黄芪提取物在果蝇尿石症模型中防止草酸钙结晶并延长寿命

Chen SJ, Dalanbaatar S, Chen HY, Wang SJ, Lin WY, Liu PL, Tsai MY, Chen DC, Chen YH, Chen WC. Astragalus membranaceus Extract Prevents Calcium Oxalate Crystallization and Extends Lifespan in a Drosophila Urolithiasis Model. Life (Basel). 2022 Aug 16;12(8):1250. doi: 10.3390/life12081250. PMID: 36013429; PMCID: PMC9409928.

黄芪提取物在果蝇尿石症模型中防止草酸钙结晶并延长寿命

大约每 20 人中就有 1 人在其生命的某个阶段患上肾结石。虽然手术切除结石很常见，但复发率仍然很高，因此预防肾结石的发生很重要。我们选择了中药黄芪（AM），在我们之前筛选的中药材的基础上，使用果蝇模型研究预防尿石症。野生型黑腹果蝇在这项研究中使用了 Canton-S 成年果蝇。乙二醇（EG，0.5%）被添加到食品中作为致石剂。然后将阳性对照剂 (2% 柠檬酸钾 (K-citrate)) 与 AM (2、8 和 16 mg/mL) 进行比较。21天后，在二氧化碳麻醉下处死果蝇，解剖、取出马氏管，进行偏光显微镜检查，观察草酸钙（CaOx）结晶。然后，比较了 K-柠檬酸盐和 AM 之间晶体在马尔皮基小管中的离体溶解。还进行了 EG、K-柠檬酸盐和 AM 组的生存分析。2% K-柠檬酸盐和 AM (16 mg/mL) 均显着抑制 EG 诱导的 CaOx 晶体形成。施用 EG 显着缩短了平均寿命，结果在 AM（8 和 16 mg/mL）组中显着逆转。然而，AM 提取物不直接溶解 CaOx 晶体果蝇Malpighian 小管离体。总之，AM 提取物降低了马氏管中 CaOx 结晶的比例，并显着改善了 EG 引起的寿命缩短。AM 阻止了果蝇模型中 CaOx 晶体的形成。       

草酸钙 (CaOx) 构成了人体肾脏中形成的大部分结石。对于急诊科就诊的肾绞痛患者，非甾体类抗炎药是首选的镇痛选择。对于患有尿石症的患者，药物治疗对于减轻疼痛、增强自发性结石通过、防止结石再生和复发至关重要 [ 9 ]。不幸的是，自 1980 年代引入柠檬酸钾 (K-citrate) 以来，尚未开发出用于预防结石的新药，这可能是因为证明疗效所需的长时间观察阻碍了研究人员进行临床研究 [  10  ]。此外，体外冲击波碎石术（ESWL）和微创方法如经皮肾镜取石术和逆行肾内手术被认为是治疗肾结石的主要方法。最近，激光设备已在这些程序中用于碎石术 [  11 ]。尽管结石病的手术治疗有了很大进步，但预防策略并没有改善。最近，Wu 等人。评估了对无症状肾结石进行主动监测或预防性干预的患者的结果，发现接受预防性干预的患者发生结石相关事件和未来干预的风险较低 [  12  ]。因此，迫切需要确定预防结石病药物的潜在抗结石作用。      

黄芪(Fisch.) Bunge (AM; 中文名称: Huangqi/Huang-Chi) 是一种传统中药 (TCM)，在台湾、中国和东亚使用了数千年，用于治疗肾脏疾病 [  13  ]。AM是多年生草本植物；黄芪属于豆科。中医认为AM根具有补气、利尿、消水肿、养血的作用。它还可以补充体液和缓解疼痛 [  13  ]。我们早期使用果蝇动物模型筛选了 80 种中药，表明 AM 对尿石症具有潜在的抗结石作用 [  14 ]。然而，中医的筛选研究是有限的；此外，还有一种新的研究模型可以离体溶解 CaOx 晶体 [  15  ]。在这项研究中，我们旨在通过增加研究中的动物数量以及添加这种新模型来研究不同浓度的 AM 提取物的抗结石作用。       

在这项研究中，我们检查了不同浓度的 AM 提取物的抗结石作用，并将其与 K-柠檬酸盐的抗结石作用进行了比较。仅在 16 mg/mL 的高剂量下观察到 AM 的抑制作用，与 K-柠檬酸盐的抑制作用相当。对照组的平均寿命和最长寿命分别为 42.3 ± 4.1 和 62 天。施用 EG 显着降低平均寿命，而施用 AM 导致 CaOx 晶体形成减少并延长寿命。关于离体溶解，K-柠檬酸盐的溶解速率最高，而AM提取物对CaOx晶体的溶解没有直接影响。 尽管在诊断和治疗方面取得了进展，但尿石症仍然是一种高发病率和高复发率的疾病。尿路结石的复发率约为每年 10%。一半的患者在 10 年内复发。据报道，80% 的患者不止一次复发。因此，预防尿石症的发展很重要 [  19  ]。 兰德里等人。使用果蝇模型研究了与果蝇（Slc26a5/6 和 dPrestin）相关的 Slc26a6（一种参与草酸转运的肾结石相关基因）的同源物，发现硫代硫酸盐减少了马氏管中 CaOx 结石的形成 [  20  ]。该结果表明硫代硫酸盐或草酸盐模拟物可作为 CaOx 结晶的竞争性治疗抑制剂。范等人。使用果蝇对 Malpighian 小管主细胞中肾结石相关基因进行 RNAi 敲低，并研究了抗结石剂对 CaOx 晶体形成的影响 [  18  ]。因此，果蝇石病的遗传研究可能具有未来潜力 [  21  ,  22  , 23  ]。CaOx 形成的发病机制是一个多步骤的过程，主要包括成核、晶体生长、晶体聚集和晶体滞留。已知许多无机和有机物质可调节结石形成。对肾结石形成机制的全面描述尚不存在，促进剂/抑制剂在 CaOx 结晶中的作用仍不清楚 [  24  ]。尽管如此，我们推测这些与钙和草酸盐运输或代谢相关的肾结石相关基因可能参与AM治疗肾结石的分子机制。 陈等人。在果蝇食物中添加成石剂后数周内，首次观察到马氏管中 CaOx 晶体的形成，并在偏振光显微镜下直接检查它们 [  8  ]。从那时起，果蝇模型已被用于筛选具有 80 种候选草药的潜在抗石药材 [  14  ]。吴等人。报道使用某些经过测试的中药草药，包括丹参、芍药、红花和黄芩导致晶体形成率约为 0.0%。然而，造成这种情况的实际机制仍然未知，相关研究缺乏足够数量的动物来确定统计学意义 [  25  ,  26  ]。因此，丹参和红花使用大鼠动物模型进行了进一步研究，并进行了额外的临床分析 [  14  ,  27  ,  28  ,  29  ,  30  ]。果蝇因此，模型提供了快速繁殖的大量种群，有助于筛选潜在的抗石药。陈等人。开发了一种新的观察方法，可以使用微型计算机断层扫描观察整个果蝇，这使得该模型更加有益[  31  ]。 AM 是一种著名的“补气”或中药中使用的适应原草药。它的中文名称为“黄旗/黄池”，意为“黄色领袖”。它是一种长长的黄色主根，当之无愧地受欢迎，因为它以多种方式帮助身体。AM作为中药材中最重要的药物之一，被列入传统草药书籍《本草备药》的第一顺序。几个世纪以来，它一直被用于治疗一般虚弱和慢性疾病，并增加整体活力。它提供多种健康益处，例如增强免疫系统 [  32 ]，促进自然排尿，支持正常体液，有益于呼吸系统。AM 常用于补肝补血。它具有抗病毒、抗氧化、抗菌和解毒的特性。根据对中国研究的荟萃分析，发现 AM 对 1804 名糖尿病肾病患者具有肾脏保护作用 [  33  ,  34  ]。在中医 [  35  ,  36  ] 中，黄芪可单独使用或与其他草药组合使用，以各种剂量和形式 [  37  ]。例如，AM与川芎（川芎）结合Hort.，四甲基吡嗪的主要成分）被广泛用于中医治疗腹痛和心血管疾病 [  38  ]。 最近，Chung 等人。在《自然》杂志上报道，羟基柠檬酸 (HCA) 是藤黄果提取物的一种成分，可以在体外溶解 CaOx 晶体 [  39  ]。这种在东南亚发现的热带水果富含 HCA，在印度传统上用于烹饪目的，可能是一种潜在的抗结石药草。范等人。和陈等人。进一步研究 HCA 以分析其对果蝇模型中 CaOx 形成的预防作用[  15  ,  18  ,  40 ]。然而，与柠檬酸钾相比，HCA 对 CaOx 晶体溶解的离体效应与这两组不同。范等人。据报道，在体外研究中，1% HCA 在 2 小时内完全溶解 CaOx 晶体（由草酸钠诱导）[  15  ,  18  ]。陈等人。据报道，HCA 对果蝇体内 CaOx（由 EG 诱导）溶解的影响仅为 39% [  40  ]。我们的研究结果表明，K-柠檬酸盐是预防果蝇CaOx 晶体形成的最有效药剂。模型。相比之下，大多数研究都集中在 AM 的抗氧化和抗炎作用上。AM 的主要成分包括多糖、黄芪甲苷、皂甙和黄酮类化合物，具有很强的清除氧化自由基和抗炎作用[  41  ]。据临床研究报道，中草药（含 AM）可预防 ESWL 引起的肾损伤 [  42  ]。然而，据我们所知，没有报道称 AM 的主要成分具有与 HCA 相同的溶解 CaOx 晶体的能力。      

尽管如此，黄芪多糖 (APS) 已被证明可抑制 CaOx 二水合物纳米晶体对受损肾近端肾小管上皮细胞的粘附并促进内吞作用 [  43  ]。APS 可以抑制 CaOx 一水合物的生长，诱导 CaOx 二水合物的形成，并增加晶体的绝对 zeta 电位以抑制晶体聚集 [  44  ]。此外，经 APS 修复后，细胞表面的贴壁晶体数量减少，但内吞晶体数量增加 [  45 ]。因此，这些结果表明 APS 可能作为预防肾结石的潜在药物。另一方面，AM 是一种主要的药草，在中医实践中已广泛用于许多草药配方中，以治疗各种疾病和身体疾病，或作为延长寿命的提取物销售给人类使用。AM的主要成分是多糖、类黄酮和皂苷。药理研究表明，AM的部分提取成分可增加端粒酶活性，并具有多种抗氧化和抗炎作用。因此，针对这些病理变化可以逆转衰老并治疗与年龄相关的疾病 [  46  ]。       

使用果蝇模型的优势之一是它们的寿命 [  47  ,  48  ]。可以通过寿命研究快速测试对人类健康有潜在危害的化学试剂，因为有毒试剂可能会缩短生命周期。果蝇的生命周期很短，大约 8-9 周，很容易在短时间内大量繁殖 [  48  ,  49 ]。因此，果蝇是研究潜在有毒物质的理想模型。据报道，三聚氰胺（有时非法添加到食品中以增加其表观蛋白质含量）和莱克多巴胺（一种用于促进瘦身和提高食品转化效率的动物饲料添加剂）对台湾的人类具有潜在的危害影响 [  50  ]。陈等人。使用果蝇模型来研究它们对毒性的影响。三聚氰胺以剂量依赖性方式显着降低果蝇的寿命 [  19  ]，而莱克多巴胺（添加到食物中 10 ppb）显着降低果蝇的寿命 [  50 ] ]。寿命研究也可用于按照上述方法测试其他药剂 [  48  ,  51  ]。 使用果蝇模型的缺点包括难以研究管状液形成的机制以及缺乏血清或尿液生物化学 [  52  ]。此外，这种无脊椎动物缺乏许多实体器官，包括肾脏。然而，果蝇的马尔皮基小管具有与人类肾脏相似的遗传组成、生理学和解剖结构 [  22  ]。米勒等人。提出饮食操作、环境改变和遗传变异会影响结石形成，并且可以在几天内在果蝇中快速观察和量化 [  22  ]。

结论

总之，TCM AM 提取物在体内有效地阻止了果蝇马氏管中 CaOx 晶体的形成，但 AM 提取物并没有直接溶解或排出体外马氏管中的 CaOx 晶体。由于尿石症仍然是一种高复发率的疾病，这些数据表明，AM 可用作对有形成晶体倾向的身体的预防性干预。需要进一步的临床研究来证实其对预防结石病的作用。

K-citrate，但不是 AM，提取物直接溶解离体果蝇Malpighian 小管中的 CaOx 晶体。表示在不同时间点用 2% K-柠檬酸盐和 AM（2、8 和 16 mg/mL）溶液离体处理的完整马尔皮基小管中 CaOx 晶体溶解的图像。