COM 基质和 SFU 中的相对丰度（％光谱计数）来定义的。在添加两次 pR（0.25 和 0.5 g pR/g PP）时测试了 pR 诱导的聚集体的蛋白质选择性，并在右侧的四列中报告。与在 COM 基质和尿液中观察到的行为一致的对 pR 上清液显示选择性的蛋白质以绿色突出显示。表现出不一致行为的蛋白质以红色突出显示，而对 pR 聚集体或上清液未显示明显选择性的蛋白质未突出显示（差异小于 2 倍；白色）。ND 表示在该样本中“未检测到”。三种蛋白质来自表 2（ALBU、UROM、EGF）尽管偏爱尿液，但在 COM 基质中相当丰富，而其他 11 种则以相对较低的丰度存在于 COM 基质中。后一组中的大多数蛋白质在 pR 实验中没有表现出明显的偏好，尽管这一观察结果可能反映了被吸入 pR 聚集体的趋势，因为这些蛋白质中的大多数是聚阴离子。添加 0.5g pR/g PP 时，聚阳离子 IPSP 很可能被 pR 聚集体排斥。

石头 vs 尿液

0.25g/g pR 添加

0.5g/g pR 添加

缩写。

入藏 号

蛋白质

PI

%COM

% SFU

% pR 结合 (0.25)

% pR 上清液 (0.25)

% pR 结合 (0.5)

% pR 上清液 (0.5)

表 2列出了 COM 基质中 20 种最丰富的蛋白质，这些蛋白质也在来自至少一种 pR 添加的 6 个新尿液样本中的至少 5 个中观察到，按它们在 COM 基质中的丰度降序排列。还包括在 SFU 样品中观察到的蛋白质丰度，用于与 COM 基质丰度进行比较。COM 基质中的富集定义为 COM 基质中蛋白质的相对丰度超过其在 SFU 中的相对丰度。pR 聚集相中给定蛋白质的富集类似地定义为该蛋白质在聚集相中比在上清相中表现出更大的相对丰度。pR 聚集相中的富集与 COM 基质富集行为之间的一致性分别通过 pR 数据集中绿色背景突出显示的 0.5g/g 和 0.25g/g pR 添加表示；然而，不和谐的行为由红色背景突出显示。在 pR 聚集体实验中没有明显偏好的蛋白质具有白色背景（聚集体和上清液相之间的差异小于 2 倍）。绿色背景的优势证实了这些蛋白质中的大多数在 pR 聚集相和 COM 石基质中显示出一致的富集，在 0.5g/g pR 添加时，20 种中的 13 种一致，在 0.25g/g 添加时，20 种中的 16 种一致。在添加 0.5g/g pR 时，3 种明显不一致的蛋白质（白蛋白、尿调节素和前表皮生长因子；红色突出显示）是显着的强阴离子蛋白质，在实际结石样品中表现出对尿相而非 COM 基质的偏好. 作为聚阴离子，基于静电吸引力，每个都将被吸引到富含 pR 的聚集体相，但在较低的 pR 添加时，白蛋白（最弱的聚阴离子）转向偏好上清相（与结石患者的观察结果一致）作为其他相互作用支配了它的相位行为。在 0.5g/g pR 添加时没有明显偏好的 4 种蛋白质中，所有蛋白质在尿液中都表现出相对较低的丰度，限制了这种明显差异在它们的相位偏好中的重要性。尽管如此，两种聚阳离子（血红蛋白 α 和组蛋白 H4）的集体行为值得关注，因为它们在 0.25g/g pR 添加时转变为一致行为，这与它们在聚合相中 pR 所经历的预期静电排斥一致。在 0.5g/g pR 时，有效地，尿蛋白中的所有负电荷都可以被 pR 上的阳离子电荷覆盖，这可以取代与血红蛋白 α 或 H4 的潜在结合，将它们推入上清液相。另外两种蛋白质是弱聚阴离子（血红蛋白β和补体因子B），它们的行为不能用静电相互作用轻易解释。一种蛋白质在 0.25g/g pR 添加（纤维蛋白原 α 链）时没有选择性，但在 0.5g/g pR 添加时一致，是聚阴离子，这可能是由于 pR 富集聚体中静电引力的增加所致。另外两种蛋白质是弱聚阴离子（血红蛋白β和补体因子B），它们的行为不能用静电相互作用轻易解释。一种蛋白质在 0.25g/g pR 添加（纤维蛋白原 α 链）时没有选择性，但在 0.5g/g pR 添加时一致，是聚阴离子，这可能是由于 pR 富集聚体中静电引力的增加所致。另外两种蛋白质是弱聚阴离子（血红蛋白β和补体因子B），它们的行为不能用静电相互作用轻易解释。一种蛋白质在 0.25g/g pR 添加（纤维蛋白原 α 链）时没有选择性，但在 0.5g/g pR 添加时一致，是聚阴离子，这可能是由于 pR 富集聚体中静电引力的增加所致。

表3列出了 14 种在 COM 基质中显着但丰度低于在 SFU 中观察到的蛋白质，并与它们在 pR 聚集实验中的选择性进行了比较。 [ 4] 应用相同的背景颜色编码模式，在 pR 实验中具有一致的选择性，用绿色突出显示，不协调的选择性用红色突出显示，没有明显偏好的蛋白质用白色背景显示。此列表中的大多数蛋白质在 SFU 和这些新的尿液样本中都非常丰富，并且大多数在中等等电点 (pI) 范围内；虽然主要是聚阴离子（pI<7）。这些蛋白质中的大多数没有显示选择性或在 pR 数据集中不一致。如上所述，这些聚阴离子在 0.5g/g pR 添加时的不一致行为可能反映了它们对 pR 的静电吸引力，并且这种行为对于 pI<6 的蛋白质更为常见，包括白蛋白、尿调节素、AMBP 蛋白和凝溶胶蛋白。 kininogen-1 (pI=6.34) 也属于该组。其中两种蛋白质（白蛋白和 AMBP 蛋白）在较低的 pR 添加时是一致的，这可能是由于在较低的 pR 添加时静电吸引力较弱。剩余的聚阴离子表现出的非选择性行为可能与它们对 pR 聚集体的静电吸引力压倒其他相互作用有关。此列表中仅出现一种相对较弱的聚阳离子（血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂），其在 0.5g/g pR 添加时的一致性可能反映了 pR 在聚集体中的静电排斥，类似于上述 H4 和血红蛋白 α 的行为。剩余的聚阴离子表现出的非选择性行为可能与它们对 pR 聚集体的静电吸引力压倒其他相互作用有关。此列表中仅出现一种相对较弱的聚阳离子（血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂），其在 0.5g/g pR 添加时的一致性可能反映了 pR 在聚集体中的静电排斥，类似于上述 H4 和血红蛋白 α 的行为。剩余的聚阴离子表现出的非选择性行为可能与它们对 pR 聚集体的静电吸引力压倒其他相互作用有关。此列表中仅出现一种相对较弱的聚阳离子（血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂），其在 0.5g/g pR 添加时的一致性可能反映了 pR 在聚集体中的静电排斥，类似于上述 H4 和血红蛋白 α 的行为。

最后，表 4列出了符合 COM 结石基质中前 60 种蛋白质丰度标准但在 SFU 或这些新尿液样本中未观察到的 29 种蛋白质。显然，它们富含 COM 基质，但由于它们在正常尿液中的丰度低或不存在，因此在本研究中无法判断它们对聚阴离子/聚阳离子聚集体的选择性。许多这些蛋白质是强离子的，包括阴离子和阳离子蛋白质，并且可能参与聚阴离子/聚阳离子聚集过程。此外，它们中的许多是细胞内或核内的，支持细胞损伤过程的作用，如前所述。 [ 4 ]

表 4：COM 结石基质中丰富的蛋白质，但尿液样本中不存在。

蛋白质按 COM 结石基质中丰度递减的顺序列出，包括它们的等电点 (pI) 和 COM 结石基质中的光谱计数百分比 (%COM)。

缩写

访问号

蛋白质

PI

%COM

这些实验的前提是，在 CaOx 结石基质中观察到的复杂蛋白质混合物可能是由蛋白质之间的物理化学相互作用产生的，而不是由生物过程产生的，我们假设由此产生的蛋白质聚集体对肾结石产生关键的控制影响形成。虽然许多研究人员已经很好地确定了 COM 基质中存在的蛋白质的多样性，[ 12 - 15 ] 我们早期使用定量质谱方法的研究特别强调了强阴离子和强阳离子蛋白质的富集。 [ 4] 这一观察结果表明聚阴离子/聚阳离子聚集体形成的可能性是一种疾病机制，因为我们之前已经证明这种聚集体促进了 COM 结晶和聚集，以及正常尿蛋白的选择性吸附。[ 7 ] 在我们的研究中观察到的良好一致性通过将 pR 添加到正常尿蛋白混合物中诱导的 COM 结石基质和聚阴离子/聚阳离子聚集体之间的特定蛋白质分布细节（同一性和相对丰度）的比较增强了我们对该模型的信心，尽管这些实验无法确定这些蛋白质的作用。有几点需要回顾与此比较相关的内容。

首先，我们注意到研究人群虽然很小（只有 6 名患者），但与早期尿液研究的人口统计数据相匹配（年龄、种族和性别分布大致匹配的中年人）；[ 4 ] 然而，这个细节并不重要到我们的解释。每种蛋白质在 pR 聚集体选择性方面的行为模式预计与每种蛋白质的初始量无关；比较只需要每种蛋白质对 pR 聚集相的选择性。此外，我们将注意力集中在最丰富的蛋白质上；由于与低丰度蛋白质的定量评估相关的更大不确定性，大多数患者样本（至少 6 个样本中的 5 个）的最小丰度阈值大于 0.5% SC。

这两个数据集之间惊人的相似性在表 2，其中包括 COM 结石基质中最丰富的蛋白质。这些蛋白质中的大多数富含 COM 石基质，并且大多数表现出对 pR 聚集相的偏好。在这种比较中，不一致的蛋白质通常更喜欢自然界中的尿相，但可能通过该模型系统中的强静电吸引力被吸引到 pR 聚集体相。中的蛋白质表3对蛋白质富集模式的相似性的支持较少，尽管它们并不特别与这种解释相矛盾。两组之间的大多数特定蛋白质差异可以用 pR 聚集实验中压倒性的静电相互作用来解释，这需要更全面的审查。本实验中有关单个蛋白质行为的详细信息也突出了其他尚未定义的影响蛋白质聚集的相互作用的存在，在某些情况下，这些相互作用超过了静电力。

就 pR 聚集相而言，与尿蛋白的静电相互作用将是有吸引力的或排斥的。静电力的大小将取决于尿液蛋白上存在的任一符号的带电基团的净数量，这些带电基团可以与 pR 上的“n”个正电荷相互作用。不幸的是，pI 没有提供关于任何给定蛋白质中正电荷和负电荷平衡的净电荷量值，并且不可否认，这里报告的 pI 值不包括可能的翻译后修饰。然而，我们仍然可以使用这些 pI 值来推断预期的蛋白质行为。我们知道极端 pI 值意味着相对不存在带相反电荷的氨基酸。例如，pI<5 表示几乎完全存在羧酸（带负电）侧链，

大多数尿蛋白具有净负电荷，如整个混合物的 pI<7 所示，因此添加到样品中的 pR 应将大多数尿蛋白吸引到聚集相。 [ 11 ] 对于强阴离子蛋白，如 UROM 和前表皮生长因子（pI 为 5.5 或更低），对 pR 的静电吸引力可能会压倒其他因素（即亲水性），否则它们可能会偏爱尿相。大多数其他蛋白质在表 2具有较弱但仍明显仍然存在的阴离子电荷（pI 在 5.5 和 6.5 之间）显示出对 COM 基质和 pR 聚集相的偏好，可能是因为它们较弱的净电荷使它们的亲水性降低。阴离子蛋白质表3在结石形成过程中明显偏爱尿相的人在 pR 聚集体实验中的相偏好在很大程度上是模棱两可的，这表明对 pR 聚集体相的偏好更强（或厌恶程度更低），这可能与该模型的过度驱动性质有关系统。相反，聚阳离子应该从 pR 聚集相排斥，并更喜欢上清相，特别是在较大的 pR 添加时，导致在 COM 基质偏好方面的一致行为表3（血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂）和不一致的行为表 2（H4 和血红蛋白 α）。有趣的是，在这个模型系统中，少数几近中性的蛋白质表现得与聚阳离子相似（血红蛋白 β，pI=6.74表 2和 TRFE，pI=6.76 英寸表3）。

一些阴离子电荷较弱的蛋白质，如白蛋白 (pI=5.92,表 2) 和 AMBP 蛋白 (pI=5.98,表3)，表现出更复杂的行为，表明静电力和其他力之间的平衡更加均衡。在这两种情况下，这些蛋白质以 0.5g/g pR 添加量被拉入 pR 聚集体相，但它们更喜欢在 pR 添加量较低时停留在尿液（上清液）相中。对于大多数其他具有中间等电点 (pI=6±0.5) 的蛋白质表 2，力的平衡导致对聚集相的明显偏好，无论是COM基质中的晶体还是我们模型中的pR。疏水性可能发挥了作用，因为在我们的 pR 模型中，任何一种聚集相都不像尿液或上清液相那样像水环境。对于相似的蛋白质表3，他们对尿相的偏好可能代表了固有的亲水性，这在 pR 添加实验中仅被静电力部分克服，导致该模型中对聚集体或上清液相没有明显的相偏好。

使用上述方法对先前获得的 COM 矩阵 [ 4 ] 和 SFU [ 4 , 11 ] 的原始质谱数据进行再分析也值得评论。虽然这种操作预计单个蛋白质丰度的微小差异，但在比较不同数据集时减少了潜在的错误来源。关于尿液与聚集相的总体丰度或偏好，没有观察到显着变化。对于最丰富的蛋白质，去除一个 COM 基质样品（参考文献4中的 M2 ）[ 4] 来自 COM 矩阵数据集对降低骨桥蛋白基质含量和降低其表观富集度具有相对较大的影响，因为与其他 7 块结石相比，该样本的骨桥蛋白含量过大。这种变化对参考文献4中总结的总体结论影响很小，如补充数据图 SD2和SD3中所示。 [ 4 ]图 SD2显示了重新分析的 COM 结石基质数据中 60 种最丰富蛋白质的 %SC 与各种蛋白质的关系（连接点）。还显示了来自重新分析的 SFU 数据（条形图）的相同蛋白质的 %SC 数据，这些数据仍然证明了先前陈述的结论。 [ 4] 除了基质蛋白等级排序的微小差异外，仅注意到骨桥蛋白水平的预期变化和血红蛋白 β 的降低与之前的出版物相比存在差异（参考文献4中的图 2 ）。[ 4 ] 在图 SD3中，对于重新分析的 COM 基质（连接点）和 SFU（条形）数据，以 pI 的 0.5 个单位增量分组的蛋白质的相对丰度 (%SC) 进行比较，再次证明了 COM 基质中强阴离子和强阳离子蛋白质的选择性摄取，如之前提到过（参考文献4中的图 3 ）。 [ 4] 新旧分析之间的主要区别在于 pI 在 4.00-4.49 范围内的蛋白质相对富集度降低，这主要是由于骨桥蛋白相对丰度的降低。最后，表 SD2总结了修订分析中前 60 种蛋白质中的强阴离子和强阳离子蛋白质，仅排除核磷蛋白，蛋白多糖 3 和多聚体 1 包含在新组中。显然，与最初报告的结果相比，COM 矩阵和 SFU 的重新分析数据集在任何重要方面都没有变化。 [ 4 , 11 ]

尿液中缺乏许多强离子蛋白是本研究的一个局限，因为这些蛋白质在结石基质中异常突出，并且预计会与 COM 晶体表面发生强烈相互作用。虽然很难确定该模型中此类蛋白质的行为，但本研究中观察到的此类蛋白质的少数例子似乎支持我们的模型。大多数具有中等 pI 的蛋白质可能更可能通过加入 pR 诱导的聚集体来模拟对 COM 基质的吸附。基于静电或 COM 晶体相互作用无法预期的结果。它们包含在石头基质中暗示了石头形成和我们的模型系统常见的一些其他重要的相互作用力（非静电），尽管我们无法从这些结果中定义它们的性质或它们在结石形成中的作用。同样，本研究无法回答更大的问题，即 COM 晶体或蛋白质聚集体是否会引发结石形成。当然，某些相对稀有的蛋白质对 COM 晶体表面的高亲和力，再加上人们通常观察到的结石生长缓慢，可以通过长时间浓缩这些不寻常的蛋白质并产生观察到的分布。然而，细胞损伤诱导释放这些蛋白质的替代假设仍然很有吸引力，因为这些蛋白质中的大多数通常存在于人类的细胞内或核区室中。关于细胞损伤，25 ]

结论

将 pR 添加到 PP 样品中诱导的聚集体收集了一种蛋白质混合物，该混合物模拟了在 COM 基质中观察到的蛋白质分布，支持了我们的假设。比较各种蛋白质的结果，很明显，需要静电相互作用以外的相互作用力来解释 COM 基质或 pR 聚集体在尿（水）相上的蛋白质选择性，尽管这些其他相互作用力的性质在此无法确定学习。我们的尿液样本中缺乏已知在 COM 结石基质中突出的胞浆内和/或核内蛋白，并且缺乏关于尿液蛋白与 COM 表面结合的数据，这些限制了未来研究中需要探索的特征。