急性髓系白血病患者异基因造血干细胞移植后监测DEK-NUP214融合基因的预后意义

【摘要】
目的 
探讨移植前后DEK-NUP214融合基因的动态变化及其对AML患者移植前后的临床意义。
方法 
分别采用实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）和流式细胞仪（FCM）检测2012年9月至2017年9月于北京大学人民医院接受异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）的15例初诊DEK-NUP214基因阳性的AML患者移植前后的DEK-NUP214基因表达和白血病相关免疫表型（LAIP）。
结果
中位随访时间为657天（62-2212天）。初诊DEK-NUP214的中位表达水平为488.2％（273.6-1692.1％）。13名患者在进行allo-HSCT前已完全缓解。在allo-HSCT前15例患者中有13例（86.7％）的DEK-NUP214表达阳性，中位值为0.32％（0.029-738.9％）。allo-HSCT后9名患者（69.2％）的DEK-NUP214基因保持阳性。但其表达水平在移植后一个月内降低了约500倍（5.7倍-5663倍）。移植后死亡5例（33.3％），复发2例（13.3％）。移植前DEK-NUP214阳性患者的3年累计复发率是17.5±11.3％，3年总生存期是60.5±13.8％。allo-HSCT后，DEK-NUP214阴性的患者比DEK-NUP214阳性的患者有更好的预后。
结论
RQ-PCR监测DEK-NUP214融合基因可能是一种有效且更敏感的评估allo-HSCT后MRD状态的指标。

【关键词】异基因造血干细胞移植，DEK-NUP214融合基因，微小残留病，急性髓系白血病

伴t（6; 9）（p23; q34）染色体异常的急性髓性白血病（AML）约占AML的1%，其6号染色体上的DEK基因与9号染色体上的NUP214基因之间产生融合基因[1]。Slovak等研究显示t（6; 9）（p23; q34）的AML患者的完全缓解率（CR）在儿童患者中约为71％，在成年患者中为58％，而5年生存率儿童和成人分别约为28％和9％[2]。先前研究显示仅接受化疗的伴DEK-NUP214融合基因的AML患者预后较差，异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）可能比单纯化疗具有更好的总体生存率（OS）[2,3]。微小残留病（MRD）是可以确定高复发风险的重要预后因素，而MRD指导的干预措施可以降低复发率[4,5]。白血病特异性融合基因的检测通过实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）获得的转录水平可以准确灵敏地反映MRD状态。AML的DEK-NUP214融合基因有可能成为评估MRD状态的良好标记。然而，由于伴DEK-NUP214融合基因的AML患者数量有限，该融合基因的表达水平如何随疾病进展而变化以及是否可以用作移植前后MRD的可靠标志物仍然未知。本研究旨在探讨DEK-NUP214融合基因的动态变化及其对AML患者移植前后的预后意义。  

一、研究对象与方法

1.病例：  
本研究纳入2012年9月至2017年9月在北京大学血液病研究所接受allo-HSCT治疗的15例AML患者的临床资料。使用当前广泛使用的WHO标准对患者进行诊断[6]。使用先前描述的常见形态学标准定义白血病复发[7]。    
2.移植预处理方案及移植物抗宿主病(GVHD)的预防：  
HLA同胞全合患者应用改良白消安/环磷酰胺(Bu／Cy)方案，HLA配型不合患者在改良Bu/Cy基础上加用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)[7]。所有患者均接受环孢素A+吗替麦考酚酯+短程甲氨蝶呤来预防GVHD。    
3.标本采集：  
分别于初诊、移植前、+30d、+60d、+90d、+180d，+270d，+360d采集骨髓标本，移植1年后根据患者临床情况每3～6个月进行骨髓检查。EDTA抗凝，分离骨髓单个核细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，逆转录为cDNA。    
4.FCM监测和DEK-NUP214融合基因的定量检测：  
FCM监测参照文献方法[7]。采用8色流式细胞术，FCM阳性定义为FCM检测骨髓异常髓系幼稚细胞≥0.01%。在ABI Prism7500 RQ-PCR仪（美国 ABI公司产品）上进行。反应体系10ul：上、下游引物各0.3umol/L、 TaqMan探针0.2umol/L、2xTaqMan通用PCR公共体系5ul、cDNA1ul(相当于100ng RNA)。PCR条件：50℃2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃ 15S，62℃ 1min，40个循环。内参基因为ABL。DEK-NUP214融合基因的表达水平=DEK-NUP214融合基因拷贝数/ ABL基因拷贝数×100%。    
5.定义：  
主要研究终点是白血病的累积复发率（CIR）。次要终点是无治疗生存期（TRM），总生存率（OS）和无病生存期（DFS）。复发，OS，DFS和MRD的定义如前所述[8]。一旦检测FCM阳性或RQ-PCR检测DEK-NUP214表达水平>0，就将患者定义为MRD阳性。对移植后MRD阳性患者进行的干预措施包括化疗，应用干扰素，减停免疫抑制剂和（或）供者淋巴细胞输注（DLI）等。    
6.随访：  
所有病例通过病例复查或电话进行随访，随访截至2019年5月31日，中位随访时间657(62-2212)d。观察患者移植后MRD、复发及干预措施、生存情况等。    
7.统计学分析：  
使用SPSS 23.0软件进行统计分析。使用Kaplan-Meier生存曲线分析了CIR，移植相关死亡率（TRM），DFS和OS。使用logrank检验比较组间的预后差异。P值≥0.05被认为具有统计学意义。  

二、临床研究结果

1.患者的临床特征：  
15名AML患者男8例，女7例，中位年龄33（4-57）岁。初诊DEK-NUP214的中位表达水平为488.2％（273.6–1692.1％）。移植前13名患者通过化疗达到CR。15例AML患者分别接受同胞全合移植（n=4）或单倍体移植（n=11）。所有患者均获得稳定的中性粒细胞植入。两名患者（13.3％）分别在移植后+102d和+270d复发，最终死于白血病复发。另外，有3例是治疗相关死亡（表1）。    

2.移植前DEK-NUP214融合基因的表达：  
移植前有13例患者DEK-NUP214阳性，其中位表达水平为0.38％（0.029-738.9％）。移植后13例中有9例仍DEK-NUP214阳性。另两名移植前DEK-NUP214阴性的患者在移植后未复发或死亡。Kaplan-Meier显示，DEK-NUP214阳性患者预后较差，但无统计学差异。移植前阳性患者的3年CIR为17.5±11.3％（P=0.545，图1A）。此外，移植前阳性患者的3年TRM，3年DFS和3年OS分别为24.5±12.3％，61.5±13.5％和60.5±13.8％（P=0.464，图1B；P=0.336，图1C；P=0.329，图1D）。    
3.移植后DEK-NUP214融合基因的表达：  
移植后有9（60.0％）例仍保持DEK-NUP214阳性表达。但其表达水平在移植后一个月内降低了约500（5.7-5663）倍。这9例中有2例患者存在持续DEK-NUP214阳性表达，并最终在随访期间复发。移植后2个月，1例患者死于严重的急性移植物抗宿主病，其余6例患者的DEK-NUP214基因在移植后6个月内均转为阴性。DEK-NUP214阳性组的3年CIR较高，为27.1±16.5％，DEK-NUP214阴性组中无患者复发（P=0.187，图2A）。与DEK-NUP214阴性组相比，DEK-NUP214阳性组的3年TRM趋于更高（分别为23.8±14.8％和16.7±15.2％，P=0.674，图2B）。两组之间的3年DFS和3年OS分别为55.6±16.6％和83.3±15.2（P=0.229，图2C）和53.3±17.3％vs.83.3±15.2％（P=0.245，图2D）。        
4.移植后MRD阳性患者的干预治疗及其预后：  
我们分析了移植后9例MRD阳性患者的干预治疗效果。当MRD呈阳性时，患者及时接受干扰素或DLI治疗。表2总结了移植后MRD阳性患者的干预治疗和预后。患者1在移植后的前3个月为DEK-NUP214阳性，但有其他严重并发症并在没有干预的情况下死亡。患者2和7的DEK-NUP214基因表达水平较低，未干预，最终MRD自身转为阴性。患者3在MRD阳性时放弃干预治疗，导致DEK-NUP214基因持续高表达，最终复发并死亡。患者4在移植后首次出现DEK-NUP214阳性（27.7％）时，直接进行化疗加DLI，然后MRD变为阴性。患者5在移植后的早期死于感染。患者6和8接受了干扰素治疗，MRD变为阴性。移植后DEK-NUP214融合基因持续高表达的患者9被给予DLI +干扰素治疗，但最终复发并死亡。  

三、讨论与分析

由于DEK-NUP214阳性AML患者数量有限，很少研究关注该基因的表达水平随疾病进程的变化以及是否可用作移植前后MRD的可靠标志物。带DEK-NUP214融合基因的AML是高危型白血病，患者应在首次CR后尽快接受HSCT治疗[2]，因此，本研究中的大多数患者在移植前仍处于低水平DEK-NUP214表达（<0.1％）。此外，移植后基因表达并无即刻转阴性，而是缓慢下降，至移植后3至6个月内转为阴性。表2显示，移植后DEK-NUP214表达水平低于0.1％的患者中，基因水平逐渐降低至自身转为阴性，而在复发患者中，基因表达水平持续升高直至复发或死亡。这种动态变化基本上与临床表现，肿瘤负荷和其他MRD监测指标（如LAIP）一致。表达水平高于0.1％暗示移植后高复发风险。0.1％的DEK-NUP214表达水平可能是一个阈值，但是需要更多病例进行验证。    
此外，我们结果显示DEK-NUP214可在复发前监测出阳性，且先于FCM阳性结果。Ommen HB等人的研究发现，DEK-NUP214基因可在血液学复发前约65d监测到[9]。表2和表3显示，一名复发患者的DEK-NUP214基因在白血病复发前72d转阳性，而FCM在复发前12d转阳性。另一位复发患者在白血病复发前240d检测DEK-NUP214基因和FCM均为阳性。我们的分析表明，在allo-HSCT后，通过RQ-PCR监测DEK-NUP214融合基因可能是比FCM更敏感的评估MRD状态的方法。移植后早期对MRD进行及时监测有助于指导早期临床干预以改善患者的预后。这些结果表明DEK-NUP214融合基因是灵敏且可靠的MRD检测标记。    

先前的研究表明，移植前MRD阳性可预测移植后的不良预后[10]。然而，如图1所示，移植前DEK-NUP214表达对预后的影响并不显着。这是因为，大多数患者（n=12，80.0％）在首次CR但DEK-NUP214表达尚未转阴时即进行allo-HSCT。结合我们的发现（表2），DEK-NUP214表达水平低于0.1％对预后的影响并不显着。这可能是由于DEK-NUP214融合基因在移植物抗白血病（GVL）或移植后免疫重建的作用下转阴。此外，allo-HSCT能够克服该类型AML患者移植前MRD阳性的不良反应。先前的研究表明，在首次CR时进行HSCT可能改善预后[3,11,12]。Sandahl JD等研究显示与单独化疗相比，首次CR进行HSCT改善伴DEK-NU214阳性儿童患者的5年无事件生存率（68％比18％）和总生存率（68％比54％）[11]。我们的研究发现，伴DEK-NUP214的HSCT患者的CIR，OS和DFS分别达到17.5％60.5％和61.5％。在我院，标危AML患者的总体CIR和OS分别约为15％-20％和60％-70％[7,10]。因此，这表明我院的移植体系在提高DEK-NUP214阳性AML的生存率上，具有一定的优势，也可克服移植前MRD阳性对预后的不利影响。    
AML预后与染色体和分子变化的多样性有关。我们先前的研究表明，根据MRD状况对AML患者进行移植后的抢先干预可以进一步降低复发率[14]。这种抢先干预取决于MRD监测情况，通常是通过RQ-PCR或FCM来完成[9]。因此，我们观察了DEK-NUP214移植后的动态变化是否可以指导复发干预。正如我们研究显示，在allo-HSCT后的3至6个月内，DEK-NUP214融合基因的表达缓慢转为阴性，故患者基因表达处于低水平（<0.1）时，我们没有立即进行干预。相反，我们观察移植后3到6个月的基因动态变化。如果移植后6个月内基因表达呈上升趋势或自身未转为阴性，将采取干预措施。我们研究中移植后DEK-NUP214阳性最终可转阴性的患者预后更好。    
总之，我们研究了DEK-NUP214融合基因作为进行allo-HSCT的AML患者的敏感且特异的MRD指标的可靠性。移植前后DEK-NUP214融合基因的动态变化与肿瘤负荷有关，融合基因表达水平高于0.1％暗示移植后高复发风险。此外，allo-HSCT能够克服t（6;9）对AML患者的不利影响。通过RQ-PCR监测DEK-NUP214融合基因可能是一种更敏感的评估allo-HSCT后MRD状态的方法。当然，在我们的研究中患有DEK-NUP214融合基因AML的患者数量是有限的。仍然需不断积累更多样本进行连续研究，以更清楚地证明移植前后DEK-NUP214表达的动态变化。    
注：本文来源于《临床实验室》杂志2021年第5期“分子诊断”专题