学术先声丨恶性间皮瘤mRNA疫苗开发：肿瘤抗原和免疫亚型的鉴定

本期《学术先声》栏目分享中国医学科学院肿瘤医院李宁教授、王书航教授研究团队与先声诊断科研团队近期合作发表在Vaccines（IF=4.961）上的一篇研究[1]。该研究在恶性间皮瘤（MESO）中鉴定出五种肿瘤抗原。其中，FAM134、ALDH3A2、SAV1和RORC与良好的预后相关，而FN1与较差的存活率相关。该研究还定义了两种间皮瘤免疫亚型：TM1，TM2。与TM1相比，TM2的患者预后更好，并且更有可能从疫苗接种中受益。TM1显示出相对“静息”的肿瘤微环境、肿瘤突变负荷高，DNA损伤修复途径相关生物学特征显著。免疫检查点和免疫原性细胞死亡调节剂在两种亚型之间也有显著差异。该研究表明：FAM134B、ALDH3A2、SAV1、RORC和FN1是开发MESO mRNA疫苗潜在的有效新抗原，TM2患者适合接种该抗原从而提高患者预后。

研究背景

恶性间皮瘤（MESO，malignant mesothelioma）是一种罕见的肿瘤，具有高度侵袭性，主要起源于间皮表面，包括胸膜（约占所有MESO的90%）;腹膜（约占所有MESO的10%）;或心包、阴道睾丸（<1%）。全球MESO的发病率持续上升，特别是在广泛使用石棉的国家。虽然早期患者可进行手术切除，但对于大多数患者而言，诊断往往较晚。在过去20年中，全身化疗联合铂和培美曲塞一直是晚期不可切除患者的一线治疗方案。近年来，CTLA-4抑制剂和抗PD-1抗体的联合使用在MESO的临床治疗中显示出较好的进展，免疫治疗已被批准成为不可切除MESO的一线治疗方案。然而，由于肿瘤内和肿瘤间异质性，包括基因组缺陷，以及不同患者群体和同一肿瘤的不同区域之间的异质性免疫景观，仅有部分患者可以从免疫治疗中获益。

针对癌症的疫苗已成为另一种有临床前景的免疫治疗策略，其具有特异性更高、免疫反应更持久、治疗窗口更广、毒性小、治疗效果更好、不良事件更少、耐药性更低、成本更低等优点。MESO已经有多种疫苗处于临床前和临床试验中。一种表达间皮素的单核细胞增多性李斯特菌疫苗（CRS-207）具有良好的安全性，诱导肿瘤微环境（TME）发生阳性变化，并且在中位生存期为14.7个月的MESO患者中，与环磷酰胺联合使用时，89%的患者达到客观缓解。TroVax是一种含有5T4糖蛋白基因的病毒疫苗，联合一线培美曲塞-顺铂化疗，在一线单臂II期试验（SKOPOS）中，已证明对局部晚期或转移性MESO患者具有强大的免疫活性、可接受的安全性和耐受性。   与目前的抗原形式相比，信使RNA（mRNA）引起了革命性的疫苗开发进展，因为它有可能诱导体液和细胞介导的免疫反应以获得高效率，并且体内可调节且半衰期短，使得其具有更好的安全性。同时抗原设计的简单性和适应性，可以使得生产能够做到实现快速且具有低成本高效益。目前已经研发出多种mRNA疫苗用于各种癌症，然而，对于MESO，既没有生产出有效的mRNA疫苗，也没有发现非常适合接种疫苗的亚群患者。   本研究的目的是鉴定潜在的MESO抗原，用于mRNA的疫苗开发，并绘制MESO免疫景观图，以选择适合接种疫苗的患者。  

研究结果

1. MESO相关抗原鉴定

首先，评估了24,776个潜在表达肿瘤相关抗原的基因，以发现可用于临床试验的MESO抗原。筛选出在肿瘤患者中出现扩增或突变的基因1974个，进一步鉴定具有免疫抑制或刺激特性的抗原。其中27个基因与MESO的总体生存期（OS）密切相关，而无进展生存期（PFS）仅与12个基因相关（图1A）。分析肿瘤纯度与这12个免疫生存相关基因之间的相关性，结果表明，FAM134B、ALDH3A2、SAV1和RORC等4个基因与肿瘤纯度呈正相关，FN1与肿瘤纯度呈负相关，这五个基因最终被鉴定为候选基因（图2A）。

图1. 鉴定MESO的潜在肿瘤抗原  

 FAM134B（图1B）、ALDH3A2（图1C）、RORC（图1D）和SAV1（图1E）的表达升高与MESO良好的OS有关，表明只有四种肿瘤抗原可以被认为是刺激免疫系统的。此外，FAM134B和RORC表达水平与自然杀伤细胞（NK）水平呈正相关，而AlDH3A2和SAV1表达水平与树突状细胞（DC）水平呈正相关，如图2B所示。相比之下，FN1基因与MESO的不良OS相关（图1F），与DC和NK细胞水平呈负相关（图2B）。该分析揭示了包括FAM134B，ALDH3A2，SAV1，RORC和FN1在内的肿瘤抗原是MESO-mRNA疫苗的重要候选者，可能具有免疫激发作用，并且由APC（antigen-presenting cell）呈现和处理以进行肿瘤反应诱导。最后，使用多变量Cox回归分析来构建预后风险评分，在五个基因中确定了两个与MESO OS显著相关的基因：FN1（HR = 1.22，P = 0.014）和RORC（HR = 0.84，P = 0.006）。  

图2. 肿瘤纯度，免疫评分特征识别  

2. MESO免疫亚型的鉴定

肿瘤及其微环境可以通过免疫分型来反映，这可以帮助识别疫苗接种候选者的患者人群。收集了四个免疫相关数据库中2526个免疫相关基因，其中282个基因与OS相关。在TCGA的MESO 87个肿瘤样本中探究了其表达模式。进行无监督聚类识别出TM1和TM2两种免疫亚型（图3B）。其中TM1与较差的OS相关，而TM2与更好的预后有关（图3C）。并且这两组患者的肿瘤分期以及肿瘤转移情况具有显著差异（图3D）。

图3. 鉴定MESO的潜在免疫亚型  

3. MESO免疫亚型分子及细胞特征

比较了两个亚组之间的肿瘤纯度和免疫评分，结果显示：TM2患者具有更高的肿瘤纯度（图4A）。此外，TM2的基质评分显著降低。然而，免疫评分没有显示出明显的差异（图4B）。已有研究对来自TCGA 33种癌症类型的1000多个肿瘤样本进行免疫基因组学分析，确定了六种免疫亚型，包括伤口愈合（C1）;IFN-γ显性（C2）;炎症（C3）;淋巴细胞耗竭（C4）;免疫静息（C5）和TGF-β显性（C6）。在这项研究中，探究了先前描述C1-C6泛癌免疫亚型与TM免疫亚型之间的关联以及六个亚群的分布情况。结果显示，TM1和TM2中每种免疫亚型的百分比存在差异（图4C，D）。例如，伤口愈合（C1组）主要聚集成TM1，据报道其与高增殖，高肿瘤内异质性和高适应性免疫浸润，以及较差的临床结局相关。另外，IFN-γ（C2）主要聚集于TM2，其M1/M2巨噬细胞极化程度高，CD8信号强，T细胞受体多样性最大。此外，TM1中TGF-β显性（C6）的比例高于TM2，表现出最高的TGF-β特征和高淋巴细胞浸润。总体来看，TM2肿瘤患者具有更强的肿瘤免疫，且比TM1肿瘤患者具有更好的预后。这一结果证实了本研究免疫分型方法的有效性，同时增强和支持了MESO的早期分类。

此外，观察到免疫亚型与DNA损伤修复（DDR）途径相关基因组特征密切相关。探究了五个DDR特征，包括肿瘤内异质性（ITH）、拷贝数变异 （CNV）、非整倍性、同源重组修复损伤（HRD）。结果显示肿瘤内异质性，DNA片段数以及同源重组修复损伤在两种免疫亚型之间显著不同（图4E）。

图4. 免疫亚型的细胞和分子特征  

4. MESO免疫亚型的免疫调节剂激活特征

免疫原性细胞死亡（ICD）调节剂和免疫检查点（ICP）在癌症免疫中的重要性不容忽视。因此，分析了两种亚型中ICD和ICP的表达水平。其中6个（24.0%）ICD在免疫亚型中表达差异（图5A）。例如，在TM1肿瘤中，EIF2AK2，HGF，P2RY2和PANX1基因高度显著和上调，而在TM2肿瘤中，TLR3和MET过表达。同时13个ICP相关基因（28.9%）差异表达（图5B）。ADORA2A、CD44、KIR3DL1、TNFRSF4、TNFRSF9、TNFSF9、TNFSF18和NRP1基因在TM1肿瘤中显著上调，而CD160、CD200、LAG3、TMIGD2和TNFSF14在TM2中的表达水平显著更高。因此，可以使用TM免疫分型作为具有mRNA疫苗潜在用途的生物标志物，因为它可能代表ICD和ICP调节剂的表达水平。

图5. 免疫亚型中ICD调节剂和ICP的激活  

5. 免疫亚型突变谱特征识别

该研究发现免疫治疗的有效性、肿瘤抗原突变负荷（TMB）和mRNA疫苗之间存在很强的相关性，如图6所示，这两种亚型在突变方面显示出显著差异，包括突变基因的数量和突变谱。TM2肿瘤中突变基因的比例（87.5%）高于TM1肿瘤（75.86%）。此外，基因组中频繁发生的突变最多的十个免疫相关基因景观在两种免疫亚型之间显著不同，如图6所示。例如，ALPK3，ARID2，EML5，FAT4，LATS2，TP53和ZNF469在TM1肿瘤中具有特异性基因组改变，而ACAP1，CCDC168，DCLRE1B，FANCA，LDB1和LRP1SETD2在TM2肿瘤中特异性改变。该研究表明，MESO患者的体细胞突变类型和突变率可以通过免疫亚型来预测。

  图6. 免疫亚型突变谱特征识别  

6. 免疫亚型生物学功能特征识别

与TM2肿瘤相比，TM1肿瘤中生物过程（图7A），细胞成分（图7 B）和分子功能（图7C）的GO富集通路具有显著差异。包括抗原加工，血管生成和上皮间充质转化（EMT）等。为了进一步分析两种免疫亚型的特征，使用ssGSEA进行了KEGG功能富集分析。TM1亚型在各种基质和致癌途径中高度富集，如G2M检查点信号通路、EMT通路、刺猬信号通路、缺氧通路、抗原处理呈递信号通路和VEGF信号通路（图7D、E）。

  图7. 免疫亚型的功能富集分析  

7. 免疫亚型hub基因的鉴定

最后通过PPI网络鉴定免疫亚型hub基因：FN1（图8）。此外，FN1与肿瘤纯度呈负相关（图1G）。因此，我们最终将其鉴定为候选基因，其表达可以强烈影响肿瘤微环境并导致肿瘤进展。

图8. MESO免疫亚型hub基因

讨论

该研究构建了MESO的异常基因表达模式和突变景观，鉴定出5种具有突变、扩增以及与预后相关的靶向抗原，包括FAM134B、ALDH3A2、SAV1、RORC和FN1。前4种抗原的过表达与良好的OS、PFS和高APC细胞浸润相关，而FN1呈负相关。值得注意的是，FN1是一种重要的癌基因，与肿瘤免疫微环境有关。这些抗原在MESO的进展和形成中起着重要作用，它们可以直接呈递和处理到CD8+ T细胞以启动免疫反应。这是第一项筛选MESO抗原以开发mRNA疫苗的研究，然而，需要进一步研究以确定它们的作用机制。

鉴于肿瘤异质性，mRNA疫苗仅对一小部分癌症患者有益，因此全面了解MESO的免疫景观对于选择合适的患者群体至关重要。在这项研究中，我们根据免疫基因表达谱将MESO分为两种免疫亚型TM1和TM2，它们揭示了不同的分子，细胞和临床特征。与TM1亚型相比，TM2肿瘤显示出更好的预后特征，这表明该免疫型可以用作MESO的预后预测因子。此外，TM2亚型具有较高的肿瘤纯度评分和较低的基质评分，这在先前的一项研究中确定了MESO患者的良好预后。根据以前的免疫分型研究，MESO被分类为C1-C6亚型。本研究定义的两个亚型中五个类别具有显著差异的分布情况。TM1主要与C1（伤口愈合）和C6（TGF-β显性）类别重叠，与免疫静息的表型和预后不良有关，而TM2主要与C2（IFN-γ显性）重叠，其特征是免疫细胞浸润增加，预后更好。这六个类别代表了TME的特征，这些特征在很大程度上跨越了传统的癌症分类来创建分组，并表明某些治疗方法可能独立于组织学类型，这也证明了本研究中定义的免疫亚型优于传统亚型的预测能力。在MESO中，DNA修复过程经常被发现是改变的，以及肿瘤内异质性（ITH）、拷贝数变异（CNV）负担和同源重组缺陷（HRD）的高度改变，这在TM1亚型中显示出较高的百分比，并导致预后不良和放化疗耐药性。这一结果表明，对于间皮瘤，ITH和HDR可能是不同肿瘤免疫微环境的更好指标。这种基于免疫的分类不仅考虑了传统的病理分期和分级，而且还考虑了MESO的免疫相关特征。此外，它可以很好地区分不同的预后。因此，与作为单一水平考虑的传统病理特征相比，免疫分型是一种综合的预后预测因子，结合了MESO的常规临床相关和新型免疫相关特征。

除此之外，TM免疫亚型还可以指示对mRNA疫苗的治疗反应。首先，mRNA疫苗可能对具有高表达免疫原性细胞死亡调节剂的患者更有效，而它可能不适合那些免疫检查点上调的患者，这可能抑制疫苗引发有效的免疫反应。其次，具有较高体细胞突变率的TM2肿瘤可能对mRNA疫苗具有更大的反应性。第三，TM1亚型在各种基质和致癌途径中高度富集，这表明TM1亚型的患者可能不适合mRNA疫苗。最后，FN1被鉴定为hub基因，FN1高表达的患者可能对mRNA疫苗出现治疗抵抗。FN1可能是mRNA疫苗的潜在生物标志物。然而，我们的研究是有限的，因为它是回顾性的，并且需要验证已鉴定的疫苗抗原和其他预后标志物。因此，应进一步进行体外和体内研究的探索，以证明该研究鉴定的肿瘤抗原对mRNA疫苗的积极影响。  

结语

该研究表明：①FAM134B，ALDH3A2，SAV1，RORC和FN1是MESO的潜在mRNA抗原，可能对TM2患者有益。②FN1是mRNA疫苗的潜在生物标志物，可以通过FN1确定哪些患者最适合接种mRNA疫苗。 END 

参考文献： [1]  Wang S, Yang Y, Li L, et al. Identification of Tumor Antigens and Immune Subtypes of Maligna nt Mesothelioma for mRNA Vaccine Development. Vaccines (Basel). 2022;10(8):1168. Published 2022 Jul 22. doi:10.3390/vaccines10081168 撰写丨Lilu 编辑、排版丨SX

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