细胞培养基的开发难点及应对策略

随着生命科学的不断发展,动物细胞培养技术已经越来越成熟,并且使其在实际应用方面也得到了充分利用。在科学水平进步的同时,为了使生物细胞培养技术更加适应社会的发展,让其有效的利用到医药产业与生命科学的研究当中,培养基的选择和优化已经成为了目前细胞工程的重要发展目标。

在动物细胞大规模培养过程中，培养基的选择是细胞体外生长、增殖、分化的关键因素。

细胞培养基是为了模拟细胞的体内生长环境，维持细胞体外存活和增殖的营养物质而设计开发的，随着细胞培养基性能的不断提高，以及细胞培养设备的创新，使许多科学家能够方便、系统地开展细胞培养工作。而培养基的开发和优化不仅需要满足细胞生长和高表达所需的营养,还要考虑细胞活力、代谢、产品质量、可生产性、法规监管、供应链和IP等多方面要求。  

动物细胞培养

动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方法有贴壁、悬浮以及固定化培养等方法。

培养的环境要求

1）无菌无毒：无菌无毒的操作环境是保证动物细胞体外培养成功的前提。体外培养细胞面临着被微生物感染或受自身代物质影响的难题，因此，在进行体外细胞培养时，要及时清除细胞产生的代废物，确保为体外培养的细胞提供一个无菌无毒的生存环境。

2）气体：气体主要是O2   和CO2。O2可以给细胞提供能量，而CO2不仅是细胞増殖所需的物质，也是其自身的代谢产物，此外，CO2还有调节培养基pH的作用。

3）温度：适宜的温度能够维持细胞持续旺盛生长，若温度超出适宜温度围，不仅会影响到细胞的正常代，损伤细胞，甚至会使其致死。

4）缓冲环境：缓冲环境的作用是为细胞提供一个酸碱度在培养细胞生理围的培养液，提供水分和无机盐，维持细胞的正常代谢。

5）培养基：培养基分为天然培养基和合成培养基两种，它是细胞生长繁殖的直接环境，为细胞提供所需的营养。天然培养基是从动物体液或组织中分离提取获得的。血浆、血清以及淋巴液等物质都可作为天然培养基。动物细胞培养主要用的是合成培养基。合成培养基含细胞生长所需的无机盐、糖类、维生素、氨基酸等基本物质，有特殊要求的还会添加适量血清。

培养方式

1）贴壁培养：对于那些具有贴壁依赖性的细胞一般使用贴壁培养的方式。一般这样的细胞需贴附于不发生化学作用的物质的表面生长，最终在表面生长至单层，当整个平面被铺满时，细胞会出现接触抑制的现象。

2）悬浮培养：悬浮适应细胞、肿瘤细胞等非贴壁依赖性细胞不需要生长的支撑面，细胞可悬浮于液体培养基，并大量增殖。因此，悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式。

3）固定化培养：无论是贴壁依赖性细胞还是非贴壁依赖性细胞都可用固定化培养方式进行体外细胞培养。固定化培养属于包埋培养方式，目前已有的固定化培养方式包括微载体培养、中空纤维培养以及微囊发培养三种方式。固定化培养不仅剪切力较低，传递效果较好，而且还易于收集并分离纯化细胞产物。用此种方式培养的细胞也具有较强的抗污能力，细胞生长较为集中，生长密度也高。

无血清培养

自从1976年发现GH3细胞株能在添加了少量生长因子的无血清培养基中维持生长后，无血清培养技术逐渐得到了完善发展。21世纪后，随着生命科学研究的不断深入和生物医药产业快速发展，细胞有血清培养表现出严重的不足，因而动物细胞的无血清培养技术日益引起行业的高度关注。

发展历程

自从第一次使用无血清细胞培养获得成功之后，至今无血清培养基的研制与应用大约经历了三个不同的阶段。第一代无血清培养基是一类用各种可替代血清功能的生物材料配制成的细胞培养基。由于这类培养基含有大量动物来源蛋白和不明的添加成分，许多厂商基于生物药物安全和药品开发报批考虑，致力于开发第二代无血清培养基。这类培养基中完全无动物来源组分、对于从事生物药物开发生产的厂家来说，既加快了药品申报的进程又保证了药物的使用安全和产品质量，同时也在一定程度上降低了成本，提高了效率，在生物医药的研发和生产领域深受欢迎。   第三代无血清培养基特点 近几年来，由于生命科学研究和基因工程药物开发的需要，第三代化学组分限定培养基也已被开发出来，并在市场上获得了很好的效果。这类完全不含血清、无蛋白或蛋白含量极低的培养基亦被称之为双无培养基。与过去的培养基相比，具有无可比拟的优越性，成分明确，增加了实验结果的科学性和可靠性，性能一致，使得细胞培养和试验结果有更好的重复性。无蛋白成分，有利于纯化和下游加工，最大程度上减少了细胞生长和表达的不利因素，使得生长更好和产量更高，可以从根本上消除了血清源性污染等。  

培养基开发策略

培养基的主要作用是促进和维持细胞的生长发育。目前按成分和来源可分为平衡盐溶液、天然细胞培养基、合成细胞培养基、无血清细胞培养基、限定化学成分细胞培养基等几大种类，其中合成细胞培养基和无血清细胞培养基是目前市场上的主流产品；细胞培养基也可以按功能不同分为基础培养基和补料培养基。细胞培养基是重组蛋白/抗体药物、疫苗、基因治疗/细胞治疗药物等生物制品生产中不可缺少的重要原料。 现阶段，培养基的开发策略可以分为两类：自上而下和自下而上。自下而上的策略指的是，对培养基中各种单一营养成分的不同浓度造成其对细胞生长和对产物产生的不同影响进行考察。该策略需要耗费大量的时间进行大量的试验，进而着重考察的是每一个组分对细胞的影响。而自上而下的策略指的是将培养基分成许多个不同的亚型，针对各个亚型先进行筛选和组合，而后再进行组内的优化。但不论是通过自上而下策略、还是自下而上策略开发出的培养基，通常都是需要和补料培养基一起进行使用的。  
以培养动物细胞为主的生物制药规模的不断扩大与生产成本高、产量低的矛盾不断加剧，培养基的优化设计成为了动物细胞表达产品产业化进程中的重要环节，也作为提高产量、降低生产成本的主要手段之一受到相关企业与研究机构越来越多的关注。典型的细胞培养方式有：批次培养、流加培养与灌注培养。批次培养是一种封闭的培养体系，因此营养物的消耗与代谢副产物的累积，往往会限制细胞生长及产物表达；流加培养，与灌注培养可以通过补充营养物和稀释副产物的方式减小这些限制，相对而说流加培养操作更简单灵活，目前细胞密度可达10 5   -10 7 /ml，产物蛋白产量可达 10g/L 以上。  

细胞培养基优化的基本步骤分为：   

1.选择不同的培养基。进行单因素多水平测试，测试不同培养基对培养的影响；

2.对有机氮源进行氨基酸分析。这一步最好是由培养基提供商和制药商配合进行，或者请有符合认证的商业检测机构提供服务；

3.数据处理。根据不同培养基氨基酸水平，可以计算出每个测试中初始氨基酸的组成，然后再使用方差分析，计算每种氨基酸对培养结果的影响；

4.验证。如果方差分析结果显示某种或某些氨基酸是关键因素，则可以通过添加或稀释或混合使这些氨基酸达到优化的含量,然后经过测试，确定优化配方。  

对基础培养基、流加培养基及灌注培养基的开发、优化已逐渐成为动物细胞培养产业化的关键一环，吸引了越来越多相关企业与研究机构的关注。目前已有多种细胞能够实现无血清培养，并且有多种无血清培养基也已经商业化各大培养基厂商都在不断推出新的培养基，以满足正在发展迅速的生物药厂；而各大药厂都在根据自己所培养的细胞类型寻找和开发与之相适应的培养基。与根据自身细胞类型进行培养基配方定制研究相比，采用现有商业化培养基进行细胞培养的优化显得更加方便和迅速。

总结

未来五到十年培养基的发展将受到药物需求、制造过程、发展战略和设施的选择等方面共同的选择。生物制药制造商正在考虑模块化的设备，具有即插即用的功能设计。这种灵活性的概念是支持个性化药品，小批量生产，分散单一制造地点，启用模块化生产形式在区域范围内的部署，允许频繁使用新技术，在不干扰其他模块的情况下引入、实施新的工艺流程。改进的模块化能够支持多产品制造，最大化设施容量和降低总体成本。随着对药物生产过程与质量一致性要求的不断提高、组学分析技术的快速发展和数据分析技术的不断创新，生物制药企业面对的研发成本高、生产周期长、实验数据复杂、规模放大等难题将得到更多的探索和逐渐的解决。  

近年来，在政策的支持下，我国生物制品产业发展势头强劲，资本投入持续增加，在部分产品领域逐渐实现进口替代。作为生物制品的关键原材料，受生物制品产业快速发展的推动，细胞培养基行业规模持续扩大。根据新思界发布的《2022-2026年中国细胞培养基行业市场行情监测及未来发展前景研究报告》，2020年，中国细胞培养基市场规模达到了40亿元以上。但是，中国细胞培养基产品绝大部分依赖进口，对我国生物制品行业的健康发展造成了不利影响。

来源：医麦客 2022-07-07

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