作者解读丨内蒙古农大: 植物乳杆菌 P9 可改善农药暴露人群的肠道菌群代谢物并减轻炎症反应（国人佳作）

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编译：微科盟九卿臣，编辑：微科盟小编、江舜尧。

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导读  

农药是现代农业必不可少的重要组成部分，尤其是中国农药使用量要高于世界平均水平，因此，农药同杀虫剂的使用一样引起了人们对环境和人体健康的关注。多种农药残留的积累增加了人类患慢性代谢疾病的可能性，所以应重视各种农药协同作用对农药高频暴露人群的危害。

本研究旨在应用多组学技术来揭示肠道菌群对农药暴露的反应及植物乳杆菌P9（Lactiplantibacillus plantarum P9）的摄入对高农药暴露后肠道菌群和免疫因子的影响。研究结果表明，频繁接触农药虽然不会改变肠道菌群的组成，但会增加肠道中脂多糖的丰度，这可能会导致慢性炎症。食用益生菌P9维持了高农药暴露受试者肠道菌群的动态平衡，并降低了Streptococcus gordonii和Streptococcus anginosus等病原体的丰度。通过检测血清、尿液和粪便样本中的代谢物发现，随着P9的摄入，尿苷和5-羟脯氨酸的浓度显著增加。此外，P9可缓解高频农药暴露引起的INF-γ、SDF-1α和IL-7的紊乱，促进农药残留的排出。综上所述，本研究为益生菌在农药解毒中的应用提供了新的见解，并建议将益生菌作为应对农药暴露危害的一种预防措施。

论文ID

原名：Lactiplantibacillus plantarum P9 improved gut microbial metabolites and alleviated inflammatory response in pesticide exposure cohorts

译名：植物乳杆菌 P9 可改善农药暴露人群的肠道菌群代谢物并减轻炎症反应

期刊：iScience

IF：6.107

发表时间：2022.5

通讯作者：陈永福、张和平

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

DOI号：10.1016/j.isci.2022.104472

实验设计

本实验按照农药暴露频率将60名受试者分为健康组（每周喷洒次≤2次）和高暴露组（每周喷洒次数＞2次），其中健康组13人，高农药暴露组47人。将农药暴露组进一步分为安慰剂组（27人）和P9组（20人）。安慰剂组每天摄入含有麦芽糖糊精、低聚半乳糖、草莓粉和木糖醇的粉末，而P9组除了与安慰剂组等量的粉末外还摄入了含P9（6×1010 CFU/d）的粉末，该粉末除了P9以外其他成分对实验结果均无影响。在第0天和第30天收集受试者的血清、尿液和粪便样本，测定各项指标。首先对血清进行免疫测定，再使用QTRAP®6500+UPLC-MS/MS系统来对血清、尿液和粪便样本中的被筛选出的13种农药进行靶向定量。然后按照特定方法提取出血清、粪便和尿液中的代谢物，将提取的样品注入到UPLC-Q-TOF系统进行分析，将其MS/MS质谱与当地标准库和在线质谱数据库进行质谱比对，鉴定出显著差异代谢物。最后使用QIAamp粪便试剂盒从粪便样本中提取总DNA，采用Illumina HiSeq 2500测序仪进行鸟枪法宏基因组测序。

图1 实验设计图

前言

农药是保持现代农业高产的重要因素。随着农药种类越来越多，其使用量也越来越高，农药同杀虫剂的使用一样引起了人们的关注。在以往的农药危害方面的研究中，通常把乙酰胆碱酯酶（AChE）活性作为人体内农药中毒的重要标志。然而，这种方法也存在着很大的局限性：只有当人们暴露于有机磷和氨基甲酸酯类农药或杀虫剂时，AChE活性才会发生变化，而且AChE活性在不同个体间也存在显著差异。因此，我们迫切需要开发和验证一种更实用的新型生物标志物来评估多种农药暴露对人体的危害。有来自流行病学的研究证据表明，农药暴露可能干扰宿主免疫系统，导致细胞因子和代谢物等免疫系统指标发生变化，这可能是一个检测农药引起的免疫毒性的易感性标志。此外有大量研究表明，肠道菌群参与宿主的免疫调节、营养代谢和激素分泌等基本生理功能，并且增强宿主对外来环境污染物和生物污染的抵抗能力，同时肠道菌群的代谢可降低或完全消除外来生物制剂的毒性。一些肠道细菌对体外或体内的农药污染物也表现出良好的降解能力，并可以缓解农药引起的器官损伤。另一方面，如果暴露于多种农药，也可能会干扰肠道菌群的结构和功能而导致代谢紊乱。因此，肠道菌群在降解和缓解多种农药的危害方面发挥着至关重要的作用。然而迄今为止，肠道菌群降解农药的潜在机制尚不清楚。

为了填补这一空白，本研究利用宏基因组学和代谢组学技术，研究了传统的食源性益生菌植物乳杆菌P9对农药暴露人群肠道菌群及其代谢物的调控作用。在体外研究中发现，植物乳杆菌P9具有对乐果、甲拌磷（磷酸盐）和乐果酸（氧化乐果）三种常见OPPs的高降解能力。P9也显示出对甲酸的降解活性，并减轻了甲酸对大鼠的毒性。我们的研究将人群分为两组，首先研究健康人群频繁接触农药后对健康的危害，然后对高农药暴露的患者使用益生菌，采用多组法从部分到整体评价益生菌的治疗效果。鉴于农药污染的广泛存在及其对人体健康的危害，探索益生菌与农药暴露及宿主肠道菌群相互作用的机制以及今后益生菌应用于减轻农药对人类健康的危害方面具有重要意义。

结果

本次实验我们招募了60名受试者参与，并将受试者按照农药 暴露 程度分为两组。首先，我们研究了肠道菌群对农药暴露的反应 （ 图2A ） 。然后，我们进一步将人群分为两组，以揭示在高农药暴露期间，益生菌干预对肠道菌群和免疫因子的影响 （ 图4A ） 。

1 农药暴露引发了人类的炎症反应，并改变了人类肠道菌群

为了探讨人体肠道菌群和免疫系统对高频农药暴露的反应，我们检测了受试者的各种指标。首先在免疫标志物方面，我们发现两种炎症标志物（ET内皮素，P=0.038；MCP-1单核细胞趋化蛋白-1，P=0.04）的浓度显著增加（图2B）。ET和MCP-1都与肾脏疾病有关，这意味着大量暴露于农药可能会间接损害肾脏。

其次我们通过农药暴露程度评估组间肠道菌群的多样性，高农药暴露组与健康组无显著差异（图2C），然而健康组和高暴露组之间的物种丰度存在显著差异（图2D）。另外，在高暴露组中，Bacteroides cellulosilyticus的丰度显著增加，而Lactococcus garvieae和Proteus mirabilis的丰度显著下降。最后，我们还发现某些肠道菌群代谢途径的改变是由物种丰度变化引起的。高农药暴露导致19条途径会发生显著变化（图2E），例如高暴露组的L-谷氨酸降VII（丁酸合成途径）和DTDP-N-乙酰甲状腺素生物合成途径显著高于健康组。

图2 高农药暴露后免疫指数和肠道菌群的实验设计和比较分析。（A）将人群分为两组：健康组（n=13）和高农药暴露组（n=47），收集样本并对数据进行分析。（B）健康组与高农药暴露组的免疫因子的差异显著（P<0.05），误差为平均值±SEM。（C）健康组和高暴露组中的Shannon指数，Simpson指数以及基于Bray-curtis的主坐标分析。健康组和高暴露组在PCoA中的不同颜色点代表不同组的样本。（D）健康组和高暴露组中物种的差异显著（P<0.05），误差为平均值±SEM。（E）健康组和高暴露组之间的代谢途径存在显著差异，以Log2对数坐标表示。数据<0表示健康组中相关的代谢途径，数据>0表示高农药暴露组中相关的代谢途径。（原文图1）

2 大量农药暴露导致激素代谢紊乱

由以上结果，我们已经发现高农药暴露会影响肠道内微生物的代谢途径，所以我们进一步研究了其代谢产物的变化。实验发现，健康人群与高农药暴露人群粪便代谢物有明显的差异，并且发现了一些差异代谢物（图3A）。在高暴露组中激素代谢物（雄烯二酮和2，3-dinor-8-iso-PGF2alpha）的含量显著增加（图3B）。这些代谢产物与类固醇激素的生物合成和花生四烯酸代谢途径有关。这些结果表明，农药暴露干扰了体内激素的新陈代谢。在另一项农药暴露人群的研究中也发现了一些激素的生物合成存在障碍。此外，高暴露组的脂质代谢产物PE（20 ∶ 0/0 ∶ 0）和PC（12 ∶ 0/0 ∶ 0）也显著升高，说明农药可促进肠道或肠道菌群的生物合成能力。根据血清和尿液代谢产物分析，肠道是对农药暴露最敏感的器官。

图3 健康组和高暴露组中粪便代谢物的分析和网络图的创建。（A）健康组与高暴露组粪便样本的偏最小二乘判别分析。（B）健康组和高暴露组的代谢产物有显著变化（P<0.05），误差为平均值±SEM。在高农药暴露后微生物物种、代谢途径、代谢物、农药暴露频率和免疫因子之间的相关网络发生了不同的变化。边缘宽度和颜色（红色表示正相关，蓝色表示负相关）与Pearson相关系数的相关强度成正比。（原文图2）

3 炎症反应与高农药暴露之间的潜在关系

在上述分析的基础上，进行关联分析，探讨农药暴露频率、肠道菌群、代谢途径及代谢产物与免疫因子之间的关系（图3C）。结果表明：健康人群高频暴露于农药后，脂多糖生物合成代谢途径与Dialister invisus呈正相关（r=0.97）。MCP-1与Dialister invisus呈正相关（r=0.45）。脂多糖合成代谢途径是革兰氏阴性菌脂多糖合成的主要途径，脂多糖会影响宿主免疫系统的正常功能，使相关的代谢途径和代谢产物增加，进而影响免疫因子，导致炎症反应的发生。

4 植物乳杆菌P9可促进体内农药残留的排出，减轻农药暴露引起的炎症反应

研究发现，在补充P9后，受试者体内的免疫因子发生了显著变化。将P9摄入0天和30天的免疫因子指标进行比较后发现，促炎因子INF-γ、SDF-1α和IL-7的水平显著降低（图4B）。此外通过比较P9摄入前后受试者粪便中的农药残留水平，发现摄入P9后粪便中乐果酸水平显著升高，表明P9有助于高农药暴露患者体内农药残留物的排出（图4C）。

补充P9后巨噬细胞炎症蛋白-1β（MIP-1β）的表达水平也显著降低，而安慰剂组没有显著变化，另外P9组VC和VD水平也有显著变化（图S1A）。在研究中我们还检测了受试者的尿液白蛋白（ALB）水平，但尽管P9对ALB的表达有所改善，但它并没有使其恢复到正常水平（图S1B）。所有这些结果表明，P9的摄入缓解了农药高度暴露人群的炎症反应。

图4 实验设计和P9摄入对P9组免疫因子和粪便农药残留的影响。（A）将高暴露组人群分为两组：P9组（n=20）和安慰剂组（n=27）。在连续服用P9和安慰剂30天后，收集并分析血清、尿液和粪便样本。P9粉末从实验第1天就开始补充，持续30天。（B）P9干预30天后免疫因子有显著变化（P<0.05），误差为平均值±SEM。（C）不同组粪便中农药残留氧化乐果的表达。（原文图3）

5 植物乳杆菌P9维持宿主肠道菌群的动态平衡

以上结果表明，益生菌具有减轻炎症的作用，因此P9干预对肠道菌群产生的影响尤为重要。P9组受试者在第0天和第30天的肠道菌群结构无显著差异（P>0.05），然而与安慰剂组相比，P9组更接近正常水平，P9的摄入维持了受试者肠道菌群的稳定。在P9摄入30天后受试者体内植物乳杆菌丰度显著增加，而Streptococcus gordonii和Streptococcus anginosus等病原体丰度显著降低（图5B）。所以植物乳杆菌P9可以在一定程度上影响农药高度暴露人群的肠道菌群，增加有益物种的丰度，降低致病菌的水平（图S1C）。

在此基础上，我们研究了P9干预对肠道菌群代谢通路的影响。P9干预显著上调一些通路，如肌酐降解II和尿囊素降解IV，同时也会显著下调一些代谢通路，如L-瓜氨酸生物合成和5-羟色胺降解（图5C）。

图5 实验设计和P9干预后的肠道菌群。（A）基于Bray-Curtis距离的核密度估计，不同颜色代表不同时间的不同样本组。（B）健康组和高暴露组之间物种的变化存在显著差异（P<0.05），误差为平均值±SEM。（C）P9干预前后代谢途径存在显著差异，以Log2对数坐标表示。数据<0代表第0天的相关代谢途径，数据>0代表第30天的相关代谢途径。（原文图4）

6 高农药暴露人群摄入植物乳杆菌P9后，代谢发生显著变化

在了解了P9对受试者肠道菌群的影响后，我们研究了P9干预诱导的代谢组的变化，包括血清、尿液和粪便代谢组。通过对三个组分在干预前后两个时间点代谢物的对比，筛选出了一些 干预 前后有所差异的代谢物。结果显示，P9 干预 30天后，粪便中鹅去氧胆酸硫酸盐水平显著降低，而盐酸苯丙烯啶水平显著升高（表S3）。尿液中甲基吡嗪、维甲酸和香草乳酸等代谢物水平显著降低（表S4）。此外，4-3-吡啶丁酸酯、11-脱氧皮质酮、尿苷和5-氧脯氨酸等血清代谢物显著升高，而4，α-羟甲基-5，α-胆碱酯-8，24-二烯-3，β-醇水平显著降低（表1）。综上所述，在P9的影响下，人体的代谢物发生了显著变化。

表1 摄入P9后血清中的生物标志代谢物

 *比值是P9组第30天与第0天代谢物相对浓度的比值。

#P代表调整后的P值（P<0.05，比值>2）。

7 益生菌与肠道菌群相互作用减轻炎症的潜在机制

综上所述，农药高暴露人群摄入P9可维持肠道菌群的稳定，减轻炎症反应，因此我们深入探讨了益生菌与炎症因子的潜在关系。我们对P9摄入前后产生显著变化的菌株、免疫因子、代谢途径和代谢物进行了相关性分析（r>0.4）（图6A）。结果显示，P9与肌酐II的降解呈正相关，而且相关代谢物与引导该代谢途径的免疫因子具有很强的相关性。此外，与植物乳杆菌相关的代谢物也与免疫因子呈正相关。因此，我们在完整网络图的基础上绘制了机制图来大致描述植物乳杆菌通过调节肠道菌群缓解炎症反应的潜在机制（图6B）。以上结果表明，植物乳杆菌P9在缓解农药暴露引发的炎症反应中起着关键作用。

图6 高农药暴露人群的细菌、代谢途径、代谢物和免疫因子网络在摄入P9前后发生了变化。（A）边缘宽度和颜色（红色代表正相关，蓝色代表负相关）与Pearson相关系数的相关强度成正比。（B）植物乳杆菌P9调节肠道菌群和减轻高农药暴露患者炎症的潜在机制。（原文图5）

讨论

在这些研究中，研究对象在频繁暴露于农药期间，肠道的某些物种发生了显著变化，例如Dialister invisus。此前有报道称，在不同的农药混合感染中，Dialister invisus会通过产生内毒素而在宿主体内诱发炎症反应，Dialister invisus与脂多糖生物合成的超通路呈正相关（r=0.97），这些结论支持了上述分析。大量研究表明，农药会扰乱肠道菌群，增加肠道中内毒素的水平，激活NF-κB通路，诱导机体产生炎症反应。P9干预对农药诱导的肠道菌群紊乱有保护作用，显著降低了Solobacterium gordonii和Streptococcus anginosus等病原细菌的丰度，并显著增加了植物乳杆菌的丰度。总之，P9可降低产生内毒素的肠道微生物的丰度，例如Dialister invisus，也可降低内毒素引起的炎症反应。

植物乳杆菌的丰度也与肌酐降解代谢途径II呈正相关（r=0.47）。肌酐降解代谢途径II的上调加速了肌酐的降解，减轻了农药对肾脏带来的压力。这可能是P9对农药所引起的有害影响的一种保护模式。

农药作为一种外源毒性化合物会引起组织炎症，这已经在许多体内和体外实验中得到了验证。在一项农民队列研究中，与对照组相比，长期暴露于农药（杀菌剂、杀虫剂和除草剂）混合物的受试者血浆中促炎症因子IL-6水平显著升高（P=0.04）。循环炎症生物标志物如IL-6、TNF-α、MCP-1和E-selectin，与多种代谢紊乱相关。

在我们的研究中，高暴露组血浆中炎症因子ET和MCP-1也明显升高。ET和MCP-1是两种与肾脏疾病密切相关的免疫因子，在多种肾病中高度表达，可通过多种方式对肾脏造成不同程度的损害。因此ET和MCP-1作为肾脏疾病的临床诊断指标具有重要意义。综上所述，农药引起的炎症可能是其他继发性疾病的重要诱导因子，而ET和MCP-1水平是本研究中农药干扰免疫系统的关键性指标。

摄入植物乳杆菌P9可改善这些炎症因子。肌酐代谢途径II的下游代谢产物如2-磷酸盐、PA（22∶0/18∶3（9Z，12Z，15Z））与P9呈正相关，与MCP-1、IL-7等促炎因子呈负相关。此前，在Lactobacillus delbrueckii和Lactobacillus johnsonii基因组中发现了2-磷酸乙醇酸回补代谢途径。由于摄取P9增加了植物乳杆菌的丰度，肌酐代谢途径II显著上调，从而降低了促炎因子IL-7和MCP-1的含量，缓解了炎症反应。所有这些都证明了P9对高农药暴露的人群具有治疗效果。

研究发现，在血清中，尿苷（组成RNA的四种成分之一）在许多炎症动物模型中具有抗炎作用。例如，在急性肺损伤、支气管哮喘和硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎研究中，已发现5-羟脯氨酸与慢性肾病发病率的降低显著相关，高农药暴露组摄入P9后，血清中该指标显著升高。这表明由于P9的调节作用，5-羟脯氨酸可能是一种对肾脏有益的代谢物。此外，在前期研究中，与对照组相比，植物乳杆菌减轻了有机磷农药模型大鼠的炎症反应，提高了肠道菌群的丰度，这与本研究结果一致。这些结果表明，植物乳杆菌P9可以调节紊乱的肠道菌群，防止高农药暴露人群的进一步炎症反应。

总的来说，我们从本研究中得出了三个结论。首先频繁暴露于农药会增加人体内促炎因子的表达，引发慢性炎症。植物乳杆菌P9通过增加农药暴露人群中植物乳杆菌的丰度，调节了高频农药暴露所引起的炎症反应，促进了体内农药残留的排出。最后P9自身或宿主在P9调控下产生的代谢物也在缓解因农药而引起的炎症中发挥重要作用。本研究结果为益生菌在农药脱毒领域的应用提供了新的见解，并为植物乳杆菌P9作为预防日常生活中农药暴露的补充剂提供了客观和详细的数据。

原文链接：https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(22)00743-X

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