JACS | K-RAS(G12R)靶向治疗新突破

导读

K-RAS难以成药主要有两点原因：

一是由于KRAS蛋白的空间结构缺乏较深的疏水口袋, 阻碍了高亲和力抑制剂的识别；

二是KRAS对核苷酸GTP亲和力极强，相对一般激酶（Kinase）的纳摩尔级别结合亲和力， KRAS与底物皮摩尔级别的结合亲和力是非常高的。药物很难与GTP竞争，难以结合KRAS蛋白并抑制其活性。

K-RAS 突变是人类癌症中最常见的致癌驱动因素之一。虽然 G12C 突变体的小分子抑制剂已经成功开发，但对其他 KRAS 热点突变体的等位基因特异性抑制仍然具有挑战性。

作者 | 阿卜

2022年8月24日，加州大学旧金山分校霍华德休斯医学研究所Kevan M. Shokat教授团队在JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY(JACS)期刊上发表了题为Chemoselective Covalent Modification of K-Ras(G12R) with a Small Molecule Electrophile的文章。作者以K-RAS(G12C)抑制剂（MRTX849）的结构为母核，引入能够共价靶向精氨酸的双酮酰胺结构，成功开发出K-RAS (G12R)共价抑制剂。

doi: 10.1021/jacs.2c05377

K-Ras(G12R)的共价化学配体的发现

在生理 pH 值下，精氨酸的胍基团(pKa3 = 12.5)完全质子化具有弱亲核的。为了实现突变精氨酸的化学选择性靶向，作者首先考虑了优先与胍或脒反应的官能团，设计合成的化合物 3 具有 α,β-二酮酰胺。

当将 100 μM 化合物 3（分子量 = 674 Da）与重组 K-Ras（G12R）·GDP（GDP = 鸟苷二磷酸）在 pH 7.5 和 23 ℃下孵育并通过完整蛋白质质谱监测反应时，观察到形成两种新的蛋白质种类，其分子量与化学计量共价加合物一致，损失一或两个当量的水（分别为 +656 Da 和 +638 Da，图 1C）。作者假设该反应的产物包括与 Arg12 的咪唑啉加合物及其脱水产物（图 1B），尽管它们的化学特性仍有待确定。

图一化合物3的合成及性质研究

化合物3对精氨酸的选择性

在pH7.5下延长孵育后，化合物3未修饰野生型 (WT) K-Ras·GDP（图 2A, 2B），证实了其与Arg12的特异性。

化合物3与K-Ras(G12R)·GppNHp (K-Ras突变位点是G12R，并且含有GppNHp这样一个GTP水解酶) 的反应要慢得多，72 小时后修饰 <5%（图 2A）。该反应依赖于 pH 值，并且在 pH 值 6 时速率大大降低。反应速率在 pH 值 8 时达到最大值，并且在pH值9时没有进一步增加（图 2C）。与未修饰的 K-Ras(G12R)·GDP 相比，K-Ras(G12R)·GDP·3 加合物的热稳定性显着提高（图 2D），熔融温度提高了 9.1 摄氏度。

图二探究化合物3的特异性

K-Ras(G12R)·GDP·4加合物的晶体结构

K-Ras(G12R)·GDP 和化合物4（化合物 3的结构类似物）的共晶，其衍射到 1.7 Å（图3A)，化合物 4 结合在 K-Ras 的 Switch II 口袋中，配体和蛋白质之间的共价键具有明确的电子密度（图 3A）。来自 η 氮的亲核加成也似乎是立体选择性的，因为电子密度清楚地表明叔醇是 S-构型（图 3A，B）。加合物的构象也不同于共价K-Ras (G12C)配体，如 MRTX849（图 3D）：加合物是在远离蛋白质表面的地方形成的，结构中的酰胺羰基不参与氢键与 Lys16 的相互作用。

图三 K-Ras(G12R)·GDP·4加合物的晶体结构

化合物3对K-Ras的共价修饰

探究3和Arg12之间的反应是否会导致K-Ras(G12R) 的功能性抑制，作者测试了未配体和化合物3结合的K-Ras(G12R) 的核苷酸交换活性。化合物3抑制Sos介导的交换并显着降低EDTA介导的交换速率。

为了在复杂的蛋白质组中探索精氨酸靶向亲电试剂对K-Ras的共价修饰，利用了K-Ras和3之间的反应后分子量增加（图 4B）。反应性的差异表明化合物3在细胞裂解物中保持活性，但不能与内源性 K-Ras(G12R) 结合。化合物3和4在浓度低于 100 μM 时不显示细胞活性。

作者观察到内源性 K-Ras(G12R) 的共价修饰，Ras 带的向上移动证实了K-Ras(G12R) 的主要 GTP 核苷酸状态可以是其治疗靶向的限制因素。这代表了未来优化的机会，要么通过在 GTP 结合状态下识别 K-Ras 的配体支架，要么通过将 K-Ras 转移到其 GDP 结合状态。

图四核苷酸交换和共价修饰

总结与展望

作者使用 α,β-二酮酰胺作为优先的精氨酸反应性官能团，鉴定了 K-Ras(G12R) 的第一个突变体选择性共价配体。发现这些配体与K-Ras (G12R) 产生稳定的咪唑鎓加合物，并使用 X 射线晶体学直接观察到一种此类加合物的结构。他们的工作为靶向该癌基因迈出了重要的第一步，未来的药物化学优化可能会产生针对 GTP 结合形式的更有效的配体。

参考文献： [1] Zhang Z, Morstein J, Ecker AK, Guiley KZ, Shokat KM. Chemoselective Covalent Modification of K-Ras(G12R) with a Small Molecule Electrophile. J Am Chem Soc. 2022 Sep 7;144(35):15916-15921. doi: 10.1021/jacs.2c05377. Epub 2022 Aug 24. PMID: 36001446; PMCID: PMC9460778.