近端肾小管上皮细胞蛋白质组景观改变对草酸钙一水合物晶体反应的综合研究

Comprehensive study of altered proteomic landscape in proximal renal tubular epithelial cells in response to calcium oxalate monohydrate crystals

Wang Z, Li MX, Xu CZ, Zhang Y, Deng Q, Sun R, Hu QY, Zhang SP, Zhang JW, Liang H. Comprehensive study of altered proteomic landscape in proximal renal tubular epithelial cells in response to calcium oxalate monohydrate crystals. BMC Urol. 2020 Aug 31;20(1):136. doi: 10.1186/s12894-020-00709-z. PMID: 32867742; PMCID: PMC7461262.

近端肾小管上皮细胞蛋白质组景观改变对草酸钙一水合物晶体反应的综合研究

草酸钙一水合物（COM）是大多数肾结石的主要结晶成分，可诱导炎症浸润并损伤肾小管细胞。然而，COM诱导的毒性作用在肾小管细胞中的机制仍然模糊不清。本研究旨在研究近端肾小管细胞蛋白质组学景观响应COM晶体刺激的潜在变化。方法收集临床肾结石样本，并用结石成分分析仪进行表征。应用3个富含COM的样品治疗人近端肾小管上皮细胞HK-2。通过TMT标记的定量蛋白质组学分析筛选COM晶体处理的HK-2细胞的蛋白质组学景观。通过成对分析鉴定差异表达蛋白（DEPs）。对DEP进行基因本体（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。蛋白质相互作用网络由STRING数据库鉴定。结果TMT标记定量蛋白质组学分析数据显示，HK-2细胞中共有1141种蛋白质差异表达，其中699种上调，442种下调。KEGG的功能表征以及GO富集表明，DEPs主要参与细胞成分和细胞过程，包括肌动蛋白细胞骨架的调节，紧密连接和局灶性粘附。通过STRING分析鉴定了3个高度枢纽节点，CFL1，ACTN和MYH9。结论这些结果表明，草酸钙晶体对人近端肾小管上皮细胞的蛋白表达谱有显著影响。

背景

肾结石是一种常见疾病，在世界各地的患病率和发病率都在增加，严重影响人类健康。一般可引起尿潴留、肾盂和输尿管积水、输尿管扩张、肾功能损害和感染。在过去几十年中，肾结石的患病率在中国大陆呈显着增长趋势[1，2]。最新研究表明，中国成人肾结石的患病率为5.8%，华南地区终生患病率高达26.6%[3]。肾结石病主要累及30-50岁人群，半数患者肾结石复发[4]。肾结石严重影响患者的健康和生活质量，已成为全世界的公共卫生问题。

草酸钙一水合物（COM）占结石发病率的80%以上[5]。COM引起肾小管上皮细胞表达多种大分子[6]，因此影响草酸钙晶体的粘附、聚集和生长，在肾结石的形成中起重要作用[6，7]。研究报道，COM晶体-细胞相互作用刺激肾小管上皮细胞中NADPH氧化酶的表达，触发活性氧的大量产生，激活核因子-κB信号转导途径，释放大量炎症因子并激活炎症级联反应，与局部肾内炎症和肾损伤有关[8-11]。

近年来，肾结石形成的机制越来越受到关注。Serval研究表明，由于尿钙和草酸根离子过饱和，COM晶体沉积会引发肾结石[12]。这些沉积物可能作为结石生长的病灶，通过几个晶体结合分子或潜在的晶体受体粘附在肾小管上皮细胞的顶端表面[13]。据报道，草酸钙结石基质含有大量的蛋白质分子，这些蛋白质分子被鉴定并证明可以促进肾脏中草酸钙晶体的聚集、成核和生长，最终导致结石的形成[6，7，14-16]。CD44，OPN，MCP-1和HA是草酸钙晶体附着所依赖的最广泛研究的蛋白质[8，17]。然而，关于人肾结石发病机制的各种理论表明，草酸钙结石的形成是一个多步骤的过程，过于复杂，无法简单理解，所涉及的大量蛋白质分子仍然是未知和未被调查的。

晶体-细胞相互作用模型被广泛用于肾结石研究，以更好地了解肾结石形成的致病机制[18]。MDCK肾小管细胞（一种来源于狗肾的细胞系，表现出远端肾小管表型）和HK-2细胞（一种永生化的人肾近端肾小管上皮细胞系）是晶体-细胞相互作用模型中最常用的细胞[18]。虽然以前的几项研究已经发现了一些新的候选蛋白质，但进一步的研究是必要的，因为氯化钙二水合物和草酸钠制备的COM晶体与临床COM结石样品不同，并且使用来自不同物种肾单位的细胞可能导致不同的发现。我们使用HK-2细胞，因为它来自成人肾近端小管，这是肾脏草酸盐处理的主要部位[19]，与目前可用的动物或人类胚胎衍生细胞系相比，这是一个主要的潜在优势[20]。

在本研究中，我们旨在使用基于TMT（Tandem Mass Tag）的定量蛋白质组学分析来研究草酸钙晶体对人肾小管上皮细胞HK-2差异蛋白表达谱的影响，筛选差异表达的蛋白质分子，并初步探索它们在草酸钙结石形成中的功能作用及其引起的肾损伤。

方法

细胞培养

永生化近端肾小管上皮细胞系HK-2（人肾-2）是从Bogoo Biotechnology.Co.， Ltd.（Cat.BG005，中国上海），并用DMEM培养基培养基培养，并补充10%胎牛血清、100单位/ml青霉素钠和100μg/ml链霉素，如前所述[14]。培养物维持在37°C、5%CO2和饱和湿度下[21–23]。

COM晶体制备

本研究使用的草酸钙肾结石标本于2018年从深圳市龙华市人民医院泌尿科获得。经结石成分分析仪（LIIR-20，Lambda科学，中国天津）表征后，草酸钙肾结石用灭菌研钵充分粉碎成粉末，然后制备成COM悬浮液。简言之，用终浓度为100μg/mL（每体积培养基）的无血清DMEM悬浮晶体[14，24]，证明其不会对肾小管细胞造成严重的细胞毒性或增加细胞死亡的百分比[24]，但会诱导细胞蛋白质组的改变并反映肾上皮细胞对体内COM晶体的反应[18， [见第24、25段]。肾结石标本的使用符合医院伦理审查和患者的知情同意。

蛋白质提取和质量分析

将HK-2细胞接种到6孔板中，密度为1×105当细胞密度达到70-80%汇合时，每孔细胞分为两组（每组n = 3）。将培养基替换为含有COM晶体的培养基（具有100μg/ mL COM晶体）或无COM的培养基。细胞进一步维持24小时。用显微镜孵育后拍摄细胞照片（GMSP-5，上海广米仪器有限公司）。通过细胞刮取收获细胞样品，反复冷冻和解冻，然后在冰上超声处理2分钟;4°C后，12000g离心20分钟，收集蛋白质上清液进行BCA定量和SDS-PAGE电泳。

基于TMT的定量蛋白质组学分析

TMT（串联质量标签）技术是由美国赛默飞世尔科技开发的一种肽体外标记技术。该技术使用10个同位素标记来标记肽的氨基。经过LC-MS/MS分析，进行峰鉴定以获得峰列表，并建立参考数据库以鉴定肽和蛋白质。样品由上海迈尔比生物医药生物技术有限公司（中国上海）进行分析。根据p值的显著性筛选差异表达蛋白，对差异表达蛋白进行生物信息学研究。

GO和KEGG富集分析

GO（基因本体学，http://www.geneontology.ory/）是来自世界各地的基因相关研究成果的综合数据库。差异蛋白的显著功能富集分析可以解释差分蛋白的功能富集，并在功能水平上阐明样品组分的差异。这项研究使用Goatools进行富集分析，使用Fisher的精确测试。KEGG（京都基因和基因组百科全书）是用于了解生物系统的高级功能和实用性的数据库资源，因此我们使用KOBAS软件来测试KEGG途径中差异表达蛋白的统计富集。

差异蛋白相互作用网络分析

用于检索相互作用基因的搜索工具（STRING）数据库（http://string-db.org/）是一个提供实验和预测蛋白质相互作用信息的数据库[26]，用于构建蛋白质 - 蛋白质相互作用网络。除了挖掘包括实验数据和各种数据库在内的数据外，还从染色体邻近性，基因融合，系统发育学和基于芯片数据的基于基因的共表达等方面进行综合评分（0.4-1），从而预测蛋白质间相互作用。网络中的每个节点代表一个蛋白质分子，线代表蛋白质之间的相互作用。线越宽，分数越高，线越窄，分数越低。在这项研究中，蛋白质相互作用的临界置信度评分为≥0.4。

统计学

使用SPSS17.0软件进行统计分析。通过单向方差分析定量数据。采用等级和检验对方差不规则的进行分析。采用LSD法分析样品间差异，结果以均值±标准差表示。p <0.05时差异有统计学意义。

结果

肾结石处理HK-2细胞的制备及TMT质谱样品的质量控制

将人近端肾小管上皮细胞HK-2细胞悬浮成单细胞，接种到6孔板上过夜。加入终浓度为100μg/ ml的草酸钙结石晶体悬浮液并孵育24h。通过相差显微镜清楚地观察到粘附在HK-2细胞表面的草酸钙晶体（图11这些COM晶体紧紧地粘附在细胞表面，甚至不能通过PBS多次洗涤来去除。孵育后，通过刮擦收获细胞，并在TMT分析之前制备用于质量控制。质量控制结果显示，在122，920个鉴定谱中鉴定出24，224个蛋白质（图24，224个蛋白质）。1b）.蛋白质覆盖率分布分析显示，4137种蛋白质覆盖率超过10%（图.1c），表明样品制备成功，可以进行TMT分析。

图 1

COM-HK-2细胞制备和蛋白质样品质量控制。a. 处理HK-2细胞的草酸钙一水合物晶体及其亲本对照的代表性图片。COM晶体粘附和细胞-晶体相互作用。使用相差显微镜拍摄图像。b.质量控制的蛋白质信息。c. 蛋白质覆盖率分布质量控制

Proteome alterations of HK-2 cells after adhered by calcium oxalate crystals

The screening criteria for significant differentially expressed proteins (DEPs) were p < 0.05 and FC < 0.83 or FC > 1.20. The scatter plot of the DEPs is shown in Fig. 2a. Results showed that among the total number of 6407 target proteins, 1141 (17.8%) proteins changed significantly, of which 699 (61.3%) proteins were up-regulated (Fig. 2b), 442 (38.7%) proteins were down-regulated expression. The proteins with p > 0.05 and FC > 2 (Table 1) or FC < 0.6 (Table 2) were selected for further bioinformatics analyzation.

图 2

用草酸钙晶体处理后HK-2细胞的蛋白质组改变。a. 差异表达蛋白统计的散点图。b. 差异表达蛋白的直方图

表 1 COM刺激的HK-2细胞中上调

差异表达蛋白的聚类分析

在热图中呈现了40个选定DEP的二维分层聚类特征（图2.3).热图中的列分别表示 COM 处理的组 （n = 3） 和对照组 （n = 3）。图中的颜色表示蛋白质在样品中的相对表达，红色表示蛋白质在样品中的表达较高，绿色表示较低的表达水平。表达式量的趋势显示在颜色代码中。左边是蛋白质聚类的树状图。聚类分析表明，根据热图信号强度，所选DEPs可分为5个聚类（C1至C5）。簇1（C1）包括两种蛋白质（LZTS1，HES1），与对照组相比，COM处理组的表达水平最高。第3簇（C3）包括21种蛋白质，这些蛋白质在COM处理的组中表达更高。相比之下，簇5（C5）由15种蛋白质组成，这些蛋白质在COM处理组中减少。

Fig. 3 Heatmap and cluster analysis of differential expressed proteins. Proteins fold change (FC) > 2 or < 0.6 and p < 0.05 were enriched

GO and KEEG enrichment analyses

GO蛋白对差异蛋白的显著功能富集分析可以解释差分蛋白的功能富集，并在功能水平上阐明样品中表现出的差异。为了研究COM晶体在HK-2细胞中改变的DEP的生物学作用，进行了分类GO富集分析。根据GO的基因功能分类，所选择的DEPs主要与细胞过程、细胞部分、细胞器、结合和催化活性有关（图。4和5).对于COM晶体的响应，细胞部分（p = 0.002）和细胞过程（p = 0.009）分别是细胞组分（CC）和生物过程（BP）最显着富集的功能项。大多数候选蛋白参与细胞成分（CC），如表所示3.

图 4围棋分析。每列是一个GO项，横坐标表示GO名称和分类，列的高度表示富集率，p值由颜色表示。颜色越深，越显著。， p < 0.001;**， p < 0.01;*，第 < 页 0.05

图 5 差异表达蛋白的GO 2级分布。a. 生物过程。b. 细胞过程。c. 分子功能。结果表明，大多数差异表达的蛋白质与细胞过程，细胞部分和结合有关。

表 3

参与COM刺激的HK-2细胞的差异表达蛋白的GO术语

在HK-2细胞中检测到11种响应COM晶体的重要途径（图。6和表4），其中对肌动蛋白细胞骨架途径的调控最为显著（p= 0.0001），表明肌动蛋白细胞骨架的调控是细胞活性响应COM晶体粘附的关键部分。

图 6基格分析。每列是一条路径，横坐标表示名称和分类，列的高度表示富集率，p值由颜色表示。颜色越深，越显著。结果显示，与未处理的对照相比，COM处理的HK-2细胞有11种通路发生显著变化。， p < 0.001;**， p < 0.01;*，第 < 页 0.05

差异表达蛋白的生物相互作用

根据STRING数据库的信息，所选DEP的蛋白质相互作用网络包含8个主节点和21个连接（图2.7).得分最高的3个集线器节点包括β肌动蛋白（ACTN），Cofilin-1（CFL1）和Myosin-9（MYH9）。在这些蛋白质中，CFL1和ACTN之间的相互作用在COM处理的HK-2细胞中均呈上调，其综合得分最高，为0.999。这些蛋白质和相互作用可能在HK-2细胞中起关键作用，以响应COM晶体的粘附。

图 7

差异表达蛋白的蛋白质相互作用网络。根据STRING数据库，DEPs的蛋白质相互作用网络包含8个主节点和21个连接。网络中的每个节点代表一个蛋白质分子，线代表蛋白质之间的相互作用。线越宽，分数越高，线越窄，分数越低。得分最高的3个中心节点包括CFL1，ACTN和MYH9。CFL1和ACTN之间的相互作用表现出最高的综合得分，为0.999，表明可能在COM与HK-2细胞的粘附中起重要作用。

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讨论

肾结石是一种常见的泌尿系统疾病，发病率高，仍然是世界范围内常见的健康问题。目前，肾结石形成的机制尚不完全清楚。一种受青睐的理论认为，草酸钙诱导的肾小管上皮细胞损伤可促进草酸钙晶体的粘附和凝固，从而导致结石形成[27]。鉴于蛋白质是肾结石有机基质的主要成分，并被认为在肾脏内的细胞- 晶体相互作用和岩性发生中起调节作用[28-31]，我们选择了永生化的人近端肾小管上皮细胞HK-2暴露于COM晶体以产生细胞 - 晶体相互作用模型，并分析了HK-2细胞中响应COM粘附而改变的蛋白质组景观。

在这项研究中，我们首先通过TMT标记的定量蛋白质组学分析系统地筛选了COM-HK-2模型中的DEP特征。在1141个已鉴定的DEPs中，699个（61.3%）蛋白质上调，442个（38.7%）蛋白质下调。相比之下，Chen等人在2010年进行的一项类似的研究[32]表明，在COM晶体刺激后，在HK-2细胞中仅鉴定出12个DEPs。这种不同的观察结果可能是由于Chen等人在他们的研究中使用的方法的局限性。在这里，基于TMT的无凝胶定量蛋白质组学方法使用等压标记，并允许对蛋白质表达水平的差异进行全基因组定量[33]，被证明是分析复杂样品的更可靠和可重复的技术。

一些蛋白质已被表征为在肾结石形成中起关键作用，然而，所涉及的机制远未明确。Tamm-Horsfall蛋白（THP）被鉴定为肾脏特异性蛋白，是促进钙盐晶体聚集和结石形成的关键调节剂[34，35]，这是一种有效的免疫调节分子和泌尿系统中的疾病生物标志物[35]。骨桥蛋白（OPN）是草酸钙结石基质的另一个重要成分[29]，在防止草酸钙一水合物（COM）肾结石的形成中起重要作用，后者控制尿液中草酸钙一水合物形态的切换[36]，通过促进晶体粘附和介导氧化应激和细胞凋亡来促进结石的形成[17，37]。

在这项研究中，我们发现LZTS1（亮氨酸拉链假设的肿瘤抑制基因1）蛋白，一种全长596氨基酸蛋白，分子量为67 kD，在COM粘附的HK-2细胞中显着上调。虽然LZTS1蛋白在胃、肺、膀胱、卵巢、肾脏等各类恶性肿瘤中的作用和机制得到了很好的研究[38]，但LZTS1在肾结石病中的功能作用尚未见报道。HES1（分裂1的毛茸茸的增强子）蛋白是NOTCH信号通路的核心效应子，被认为是NOTCH信号通路激活的良好指标[39，40]，在COM粘附的HK-2细胞中表现出显着的表达降低。本研究是第一份证明HES1蛋白与肾结石形成及其相关肾损伤之间关系的报告，然而，需要进一步研究所涉及的机制。

我们的生物信息学分析表明，COM粘附的HK-2细胞的GO细胞过程，细胞部分，细胞器，结合和催化活性的方面发生了显着变化，表明这些过程或细胞结构及其相关蛋白质广泛参与肾结石的形成。KEEG分析鉴定出的富集信号通路是调节肌动蛋白细胞骨架，紧密连接和局灶粘附。其中，肌动蛋白细胞骨架的调控最为重要，它在响应细胞外信号方面起着至关重要的作用，在空间和时间上调节粘附、突出、收缩和缩回[41]。同时，我们分析了所选DEP的蛋白质相互作用网络，发现CFL1，ACTN和MYH9是3个高度的中枢节点，可能参与HK-2细胞对COM晶体粘附的病理过程。这些发现表明，COM晶体显着改变了细胞结构和细胞肌动蛋白细胞骨架动力学。

结论

我们筛选并鉴定了可能参与草酸钙肾结石形成的关键蛋白质分子，并揭示了可能的信号通路和相关疾病过程，为进一步阐明肾结石的发病机制提供了重要的潜在靶点和相互作用。然而，尽管有这些全面的生物信息学分析，目前的研究有几个局限性。HK-2细胞不是正常的近端肾小管细胞，这是本研究的一大局限性。此外，体外COM浓度不能完美地模拟肾脏中晶体的状态，不涉及COM刺激的剂量依赖性和时间依赖性效应。在我们未来的研究中，我们希望对不同时间点的正常近端管状细胞/动物模型进行额外的蛋白质组学分析，并进行实验验证，以丰富这项研究。

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