精准前沿丨整合中枢神经系统宏基因组学和宿主反应基因表达数据诊断结核性脑膜炎及其类似物

本期《精准前沿》栏目分享美国加州大学Wilson团队发表在Nature Communications（IF=17.694）上的一篇研究[1]。该研究将脑脊液的mNGS数据与基于宿主基因表达的机器学习分类器相结合，提高了结核性脑膜炎及其类似物诊断的准确性。

研究背景

结核分枝杆菌（TB, Mycobacterium tuberculosis）影响着全球1000万人，仅在2019年就有约120万人死亡。COVID-19大流行需要大量的公共卫生资源，全球结核病负担在未来几年可能只会增加，而脑膜炎是结核病最严重的并发症。

宏基因组下一代测序（mNGS）是一种有效的神经感染性疾病诊断方法，通过扩增脑脊液（CSF, cerebrospinal fluid）样本的所有遗传物质（宿主和病原体），可以检测多种感染。已经发表的病理报告，证明CSF mNGS可以诊断TBM（以及其他临床上可模拟TBM的感染）。这些研究表明，mNGS对检测TBM患者CSF中的少量结核核酸具有特异性，但敏感性一般。因此，该团队研究了CSF mNGS的临床实用性：在大范围的乌干达成年HIV感染者和疑似TBM的人群中，利用人类基因表达开发一个补充性的机器学习分类器（MLC, machine learning classifier），将患者归类为是否患有TBM，从而提高测试性能。虽然从血液和呼吸道分泌液中提取的基于宿主的MLCs越来越多地用于区分传染性和非传染性疾病（包括结核病），但典型脑脊液样本中RNA的皮克量，阻碍了神经炎性疾病患者类似宿主分类器的开发。

研究设计

研究队列

2018年3月至2020年3月，乌干达坎帕拉Kiruddu地区转诊医院的所有HIV阳性患者出现与脑膜炎有关的症状和体征（表现为头痛、发热、颈部僵硬、神经系统缺损或精神状态改变），被筛选为研究对象。最终的临床诊断和病例分类是根据在乌干达进行的调查和公认的TBM UCD（uniform case definition）做出的。病例分为确定TBM（微生物学证实）、很可能TBM（得分>10 分）、可能TBM（得分6-9分）、不确定（得分<6分且没有微生物学证实的交替感染）和非TBM（微生物学证实的交替感染）。非TBM类别中的替代疾病包括球菌脑膜炎、细菌性脑膜炎和病毒性脑膜炎。

图1. 研究工作流程

研究结果

1.队列人口统计

368名患者同意参加研究，收集了这些患者的CSF用于mNGS。表1列出了最终诊断的基线人口统计数据。180人（48.9%）被诊断为隐球菌性脑膜炎（CM）；2.9%（11/368）的患者被诊断为细菌性脑膜炎（非TBM组）；10/366（2.7%）被诊断为病毒性脑膜炎（非TBM组）。

63名患者（17.1%）被归类为很可能或确定的TBM，其中61.9%（39/63）为确定的TBM，38%（24/63）被归类为可能的TBM。97.4%（38/39）的病例通过Xpert MTB/RIF Ultra诊断为明确的TBM。66.6%（12/18）的病例为结核菌培养阳性（11/18的病例通过Xpert MTB/RIF Ultra和培养均为阳性）。16.3%（60/368）的病例被归类为可能是TBM。11.9%（44/368）被归类为不确定。9个病例的TBMUCD评分数据缺失，其中6个病例有隐球菌抗原血症，3个病例的最终医院诊断被列为未知。这些患者被归类为不确定的。

表1. 最终诊断的基线人口统计数据

2. 训练和测试队列

240名患者被纳入训练队列，约占队列的2/3。在这个队列中，有70个样本有明确的TBM或其他神经系统疾病（OND），并被用于MLC的训练。AUC结果显示，增加样本对分类器性能的改善是递减的（图2）。130名患者被纳入测试队列中。除两个病例外，其他病例均为训练组或测试组所独有。在训练队列中，有明确TBM的病例比例为12.6%（n = 30），而在测试队列中，该比例为6.3%（n = 8）。

图2. 训练集和测试集中样本大小与AUC/灵敏度的关系

3. 训练队列机器学习分类器

经微生物学证实的70例感染样本（TBM：n = 32和OND：n = 38），用作MLC的训练集。对样本进行了两批测序（TBM：第1批（n = 12），第2批（n = 20）；OND：第1批（n = 19），第2批（n = 19））以减轻批次效应。为了确定最佳参数，对分类器进行了1,6617次不同的迭代。分类器的第一轮迭代（n = 16,050）运行了100次。第二轮迭代（n = 567）是为了对分类器进行微调，共运行1000次。TBM的诊断临界值≥50%（图3a）。

选择与协变量矩阵无关、具有L1正则化（正则化参数C = 0.1）、灵敏度最高的两个支持向量机分类器:MLC1和MLC2。MLC1在训练队列AUC=0.94，敏感性=0.84，特异性=0.95。在10个重新测序的样本中，MLC1对4/5个TBM和5/5个OND进行了正确分类。共有15个基因用于分类TBM，111个基因用于分类OND（bootstrap = 1000）（图3b）。对于TBM组，主要使用四个基因（>500/1000 bootstrap）进行分类。FTL（528/1000），NFKBIA（674/1000），SOD2（999/1000），和GBP5（1000/1000）。对于OND组，主要使用三个基因进行分类。EEF1A1（532/1000），TMSB4X（544/1000），和ACTB（717/1000）。根据这些top基因创建了两个额外的分类器来对TBM与OND进行分类：四基因（FTL、NFKBIA、SOD2和GBP5）和七基因（FTL、NFKBIA、SOD2、GBP5、EEF1A1、TMSB4X和ACTB）分类器。

图3. 从脑脊液RNA-seq数据开发基于宿主的机器学习分类器

4. 整个队列的mNGS结果

mNGS在74.4% （29/39）的确诊TBM病例中检测到TB。在归类为很可能的TBM（即CSF TB PCR 和TB培养阴性）的病例中，12.5% （3/24） 的mNGS检测到TB。因此，在定义为确定或可能的TBM病例中，通过mNGS检测TB的总体敏感性为50.8% （32/63）。当排除mNGS检测到其他感染的可能TBM组病例时，敏感性增加到54.2% （32/59）。3.8% （4/104） 的病例被归类为可能的TBM或不确定的病例中检出TB。一名未进行结核培养和Xpert Ultra的CM患者（非TBM组）被确定为合并感染。在交替感染方面，1例确诊的TBM病例在mNGS检测到弓形虫合并感染。如前所述，mNGS在可能的TBM组中检测到4例非结核感染病例。

5. 非TB感染

在整个队列中，通过mNGS检测到19种神经侵袭性病毒（除HIV-1外）（表2）。如上所述，在一个被归类为很可能的TBM的病例中，检测到VZV（varicella zoster virus）与T. gondii合并感染。在可能和不确定TBM组中检测到10种病毒。Wesselsbron病毒是撒哈拉以南非洲特有的一种神经侵入性黄病毒，与结核病一起被发现。mNGS捕获5739.5 rPM，在Wesselsbron病毒基因组覆盖率为96.1%（图4d）。

表2.  在整个队列中检测到所有非TBM病原体

同时发现9例细菌性脑膜炎，包括4例肺炎链球菌（图4c）。这4个病例按出院诊断归类为急性细菌性脑膜炎（非TBM组）（表2）。在一名被归类为可能是TBM的患者中，通过CSF mNGS检测到1例巴西诺卡氏菌。检测到4例脑膜炎奈瑟菌。其中两个病例的临床诊断为细菌性脑膜炎（非TBM组）。一个病例属于可能/不确定组，另一个病例是一个CM患者的合并感染（非TBM组）。在这个病例中，mNGS还检测到了新成形杆菌（9.21 rPM）。

共发现弓形虫15例。1例确诊为结核性脑膜炎患者合并感染，3例确诊为疑似结核性脑膜炎患者，1例mNGS诊断为C. neoforman （CSF CrAg阴性），另1例合并感染VZV。在可能的TBM患者中发现了6例弓形虫，在CM患者中发现了4例合并感染（表 2）。

图4. mNGS病原体检测

6. 联合微生物和宿主MLC检测诊断乌干达HIV阳性队列中的TBM及其类似物

宿主MLC单独将盲法测试集中的病例分类为TBM与OND，敏感性为77.8% （CI: 40–97.2%） （7/9） ，特异性为76% （CI: 64.8–85.1%） （57/75） ） ，AUC为0.74 （ p  = 0.02）。联合mNGS和宿主MLC显示88.9% （CI:51.8–99.7%） （8/9） 敏感性，86.7% （CI:76.8–93.4%） （65/75） 特异性，AUC为0.87 （ p = 0.0003）。当排除在可能组中检测到的非结核病病原体病例时，明确和可能的TBM与UCD 的一致性为50% （11/22） 和 61% （11/18）。联合检测在可能的TBM组中检测到3例TB病例和最初归类为可能TBM的另外8例TBM病例。独立宿主MLC分类器联合检测的特异性提高是由于8个病例被MLC分类为TBM，但发现在mNGS上检测到其他病原体，这推翻了MLC分类。其中脑膜炎奈瑟菌3例，新生c菌3例，VZV 1例，EBV 1例。1例确诊TBM患者在TBM治疗开始后的第1天和第3天进行了腰椎穿刺 （LPs）。第1天CSF被用作MLC训练队列的一部分，mNGS检测到TB。第3天CSF用于测试队列。mNGS在第3天CSF中未能检测到TB；但是，MLC仍然将该样本归类为TBM。在分析测试队列数据时，认为这是mNGS检测结核病失败。

7. 在低资源环境下使用浅深度测序对mNGS和宿主基因表达MLC进行计算机评估

测试集的浅深度测序对MLC的敏感性或特异性没有影响：MLC1将7/9明确的TBM病例（与深度测序MLC结果100%一致）正确识别为TBM，在所有子采样深度将59/75 OND病例正确识别为OND。一旦确定了mNGS测定的最佳阈值，就计算了MLC1的最终AUC、敏感性和特异性。

8. mNGS二次采样

原始样品的mNGS结果被用作不同次采样深度的比较基线。在原始测序深度的整个队列中检测到TB的DNA-seq文库（n = 25），在2,000,000读数时检测到TB的灵敏度为56%（14/25），在500,000读数时的灵敏度为32%（8/25）。在原始测序深度的整个队列中检测到TB的RNA-seq文库（n = 9），在2,000,000读数的子采样深度中检测到TB的灵敏度为100%（9/9），在100,000读数的灵敏度为88.9%（8/9）。

对于非结核病原体，分析了由病毒、细菌和寄生虫感染组成的15个DNA和6个RNA样本，包括一个合并感染的样本。对于DNA-seq，在500,000读数的子样本深度下，mNGS检测到100%在原始测序深度下检测到的病原体。在最低的子样本深度100,000读数时，检测到13/15（86.67%）的病原体。当对RNA-seq文库进行2,000,000或100,000读数深度的子采样时，在原始测序深度检测到的病原体中，有6/6（100%）被检测到。

基于这些结果，作者认为RNA-seq和DNA-seq的最佳测序深度为100,000和500,000对end reads。虽然mNGS在低测序深度下对TB的检测不敏感，但MLC分类器在100,000对end reads下对TBM的分类仍保持类似的敏感性。因此，在RNA-seq为100,000读数、DNA-seq为500,000读数的情况下，对最终测试队列（n = 84）中所有经微生物证实的样本进行了重测，以评估低深度测序模型的AUC、敏感性和特异性。MLC的AUC为0.76（P=0.01），灵敏度为77.8（CI：40-97.2%），特异性为78.7（CI：67.8-87.3%）。MLC和mNGS联合检测的AUC为0.88（P = 0.0002），灵敏度为88.9%（CI:51.8-99.7%），特异性为88%（CI:78.4-94.4%）。

讨论

尽管分类器中的关键基因与肺结核的宿主转录组研究有明显的重叠，包括非HIV阳性患者群体，但是构成MLC的基因如何转化为免疫功能正常的个体仍有待确定。此外，不同遗传背景的患者的宿主反应可能会因感染结核菌株的毒力而不同。几乎所有的LPs都是在开始治疗前进行的，没有院前抗生素治疗的数据，这可能会影响CSF病原体负荷和宿主基因表达谱。由于缺乏广泛可用的高级神经影像学和其他检测方式，在一定程度上限制了临床判断。这体现在许多患者的CSF中检测到高水平的HIV，其中一些人可能患有HIV相关的痴呆症。然而，无法有把握地将他们归为此类。此外，虽然有一个庞大的患者队列，但训练和测试队列中明确的TBM病例数量较少，这限制了联合检测的敏感性、特异性和AUC的点估计的精确度。

结语

通过利用mNGS的特异性和从CSF宿主转录组中创建的MLC的敏感性，这种联合检测在检测TBM及其许多类似物方面具有很高的敏感性（88.9%）和特异性（86.7%）。此外，在测序深度上实现了可比的联合检测性能，更有利于在低资源环境下进行诊断性的mNGS。 END 

参考文献：  

[1] Ramachandran PS, Ramesh A, Creswell FV, et al.Integrating central nervous system metagenomics and host response for diagnosis of tuberculosis meningitis and its mimics. Nat Commun. 2022;13（1）:1675.  

撰写丨安娜  

编辑、排版丨SX  

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