【论肿道麻】拉曼光谱学在乳腺癌诊断中的应用现状、挑战和未来前景

尽管乳腺癌的临床诊治已有重大进展，但它仍是世界范围内导致人类死亡的主要癌症之一。如果能在肿瘤的早期发现和诊断乳腺癌，患者的存活几率会大大增加。拉曼光谱学技术是一种无损分析技术，可以快速提供组织的生化成分和分子结构信息。在癌症的诊疗中，能在肿瘤生成早期即捕捉到其形态及结构变化。2021年12月，英国阿伯丁大学的研究人员发表在《British Journal of Cancer》杂志上名为Raman spectroscopy: current applications in breast cancer diagnosis, challenges and future prospects的综述阐述了拉曼光谱在乳腺癌中的应用，并讨论了该技术在癌症研究和转化临床应用中的挑战和未来前景。

乳腺癌(breast cancer, BC)是全世界最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因之一。尽管在过去几十年中，BC的预防、诊断和治疗已取得了重大进展，但它仍然是影响全球健康的主要疾病之一。BC的转移性复发是导致BC患者死亡的主要原因。局灶性BC患者的5年生存率为99%，而诊断为晚期肿瘤时其五年生存率下降至27%。因此，当肿瘤仍处于局部时，早期发现和诊断对于改善患者预后至关重要。  

BC检测和诊断的临床方法多种多样。乳房x线技术作为早期BC检测的金标准，是乳房X线筛查方案的基础，该方案目前在全球范围内采用，目的是在临床症状出现之前检测到已存在的恶性肿瘤。尽管现有证据表明乳房X线技术可以降低BC死亡率，但作为BC的筛查和诊断工具，其总体疗效仍存在相当大的争议。对于乳腺组织致密的女性，乳房X线技术的敏感性则明显下降，而此筛查技术的适用年龄段也存在争议。不仅如此，乳腺X线筛查所带来的过度诊疗已成为这一技术的主要问题。然而，BC的诊断不能仅依靠影像学检查，组织病理学分析才是目前明确诊断的金标准。获取病理组织需要行创伤性操作，如手术切除或针芯活检，然而，约80%的活检病理为阴性，这表明在大多数情况下，创伤性活检并非必要的。此外，乳腺组织的复杂形态和分子异质性也对病理诊断的准确性提出挑战。近年来，光谱学因其无创性和高实时空间分辨率而成为生物医学研究中的强大工具，其中，拉曼光谱(Raman spectroscopy,  RS)因其具备快速、无损、客观地提供临床相关诊断信息潜力尤其具有吸引力。本文就RS在BC诊断中的应用作一综述。 

拉曼光谱技术在生物领域的应用

RS是一种光谱学技术，可探测生物样品中化学键相关的振动模式；由于不同的样本具有不同的化学成分，因此特定样本可获得特定的光谱，即“拉曼光谱”。该光谱在不同的频率上包含许多波段，这些波段是特定分子的结构和官能团所特有的。

不同的细胞和组织由不同的蛋白质、碳水化合物、脂类和核酸分子组成，他们都有多种相关的振动模式，RS通过探测这些振动模式来揭示样本的结构和组成信息。图1a展示了从MCF-7 乳腺癌细胞中记录的拉曼光谱样本，突出显示了光谱的三个主要区域：指纹区(200-1800 cm−1)、静默区(1800-2700 cm−1)和高波数区(2700-3300 cm−1)。高波数区主要是脂质、蛋白质和水的C-H、CH2、O-H、N-H振动，而“沉默区”大多为不含生物材料的振动带。生物样本的大多数峰值分布于“指纹区”，该区域展示了蛋白质、脂质、碳水化合物和核酸最丰富的分子振动模式。图1b显示了该区域的典型生物光谱，以及基于特定拉曼特征的BC检测研究的峰值分配示例。

生物样本具有高度复杂和异质性，它们所包含的大量拉曼振动模式都存在于指纹区中，从这些数据丰富的光谱中提取相关信息是极具挑战性的。生物样品的拉曼光谱包含代表不同分子组合的宽峰，相邻分子间的相互作用可能导致峰的位移；此外，大多数含有拉曼振动模式的分子在激发时也会发出荧光，且细胞自身荧光比拉曼信号强度高几个数量级，极大地影响光谱的分析和读取；不仅如此，无论是来源于拉曼系统内部还是外部的噪声源，包括宇宙射线、暗电流、弹噪声和读出噪声等都会使后续的数据处理复杂化。因此，在分析光谱之前，需要对数据进行预处理，去除不需要的背景噪声(图1c)，目前研究中常见的方法包括主要成分分析（principal component analysis，PCA）和基于信噪比阈值化方法。

图1 拉曼光谱和峰值分配示例

拉曼光谱学在BC检测与诊断中的应用

细胞和组织在癌变过程中发生的一系列形态和功能变化也伴随着显著的生化改变。例如，癌症的特征之一——细胞增殖失控，是促进DNA, RNA和蛋白质的产生，并破坏脂质代谢的。这些内部变化在疾病的临床症状出现之前早已发生，因此光谱可用于早期肿瘤的分类和分级。

此外，由于RS技术不需要大量的样本制备或标记，检测所需样本的获得过程是无创伤的，且可以在拉曼数据采集之后进行额外的处理和分析，因此拉曼技术在术中或床旁均具备应用潜力。此外，由于固态样本并非RS检测的必要条件，因此将RS技术应用于分析不同体液中的循环标记物来检测和诊断早癌也吸引了人们的兴趣。下文中我们将对拉曼技术分别用于体外样本、体内样本和体液样本在BC诊断中的应用做一讨论。

体外样本的应用

早期对乳腺组织拉曼光谱研究主要是对于乳腺肿瘤良恶性的定性研究。对人类乳腺组织的首次观察表明，傅立叶变换（Fourier transform, FT）RS具有近红外（near infrared ray, NIR）激发（1064 nm）的能力，能够区分正常和异常的乳腺组织。此后，大量研究工作开始着眼于乳腺病理相关的光谱变化上。  

正常和异常乳腺组织之间最显著区别在于脂类、类胡萝卜素和蛋白质的含量。使用可见激发技术从不同乳腺组织获得的光谱显示，与正常乳腺组织相比，异常乳腺组织中β胡萝卜素和脂质振动模式对应的峰值强度显著降低；同组研究人员随后又通过NIR激发再次证明了患病乳腺组织中脂质峰值强度的降低。他们还发现人类胶原的光谱与浸润性导管癌标本的光谱有相似之处。以脂类、类胡萝卜素和蛋白质的振动模式区分癌前/癌性和非癌性乳腺组织的方法也在随后的研究中得到进一步证实。

良恶性乳腺组织间的光谱差异其实是不太显著的。事实上，在对RS光谱进行PCA和logistic回归后，乳腺组织的良恶性才首次通过此法进行鉴别。这种方法对正常、良性和恶性病变组织的判别准确率分别是93%、87%、100%。多元统计方法联合RS已被证明是鉴别乳腺良恶性病变不可或缺的方法。

FT RS在鉴别乳腺良性、浸润前和恶性组织方面的疗效也已被证实。通过定性光谱分析，研究者发现氨基酸、核酸、蛋白质、碳水化合物和脂类对应的谱带强度变化可用于鉴别不同乳腺组织状态。同样，自发RS和壳分离的纳米粒子增强拉曼光谱(shell-isolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy，SHINERS)也已被用于区分正常、良性、癌前、侵袭前和侵袭性恶性乳腺组织。与前人的研究一致，他们发现正常乳腺组织的主要光谱特征与脂质振动模式相关，而病变组织则主要与蛋白质和核酸的振动峰值相关；他们观察到，随着乳腺组织的恶变，蛋白和核酸浓度逐渐增加，脂质浓度逐渐下降。

微钙化是通常在乳房X线摄片上观察到的微小钙沉积，是良性囊性病变或BC早期癌前病变的结果。乳腺微钙化分级主要依赖于其病变形态和病灶分布，而不是化学成分，因此在良性病例中无活检必要。微钙化分为I型或II型，I型由草酸钙组成，多与良性病变相关；II型由磷酸钙组成，主要是羟基磷灰石，与良、恶性病变均有关联。草酸钙和羟基磷灰石能有效地散射光子，并具有不同的光谱特征，因此RS对于区分I型和II型微钙化能效显著。Yang等人的研究通过结合光谱和形态学特征的方法，对乳腺组织的II型微钙化进行分析。他们提取微钙化主要化学成分——羟基磷灰石、碳酸盐和蛋白质的相对丰度，并发现其丰度与恶性肿瘤间的相关性。随后，他们利用受激发拉曼光谱（stimulated Raman spectroscopy，SRS）显微镜发现良性和恶性病例在几何和纹理特征中也存在统计学上的显著差异。有趣的是，在对观察结果进行分析后，他们发现，与单纯的光谱或影像方法相比，联合病灶几何特征与光谱学分析技术在诊断恶性肿瘤方面表现出最高的准确性(99.05%)和精确度(98.21%)。  

正如前文所提，乳腺组织具有高度异质性，而良性或恶性II型微钙化的二元分类法对于定义复杂的乳腺病理是极不完备的。目前，SHINERS联合PCA已被用于准确区分II型微钙化中的纤维腺瘤、不典型导管增生和导管原位癌；此外，高光谱SRS联合二次谐波成像也被用于鉴别特定的微钙化诊断，如：纤维腺瘤、不典型导管增生、导管原位癌和浸润性导管癌。

一项对79个正常和499个恶性乳腺肿瘤的组织芯片研究证实，RS对于鉴别良恶性乳腺组织的敏感性和特异性分别为90%和78%。脂质，尤其是脂肪酸光谱，在正常组织中占主导地位，而蛋白质光谱则是癌症样本的特征。以往的一些研究证实RS也可用于石蜡包埋的组织，这一特性进一步扩大了RS技术的适用范围。淋巴结超声检查是BC三重评估的重要组成部分，通过拉曼成像对腋窝淋巴结的冰冻或石蜡切片的组织学结果进行比较，在探测淋巴结转移及其来源方面具有很大的前景。

体内应用

已有研究报道便携式手持拉曼探针可用于鉴别离体乳腺组织的良恶性以及腋窝淋巴结的评估，这展示了RS用于术中BC诊断的潜力，包括提示肿瘤/正常组织边缘以协助清除残余肿瘤组织，以及术中前哨淋巴结评估。

首例活体乳腺组织拉曼光谱应用于一例乳房部分切除术，术中应用临床拉曼系统和光纤拉曼探针，对肿瘤切除后的乳腺组织切缘进行评估，以探讨其术中实时切缘评估的可行性。以传统组织病理学诊断结果为对照，拉曼方法的总体准确率达93%。随后，一种可以同时记录荧光和拉曼信号的“光谱笔”被开发出来，这种手持式光谱仪能够同时实现4T1荷瘤小鼠肿瘤组织的在体检测和术中切缘的实时评估。目前该技术已成功应用于人类保乳手术的术中切缘评估，对于优化患者管理，改善患者预后，避免残留肿瘤细胞导致的恶性复发，减少不必要的手术损伤等具有长远意义，应用前景光明。

前文已经提到，乳房X线摄片中提示的微钙化灶可能是BC的癌前病变，明确钙化灶的性质则需行进一步活检。事实上，只有小部分微钙化灶是恶性的，对于大部分非恶性微钙化灶患者而言，为此进行创伤性活检是得不偿失的。因此，有必要开发能够在体内实时鉴定微钙化灶性质的新技术。目前已有一些研究小组应用光纤拉曼技术来探测微钙化灶的元素成分，根据其诊断算法评估得出此法对BC诊断的敏感性和特异性分别为62.5%和100%，对正常、良性和恶性乳腺样本诊断的总体准确率为82.2%。  

此外，已经有研究应用kerr -门控RS对鸡胸和脂肪组织以及正常和癌变乳腺组织的钙化灶进行深度成像，并证明了空间偏移拉曼光谱和透射拉曼光谱(transmission Raman Spectroscopy，TRS)透过2-10 mm和16 mm厚的鸡胸组织检测钙化物质化学成分的有效性。最近新研制出的一种TRS仪器，能够检测到皮下约40mm深处的软组织钙化，且由于良恶性组织中II型微钙化的碳酸盐水平存在显著差异，透射拉曼技术可依此区分II型微钙化的良恶性。

在体液中的应用

乳腺肿瘤表现出明显的瘤内异质性，相邻肿瘤细胞可能在分子构成和组织来源上完全不同，因此单次的组织活检很难获得完整的肿瘤信息。近年来已有研究者们将目光中转向能对肿瘤进行快速、实时分析的体液活检。

首例RS体液活检进行BC诊断的研究是以血清为样本的。采用常规拉曼光谱法结合PCA和线性鉴别分析（linear discriminant analysis，LDA），将BC患者样本与健康组相对照，其敏感性和特异性分别为97%和78%。  

虽然传统的RS方法已经验证了通过血清检测BC的有效性，但最近的一项研究将其性能与表面增强拉曼光谱法（Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）进行了比较，研究结果显示，与传统RS相比，SERS对血清样本检测表现出更好的灵敏度和特异性，除此之外，SERS分析还能够区分不同疾病阶段的患者。目前，基于血清的拉曼分析已经能够将BC患者与结肠癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌、肝癌、白血病和宫颈癌等其他恶性肿瘤进行区分。

也有研究者探究了拉曼显微光谱技术在血浆样本的BC诊断和分期方面的应用潜力。当比较正常组织和I-IV期BC样本时，研究者观察到生物分子的振动模式相对应的拉曼谱带间的差异，II期和III期样本在生化组成上相似，而IV期患者的光谱则与前者存在较大区别。在对数据进行PCA-多因辨别分析(factorial Discriminant Analysis)后，研究者发现这一方法可区分BC样本的所有分期(II、III和IV期)和对照组，且具有非常高的敏感性和特异性。

近年来的研究还报道了RS以全血或唾液为样本来检测BC的可行性。有报道称通过全血样本检测BC敏感性为90%，特异性为75%；还有研究通过患者纯化唾液蛋白的SERS光谱鉴定出6个突出的峰，对应于唾液蛋白的不同键振动，且这些峰的强度在良恶性乳腺肿瘤患者和健康对照组中存在显著差异。此外，唾液酸水平的升高也被证明与BC相关，健康受试者的唾液酸水平显著低于BC患者。  

此外，以尿液为样本的RS检测也已被进一步研究而用于BC诊断。通过对腺癌大鼠和正常Sprague-Dawley大鼠的尿液进行检测，研究者发现这一技术能够在非常早期的阶段检测出癌症样本，灵敏度为72.5%，特异性为83%，目前该方法在人体BC诊断中的可行性也已被证实。

泪液(眼泪)可能是BC检测样本中最令人意外的一种体液。与其他体液相比，泪液成分相对简单，因此需要高灵敏度的方法来检测其低丰度分析物。基于SERS的人类泪液分析在鉴别BC患者和健康患者方面的实用性最近得到了证实，其临床敏感性和特异性分别为92%和100%。  

当前的挑战和临床实施的未来展望

综上所述，RS技术在BC检测和诊断方面具有广阔的应用前景，但其临床应用仍存在一些局限。首先，从生物样本中通过光谱获取的信息的流程缺乏统一的标准化方案，其中涉及样本的制备流程，基板，光谱仪器设置和计算机预处理方法。使用不同的操作方法分析相同的样本可能会产生显著不同的光谱。由于癌变和非癌变样本间的光谱差异可能非常细微，因此优化和标准化实验方案，并验证其稳定性，对于生物样品的分析至关重要。

其次，在过去的几十年里，人们开发了多种基于光纤的拉曼探针，将拉曼技术的应用从台式设备转变为床边设备。这些仪器可以插入内窥镜管道从而实现对官腔和实体脏器的检测。迄今，针对皮肤癌、口腔癌、胃肠道恶性肿瘤和宫颈癌的大型临床研究均已问世，而RS探测BC的研究目前仅见于小样本量临床报道，亟待在随机大规模临床研究中验证其有效性。

此外，体内检测的应用也面临着挑战。如前所述，拉曼信号本身信号强度弱，其光谱很可能被来自测量设备或组织本身的背景辐射所破坏，大多数已开发的探针具有近红外激发功能，可以限制自身荧光干扰，在分析体外样本时，通常会延长整合时间或使用更高的激光功率来提高信噪比，然而这对于体内应用是不安全的，最令人担心的是激光与组织的相互作用。尽管我们通常认为RS对人体是无创的，但反复照射对组织结构的长期影响尚不清楚。因此在临床实施之前，必须对该技术进行严格的安全测试。

最后，尽管RS技术在协助临床诊断中具有广阔的应用前景，但其对于许多临床医生而言仍是陌生的。为提高工作效率，亟需使用人工智能方法创建全自动光谱诊断框架；此外，临床医生对于检测结果的判读能力也是必不可少的。每位患者都有其特定的病史，在个体化医疗时代，临床医生必须能够依据患者情况对拉曼结果进行个体化的解读。

近来，COVID-19的广泛流行已对癌症诊疗的方方面面产生影响，一些乳房x线摄影筛查项目被迫暂停以及常规诊疗被迫推迟，这使得一些本可以被早期发现的肿瘤继续进展，变得更难治疗。此前，一些依靠光学技术的家用远程健康监测设备已进入人们的视野，此次COVID-19的到来更增强了它们在医学领域的吸引力。目前，这些技术的应用仅局限于获取生理数据的一小部分，如心率和血糖监测。然而，在COVID和后COVID时代，利用便携远程光学技术进行肿瘤诊治极具应用潜力。目前已有一项低成本、手持便携式拉曼光谱仪被证明可直接检测皮肤癌，此外也有概念验证研究证明了利用手机摄像头和计算系统即可将拉曼光谱整合到手机中。这些研究将促进微型、高性价比的拉曼光谱仪的研发，并最终使家庭医疗服务产生新的变革。在乳腺疾病的诊疗中，尽管RS还不能替代传统诊断方法，但它可以作为一种补充筛查工具，尽早识别高危人群，以便行进一步的诊治。

编译：谢婷婷，翁梅琳

审核：张军，缪长虹

参考文献：   Katie Hanna, Emma Krzoska, Abeer M. Shaaban, David Muirhead, Rasha Abu-Eid and Valerie Speirs. Raman spectroscopy: current applications in breast cancer diagnosis, challenges and future prospects. Br J Cancer. 2022 May;126(8):1125-1139. https://doi.org/10.1038/S41416-021-01659-5  

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