偶联新模式！PROTAC+ADC＝DAC(定向降解抗体偶联物)

前言

降解-抗体偶联物(DAC)是一种新型实体，它通过某种类型的化学接头将蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)有效载荷与单克隆抗体相结合(DAC=PROTAC+ADC)。本文从科学和专利文献中收集了几个DAC实例，并记录了与DAC构建相关的具体挑战。总的来说，这些实例表明：可以使用各种PROTAC有效负载成功制备具有生物活性的DAC。

作者 | 葡萄糖

图注：DAC结构示意图

DAC的一些要点

(1)DAC 由 mAb、链接器和 PROTAC 有效负载组成。

(2) 将靶抗原的表达与降解有效载荷细胞生物学相匹配。

(3)PROTAC有效载荷必须在溶酶体中稳定，并且能安全逸出。

(4) 可能需要 DAR >4，这可能会影响偶联和 DAC 药代动力学。

PROTAC简介

在展开讲DAC之前，我们需要熟悉一下什么是PROTAC，这个火出圈的新技术你是否已经了解了呢？

PROTAC,即“蛋白水解靶向嵌合体”，该技术正在迅速改变生物学和药物化学领域。这种异双功能分子能够特异性降解细胞内的目标蛋白质，因此相对于相同实体的简单小分子抑制剂，它们具有改善和/或延长生物活性的潜力。

PROTAC的结构如下图所示：通常由识别目标蛋白质的结合元件、与 E3 连接酶结合的部分、以及连接这两个组分的间隔基组成（具体作用原理请查询“泛素化降解”）。

但是PROTAC存在较差的DMPK 特性，例如低口服生物利用度和/或快速体内清除。这成为阻碍PROTAC发展的一大因素，此外还有分子量较大（700-1100Da）、可用的E3泛素连接酶较少等问题。

一种靶向BRD4的DAC

2020 年初，Genentech公司描述了一种高效的、基于 VHL 的嵌合含溴结构域蛋白 4 (BRD4) 降解物的DAC偶联物(GNE-987)，ADC和PROTAC之间通过含二硫键的可切割接头连接，它的靶向蛋白为CLL1（C型凝集素样分子-1），DAR=6。

该DAC的作用机制可能为：

DAC的抗体部分与肿瘤细胞表面的CLL1受体结合，随后偶联物被内化并转运至溶酶体（步骤1）。在该蛋白水解环境中，抗体被分解代谢成氨基酸成分，留下一个半胱氨酸残基，通过二硫键部分附加到接头的其余部分（步骤2）。然后二硫化物还原（步骤 3）提供相应的硫醇，该硫醇经历自焚以释放降解剂1从而发挥作用（步骤 4）。

在HL-60（左）和EOL-1（右）异种移植模型中，单次静脉内给药后，对照实验表明：

(1) 未偶联的 CLL1 mAb 在这些模型中没有有意义的活性。(2) 带有 GNE-987 羟基脯氨酸差向异构体有效负载的 CLL1 降解剂偶联物同样无活性。(3)靶向CLL1的正确结构DAC具有剂量依赖性的活性，抑瘤效果很显著。（4）未缀合的 GNE-987 无活性。

图注：绿色痕迹：降解物-mAb-缀合物；紫色迹线：化合物差向异构体DAC 蓝色迹线：mAb  黑色迹线（虚线）：未缀合的化合物

另一种靶向BRD4的DAC

在上述DAC出现后不久，伦敦大学公开了BRD4 降解-抗体偶联物的第二个例子。他们，采用二溴马来酰亚胺反应还原mAb 的链间二硫键生成半胱氨酸残基，用于通过硫醇重桥方法连接四个拷贝的相关接头-药物。

他们使用酯部分（黄色椭圆形）将基于 VHL 的 PROTAC 有效负载连接到一个不可切割接头上。，并使用无铜、应变促进的叠氮化物-炔烃完成最终接头结构环加成（SPAAC）反应。在将缀合物递送至溶酶体后，可通过酯裂解发生细胞内有效负载释放。该抗体靶向HER2。

在体外实验中，该DAC在 HER2 阳性细胞的两个例子中提供剂量依赖性BRD4 降解，但在两个 HER2 阴性对照细胞系中没有。

此外，荧光标记观察到 DAC在 HER2 阳性细胞中的内化，然后运输到溶酶体区室。在HER2 阴性细胞中未检测到相关的内化和运输，这一结果在使用这些细胞系的实验中表现出的缺乏降解活性一致。

未来展望

1、 尽管降解-抗体偶联物DAC领域仍处于起步阶段，但已经创建了多种此类实体，目前得到验证的DAC显示出有意义的体外和/或体内生物活性。

2、 在这些偶联物的生成中，使用 了与几种不同的 E3 连接酶结合的 PROTAC，这些有效载荷降解了几种分化良好的目标蛋白（表 1）。此外，许多不同的新型接头和 mAb连接方法用于构建所描述的 DAC（表1）。

3、 与大多数已知的细胞毒性 ADC（DAR = 2 到 4）相比，这些新实体中的许多采用了更高的有效载荷负载（DAR 值为 6），但对于典型的 DAC应用是否通常需要这种增加仍有待确定。

4、 在确定哪些PROTAC 适合 DAC 偶联以及该偶联如何最好地保持（并理想地增强）所选嵌合降解剂的生物活性方面仍然存在挑战。

参考资料：

[1] Dragovich PS. Degrader-antibody conjugates. Chem Soc Rev. 2022 May 23;51(10):3886-

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[2] Antibody Conjugation of a Chimeric BET Degrader Enables in vivo Activity. ChemMedChem. 2020 Jan 7;15(1):17-25.

[3] M. Maneiro , N. Forte , M. M. Shchepinova , C. S. Kounde , V. Chudasama , J. R. Baker and E. W. Tate , ACS Chem. Biol., 2020, 15 , 1306.