柠檬酸钾对高钙尿症模型中磷酸钙结石的影响。

Effect of Potassium Citrate on Calcium Phosphate Stones in a Model of HypercalciuriaKrieger NS, Asplin JR, Frick KK, Granja I, Culbertson CD, Ng A, Grynpas MD, Bushinsky DA. Effect of Potassium Citrate on Calcium Phosphate Stones in a Model of Hypercalciuria. J Am Soc Nephrol. 2015 Dec;26(12):3001-8. doi: 10.1681/ASN.2014121223. Epub 2015 Apr 8. PMID: 25855777; PMCID: PMC4657843.

枸橼酸钾用于减少钙肾结石患者的结石复发。柠檬酸盐结合肠道和尿钙并增加尿液pH值。代谢为碳酸氢盐的柠檬酸盐应通过减少骨吸收和增加肾钙重吸收来减少钙的排泄。然而，柠檬酸盐与肠钙的结合可能会增加磷酸盐和草酸盐的吸收和肾脏排泄。因此，柠檬酸钾对尿草酸钙和磷酸钙过饱和以及结石形成的影响是复杂的，难以预测。为了研究柠檬酸钾对尿液过饱和度和结石形成的影响，我们利用了第95代近交遗传高钙结石形成大鼠。给大鼠喂食固定量的正常钙（1.2%）饮食，补充柠檬酸钾或氯化钾（每4毫摩尔/天）18周。在 6、12 和 18 周收集尿液。在 18 周时，通过 X 线摄影观察结石形成。喂食柠檬酸钾的大鼠尿液柠檬酸盐、磷酸盐、草酸盐和pH值较高，尿钙水平较低。此外，草酸钙和磷酸钙过饱和度均高于柠檬酸钾;然而，尿酸过饱和度较低。两组都有相似数量的磷酸钙结石。因此，柠檬酸钾有效地提高尿柠檬酸盐水平并降低尿钙水平;然而，尿液pH值，草酸盐和磷酸盐水平的增加导致草酸钙和磷酸钙过饱和度增加。柠檬酸钾诱导尿液化学的复杂变化和由此产生的过饱和度，这可能不利于防止磷酸钙结石的形成。

关键词： 高钙尿症， 肾结石， 矿物质代谢

高钙尿症是在形成钙基肾结石的患者中观察到的最常见的代谢异常。1–3尿钙水平升高增加了草酸钙（CaOx）和/或磷酸氢钙（CaHPO）成核和生长的可能性4，刷状）晶体成临床上显着的肾结石。1含磷酸钙 （CaP） 的宝石可以是刷石、磷灰石或不太明确的晶体形式。特发性高钙尿症 （IH）患者定义为尿钙过多，无明显的代谢原因，通常血清钙正常或升高，血清 1，25-二羟基维生素 D3 正常或升高，血清甲状旁腺激素 （PTH） 正常或升高，血清磷酸盐正常或低，骨量低。1,4,5IH表现出多基因遗传模式。工业化国家肾结石的年发病率超过每1000人1例，女性终生风险约为7%，男性约为11%。7在肾结石的初始发作后，大约 60%-80% 的患者形成至少一种复发性结石。减少结石复发的策略之一是使用柠檬酸钾（K-cit）。8–13口服柠檬酸盐有望减少可用于吸收的钙，14,15减少骨吸收，增加肾小管钙的重吸收，所有这些都会降低尿钙。增加尿枸橼酸盐会隔离尿钙，阻止与磷酸钙（CaP）和/或草酸盐的结合，可能导致结石形成减少。然而，口服柠檬酸盐也应增加尿 pH 值，这可能会增加 CaP 结石的形成。在体外，柠檬酸盐对CaOx晶体成核和生长具有直接的抑制作用（由Ryall评论）16).因此，很难预测K-cit对CaP的常见固相和最终结石形成的尿液过饱和度的精确影响。在患者中，添加膳食K-cit似乎可以减少复发性结石的形成。在一项针对人类的随机、双盲、安慰剂对照研究中，K-cit 减少了复发性结石的形成。17皮尔勒等18发表了一项针对预防复发性结石形成的几种治疗方法的荟萃分析，包括噻嗪类利尿剂和柠檬酸盐。他们确定了三项研究（包括Pak等人。13和巴塞罗等人。17）使用柠檬酸盐补充剂;两项研究的结石复发率有所下降，但第三项研究的结石复发率没有降低。正式的荟萃分析是不可能的，因为一项研究只报告了结石形成率，而没有患者人数。据报道，K-cit 治疗对噻嗪类药物治疗无效的患者有效。

碎石术后已使用柠檬酸盐来预防结石复发。在一项随机对照研究中，枸橼酸钾和钠似乎可降低体外冲击波碎石术或经皮肾镜取石术后结石复发的风险。在另一项随机对照研究中，K-cit似乎可有效减少冲击波碎石术后的下尺骨结石。这两项研究都不是安慰剂对照。美国泌尿外科协会目前的建议包括枸橼酸盐治疗以限制结石复发。然而，在所有以结石形成为主要终点的人类研究中，患者被选为CaOx结石或钙性石症。因此，CaP结石形成的患者被排除在外，或者只是研究参与者的少数。没有前瞻性对照试验研究柠檬酸盐在减少结石形成方面的有效性，特别是在CaP结石患者中，这仍然是一个重要的临床问题。23由于CaP结石成形剂与CaOx结石成形剂相比，其特点为碱性尿液，因此柠檬酸盐对CaP过饱和度和结石形成的影响难以预测。碱负荷会增加尿液pH值，增加CaP过饱和度，而柠檬酸盐的增加和尿钙的减少会降低CaP过饱和度;然而，净效应是不确定的。鉴于柠檬酸盐对预防复发性CaP结石病的影响的不确定性，以及缺乏人类研究，我们利用第95代遗传性高钙结石形成（GHS）大鼠来研究K-cit对CaP结石形成的影响。

GHS大鼠是通过选择性近亲繁殖Sprague-Dawley大鼠以增加尿钙排泄而产生的。当喂食标准的，充足的钙饮食时，每只GHS大鼠现在排泄的尿钙比Sprague-Dawley控制多约10倍。24–49与IH患者一样，GHS大鼠的血清钙正常，24增加肠道钙吸收26和增强的骨吸收，49肾小管钙重吸收减少，36血清 1，25-二羟基维生素 D3 水平正常25,26,30,41,42除了骨矿物质密度降低。39,47高钙尿症是GHS大鼠的多基因性状，44就像在人类身上一样。4–6当喂食标准的，充足的钙饮食时，所有GHS大鼠都会患上肾结石，由CaP组成。在GHS大鼠的饮食中添加羟脯氨酸会导致CaOx结石形成。为了确定K-cit对尿溶质排泄，相对于普通结石固相的过饱和度和CaP结石形成的影响，GHS大鼠喂食正常的钙饮食，不含羟脯氨酸与K-cit或氯化钾（KCl），作为对照。

结果

尿溶质排泄

所有大鼠都坚持食用他们全部分配的食物，因此除柠檬酸盐，氯化物和K外，两组所有大鼠的溶质摄入量相似。K-cit诱导总平均尿钙减少（K-cit，16.1±0.5 mg / d与KCl相比，18.6±0.3 mg / d;P<0.001），K-cit在6周和12周时尿钙减少，但在18周时没有（图 1).K-cit导致总体平均尿磷酸盐增加（K-cit，29±1 mg / d与KCl相比，20±1 mg / d;P<0.001）和尿草酸盐总体平均数（K-ci，1.11±0.04 mg/d与KCl相比，0.62±0.02，P<0.001），尿磷酸盐和尿草酸盐均升高（图 1).

正如预期的那样，喂食K-cit的大鼠的总体平均尿柠檬酸盐升高（K-cit，182±3.4 mg / d与KCl相比，110±2.7 mg / d;P<0.001） （表 1).K-cicit增加平均总尿液pH值（K-cit，7.51±0.04 vs KCl，6.71±0.05;P<0.001）。K-cit 降低平均尿总值 NH4（K-cit， 0.25±0.01 mmol/d vs. KCl， 0.41±0.01 mmol/d;P<0.001）。K-cit增加了平均尿总硫酸盐（K-cit，1.08±0.02 mEq/d与KCl相比，0.86±0.02 mEq/d;P<0.001）。每个时间点都存在这些变化。总体平均尿酸排泄量没有差异（K-cit，1.6±0.1 mg / d与KCl，2.0±0.2 mg / d;P=NS）。

尿液过饱和度

K-cit导致两种CaP的尿过饱和度显着增加（K-cit，8.5±0.6与KCl，4.9±0.2;P<0.001）和CaOx（K-cit，9.8±0.5与KCl，5.5±0.2;P<0.001）和尿酸过饱和度的降低（K-cit，0.003±0.0005与KCl相比，0.022±0.003;P<0.001） （图 2).这些差异中的每一个在每个时间段都很重要。

图 2.

随着K-cit，CaP和CaOx的尿过饱和度（SS）增加，尿酸SS降低。在6周，12周和18周收集尿液24小时，以确定用于计算相对过饱和度的溶质水平，如简明方法中所述。相对过饱和度的值为均值±SEM，并且是无单位的。*K-cit与KCl不同，同一时间段，P<0.05。

血清

K-cit喂养和KCl喂养的大鼠血清钙和PTH水平没有差异，而K-cit喂养的大鼠血清磷酸盐水平降低（图 3).

结石形成

K-cit没有改变肾脏中形成的结石数量或钙化程度（图 4).所有大鼠在肾脏和收集系统内形成大小和密度相似的结石，并且具有相似的钙化程度。

图 4. 喂食KCl或K-cit的大鼠肾结石形成和钙化没有差异。在为期18周的研究结束时，如简明方法中所述，三名观察者确定了肾结石和钙化的程度。肾脏钙化的程度也如简明方法中所述确定。（A）接受KCl或K-cit的大鼠肾脏的代表性X光片。所示图像的钙化分数作为参考提供。（B）定量所有接受KCl或K-cit的大鼠的结石形成和钙化。值为平均值±SEM。

从两组的代表性肾脏中解剖可见结石，并分析晶体形态。所有分析样品的衍射图与生物磷灰石（CaP结石（图 5，顶部）。使用透射电子显微镜（TEM），所有肾结石晶体都具有棒状或针状形状，类似于生物磷灰石晶体的形态（图 5，底部）并且与CaOx的八面体晶体形态不同。

图 5. 肾结石晶体分析显示 CaP 结石同时存在 KCl 和 K-cit。上图：来自大鼠喂养的KCl的结石（左）和来自大鼠喂食K-cit的结石（右）的代表性电子衍射图，显示了生物磷灰石的典型配置。下图：来自用于衍射图案的相同结石的TEM图像：来自大鼠喂养KCl的结石（左）和来自大鼠喂食K-cit的结石（右）。

讨论

高钙尿症是在形成 Ca 基肾结石的患者中观察到的最常见的代谢异常。1–3大多数高钙尿症患者有 IH。尿钙排泄的增加增加了CaOx和/或CaP晶体成核和生长成临床上显着的肾结石的可能性。在 IH 患者中，K-cit 通常用于预防复发性结石形成。8–13然而，没有针对人类的前瞻性对照研究显示 K-cit 在预防复发性 CaP 结石形成方面的功效。23柠檬酸盐对尿溶质排泄有复杂影响，其对CaP结石形成引起的尿液过饱和度的影响难以预测。一些研究表明，CaOx结石可能会随着时间的推移而转化为CaP结石，使用柠檬酸盐治疗可以解释这种现象。50,51然而，尚未有明确的研究证明或反驳柠檬酸盐在CaOx转化为CaP结石病中的作用。

在这项使用GHS大鼠的研究中，提供K-cit导致尿柠檬酸盐排泄增加，K-cit也有效地降低了尿钙。K-cit减少尿钙的机制几乎肯定是多因素的。虽然柠檬酸盐本身很容易在肠道中吸收，52它减少钙的吸收和尿钙的排泄。14,15增加的尿柠檬酸盐也会结合尿钙，从池中除去可用于与磷酸盐或草酸盐结合的钙。此外，柠檬酸盐代谢为碳酸氢盐会导致全身碱化，从而直接降低骨吸收53并增加肾小管钙的重吸收，从而降低尿液中钙的水平。尿钙的减少本身将有利于降低含钙肾结石的尿过饱和度。如在人类中所见，柠檬酸盐治疗降低了GHS大鼠的尿钙并提高了尿柠檬酸盐和pH值。然而，我们还发现用柠檬酸盐治疗的GHS大鼠的尿草酸盐，硫酸盐和磷的增加以及血清磷的减少，这些变化以前在用柠檬酸盐治疗的人类中没有报道。柠檬酸盐与肠道钙的结合可以减少钙与草酸盐的肠道结合，从而可能允许更多的草酸盐吸收。在肾脏中，草酸盐在近端小管中运输。54,55在肾近端小管和肠道中发现的鼠阴离子转运蛋白 Slc26a6 对氯/草酸盐交换具有特异性。56–58在小鼠中敲除Slc26a6导致高草酸尿症，59,60低枸橼尿症，61和钙石形成。59在灌注实验中，硫酸盐或碳酸氢盐的存在抑制了草酸盐的运输，表明这些阴离子之间的竞争性抑制。55Slc26a6和柠檬酸盐转运蛋白NaDC-1的共表达表明这些转运蛋白相互作用。61NaDC-1增强了Slc26a6的转运活性，而Slc26a6抑制了NaDC-1。61这些数据表明草酸盐和柠檬酸盐运输之间存在密切关系。在这项研究中，我们发现施用K-cit导致尿液草酸盐排泄的显着增加，这种增加会增加尿液相对于CaOx的过饱和度。

柠檬酸盐对肠道钙的结合也将允许磷酸盐的更大吸收。肾磷酸盐重吸收由近端小管中的II型Na偶联磷酸盐共转运蛋白调节，其被细胞外酸化抑制。+62K-cit诱导的全身和尿液碱化会增加肾小管磷酸盐的重吸收;然而，PTH的增加虽然没有统计学意义，但可能是本研究发现的尿磷酸盐增加和血清磷酸盐减少的原因。喂食K-cit的GHS大鼠尿液硫酸盐增加。阴离子转运蛋白Slc26a2证明了硫酸盐，草酸盐和氯化物的底物特异性，也存在于近端小管中。63由于硫酸盐转运异常，SLC26A2在人体中的突变可引起隐性软骨发育不良。63当在非洲爪蟾卵母细胞中表达时，酸性细胞外pH抑制阴离子交换，而酸性细胞内pH激活细胞内氯的交换为细胞内硫酸盐，但不用于氯化物或草酸盐。64有必要进行进一步的研究来确定为什么喂养K-cit的GHS大鼠的硫酸尿量增加。在这项研究中，K-cit的提供导致尿pH值增加，这将降低CaP的溶解度。相反，尿酸固相可能是形成钙结石的病灶，更易溶于碱性尿液。K-cit不会改变尿量，表明尿过饱和度的任何变化都不是尿量差异的结果。K-cit没有改变尿肌酐排泄，表明该药物的施用在此期间不影响肌肉质量。

Zerwekh等人65给Sprague-Dawley大鼠喂食低酪蛋白或高酪蛋白饮食，用KCl或K-cit（每天4 mEq钾）8周。尿 pH 值不随 K-cit 升高。与低酪蛋白饮食+KCl相比，尿钙排泄量随高酪蛋白饮食增加，K-cit降低尿钙增加。K-cit不会改变尿磷酸盐或草酸盐。在目前的研究中，我们使用3倍高剂量的K-cit，观察到尿液pH值，尿草酸盐和尿磷酸盐显着增加，尿钙减少。在这项研究中，我们发现，虽然K-cit有效地降低了尿钙，但它也增加了尿磷酸盐和草酸盐以及尿液pH值，导致相对于CaP和CaOx固相的尿过饱和度的实际增加。尽管CaOx过饱和度增加，但对每组结石的分析发现TEM和衍射图表明所有结石均由CaP组成。K-cit降低了尿酸的过饱和度，但这种过饱和度在任何一种情况下都非常低，因此尿酸结石形成的机会很小。GHS大鼠的结石形成，在这种饮食中仅形成CaP结石，未被K-cit改变。值得注意的是，柠檬酸盐处理大鼠中CaP的较高过饱和度不会导致结石形成增加。这可能反映了由于尿柠檬酸盐浓度较高而导致的尿晶体抑制活性的增加。66有必要进行进一步的研究，以确定向喂养羟脯氨酸的GHS大鼠提供K-cit是否会影响尿过饱和或结石形成，这导致它们仅形成CaOx结石。

因此，提供K-cit会诱导尿液化学的复杂变化，有些有利于降低CaP和CaOx的过饱和度的目标。在这个CaP结石形成的模型中，柠檬酸盐在减轻结石负担方面无效。这项研究表明，应在人CaP结石形成剂中进行进一步的研究，以确定K-cit对CaP和结石形成的尿液过饱和度的影响。

简明方法

动物

GHS大鼠来自Sprague-Dawley大鼠（纽约州金斯敦的查尔斯河实验室），通过连续近交每代中钙质含量最高的后代。24–27,36–39,49本研究使用了来自第95代的八周龄雄性GHS大鼠。

实验条件

在研究开始时（第0天），将22只GHS大鼠置于代谢笼中，并喂食正常的钙饮食，13g / d（1.2%钙;Harlan-Teklad， Indianapolis， IN）。将K-cit，4 mmol / d（11只大鼠）或KCl，4 mmol / d，作为对照（11只大鼠）添加到日粮中以提供等量的阴离子柠檬酸盐和氯化物。所有大鼠都可以自由获得去离子蒸馏水。每隔6周（6，12和18周），收集每只大鼠的尿液四个24小时。对于两个收集，尿液用HCl酸化;另外两次收集尿液被收集在百里酚中。百里香酚的收集用于pH，尿酸和氯化物，HCl中的收集用于所有其他测量。18周后，所有大鼠都被安乐死并收集血液，肾脏迅速被移除。任何每天吃<10克食物或每天喝<15毫升水的动物都将被排除在进一步分析之外;然而，在整个研究期间，所有大鼠都符合预先指定的标准。罗切斯特大学动物资源委员会批准了所有程序。

尿液和血清化学成分

使用贝克曼CX5 Pro自动分析仪（贝克曼库尔特，布雷亚，加利福尼亚州）分光光度法测量尿钙，镁，磷酸盐，铵和肌酐。尿钾，氯化物和钠通过贝克曼CX5上的离子特异性电极测量。使用玻璃电极测量尿pH值，并使用Dionex ICS 2000系统（Dionex公司，加利福尼亚州桑尼维尔）通过离子色谱法测量柠檬酸盐，草酸盐和硫酸盐。在6周，12周和18周测量所有尿溶质，并计算每个时间段的平均值和总体平均值。血清钙和磷酸盐通过比色法测定（BioVision，Milpitas，CA）。通过酶免疫测定测定血清PTH以测定完整的PTH（ALPCO，Salem，NH）。我们以前使用过所有这些方法。31,45,47,48,67–69

尿液过饱和度

通过测量溶质排泄，使用计算机程序EQUIL2计算了尿液相对于CaOx，CaP和尿酸固相的过饱和度，70正如我们以前所做的那样。28,29,33,34,37,40,43,48,67–691的比率表示尿液处于平衡状态，>1表示过饱和，<1表示饱和度不足。我们发现尿液和血液以及骨培养基中计算和实验测量的饱和度之间具有出色的对应关系。31,45,47

钙化

从每只大鼠身上取出肾脏，输尿管和膀胱，冷冻，并在Faxitron柜射线照相设备（亚利桑那州图森）中成像，以确定肾结石形成和钙化的程度。三名对治疗视而不见的观察者对所有X线片进行评分，评分范围从0（无结石或钙化）到4（存在广泛结石和/或钙化）。

肾结石晶体学

从两组大鼠的肾脏中解剖结石，并嵌入EMbed 812树脂中，无需固定或脱水。在徕卡超切切片机上切割100nm厚的部分，放置在Formvar涂层网格上，并在FEI Tecnai 20 TEM（FEI Co.，Hillsboro，OR）中观察。图像和衍射图案由AMT 16000相机收集。衍射图分析是通过计算d间距与在相同条件下收集的金图来比较来完成的