纳米草酸钙一水合物和草酸钙晶体对受损肾上皮细胞的再损伤风险：晶体粘附和聚集加重

Reinjury risk of nano-calcium oxalate monohydrate and calcium oxalate dihydrate crystals on injured renal epithelial cells: aggravation of crystal adhesion and aggregation

Gan QZ, Sun XY, Bhadja P, Yao XQ, Ouyang JM. Reinjury risk of nano-calcium oxalate monohydrate and calcium oxalate dihydrate crystals on injured renal epithelial cells: aggravation of crystal adhesion and aggregation. Int J Nanomedicine. 2016 Jun 14;11:2839-54. doi: 10.2147/IJN.S104505. PMID: 27382277; PMCID: PMC4918896.

纳米草酸钙一水合物和草酸钙晶体对受损肾上皮细胞的再损伤风险：晶体粘附和聚集加重

背景

肾上皮细胞损伤有助于晶体粘附到细胞表面，是肾结石形成的关键步骤。然而，细胞损伤对纳米草酸钙晶体粘附的影响以及纳米晶体诱导的损伤细胞的再损伤风险尚不清楚。

方法

非洲绿猴肾上皮（Vero）细胞因H而受伤2O2建立细胞损伤模型。测定细胞活力，超氧化物歧化酶（SOD）活性，丙二醛（MDA）含量，碘化丙啶染色，苏木精 - 曙红染色，活性氧产生和线粒体膜电位（Δψm），以检查粘附过程中的细胞损伤。H表面结构的变化2O2-通过原子力显微镜评估受伤的细胞。通过激光扫描共聚焦显微镜检查粘附过程中透明质酸表达的改变。通过扫描电子显微镜观察纳米草酸钙一水合物（COM）和草酸钙二水合物（COD）晶体对Vero细胞的粘附。通过电感耦合等离子体发射光谱法定量测定Nano-COM和COD结合。

结果

由于Vero细胞损伤，在伤口愈合过程中，透明质酸在细胞表面的表达增加。细胞膜的结构和功能也因细胞损伤而改变;因此，纳米晶体发生粘附。nano-COM粘附在受伤的Vero细胞上的能力高于nano-COD晶体。当纳米晶体附着在细胞表面时，细胞活力，SOD活性和Δψm降低。相比之下，MDA含量，活性氧产生和细胞死亡率增加。

结论

细胞损伤有助于晶体粘附在Vero细胞表面。附着的纳米COM和COD晶体会加重Vero细胞损伤。因此，晶体附着力和聚集性得到增强。这些发现为肾结石的形成提供了进一步的见解。

介绍

晶体形成和保留导致肾结石的发展。1晶体潴留可能是由晶体粘附在肾小管上皮细胞上引起的。2因此，当晶体与上皮细胞表面结合时，就会发生结石发育。3上皮细胞损伤诱导晶体附着在损伤部位。4,5晶体-细胞粘附也需要细胞损伤。6–8 暴露于草酸钙（CaOx）晶体可诱导肾上皮细胞的氧化应激;氧化应激发生在晶体附着到肾小管细胞的过程中。9CaOx晶体可以通过几种方法在肾上皮细胞中产生毒性;例如，晶体可以改变膜表面的组成和功能，破坏膜电位，增加脂质过氧化，促进线粒体功能障碍，诱导活性氧（ROS）的产生，并导致抗氧化机制的不平衡;10结果，肾上皮细胞受伤。受损细胞表达晶体粘附分子，如透明质酸（HA）和OPN，其促进晶体粘附和保留。 大约80%的肾结石由CaOx组成。11最常见的形式是草酸钙一水合物（COM）和草酸钙二水合物（COD）。12由于热力学不稳定的COD晶体转化为稳定的COM晶体，开发了大量COM结石。13这是一个由液体（尿液）介导的过程，但一旦结石产生就会发生，并且是一个缓慢的过程。这意味着第一个生成的晶体是COD，而不是COM晶体，尽管有这种转变，微积分可以被认为是COD微积分。事实上，这种结石的病因与COD结石完全相同。 健康人和岩石成岩患者的尿晶体在晶体大小和相位方面经常是不同的。14,15激光散射光谱表明，纳米微晶在健康尿液中的粒径分布相对均匀;相反，这种分布在成岩性尿液中是不均匀的，并且粒径从100nm广泛增加到超过1，000nm。16不均匀的纳米颗粒容易聚集;结果，可能会发生结石形成。 研究表明COM和COD与肾小管上皮细胞的粘附;然而，研究集中在微米级晶体上。17,18虽然这些微米晶体通常由纳米晶体形成，19特别是需要短停留时间才能流经肾小管的泌尿晶体，还形成了许多纳米晶体。因此，应进一步研究纳米COM和COD对肾上皮细胞的粘附，特别是受损的肾上皮细胞。在正常上皮细胞中，纳米级晶体比微米级晶体引起更严重的损伤。20我们的研究评估了nano-COM和COD粘附在受损Vero细胞上的能力差异，并提供了细胞损伤与纳米晶体粘附之间的关系。我们的结果有助于揭示与肾小管兰德尔栓相关的COM状肾结石或COD结石形成的机制。

材料和方法

材料和设备

非洲绿猴肾上皮（Vero）细胞购自上海细胞库研究所（上海，中华人民共和国）。其他材料包括Dulbecco的改性鹰培养基（HyClone，Logan，UT，USA），胎牛血清（杭州长荣生物工程材料有限公司，杭州，中华人民共和国）以及青霉素和链霉素（北京探针生物科技有限公司，北京，中华人民共和国）。细胞培养板从无锡Nest生物科技有限公司（无锡，中华人民共和国）购买。 细胞增殖检测试剂盒（细胞计数试剂盒-8 [CCK-8]）是从日本熊本的Dojindo实验室购买的。超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒和丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建城生物技术研究所（南京，中华人民共和国）。碘化丙啶（PI）、抗淬剂、苏木精-曙红（H&E）染料、2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯染料（DCFH-DA）和5，5'，6，6'-四氯-1，1'，3，3'-四乙基咪唑卡波蓝氨酸碘化物从上海碧欧泰生物科技有限公司（上海，中华人民共和国）购买。bHABP从默克公司（德国达姆施塔特）购买，荧光素异硫氰酸酯 -亲和素从武汉博斯特生物工程有限公司（武汉，中华人民共和国）购买。其他常规试剂为分析纯品，购自广州化学试剂厂（广州，中华人民共和国）。 设备包括X-L型环境扫描电子显微镜（飞利浦，埃因霍温，荷兰），D / max2400X X射线粉末衍射仪（理学公司，日本东京），激光扫描共聚焦显微镜（LSM510 META Duo Scan，Carl Zeiss Meditec AG，德国耶拿），倒置荧光显微镜（IX51，奥林巴斯公司，日本东京），流式细胞仪（FACS Aria，BD Biosciences，加利福尼亚州圣何塞，美国），酶标仪（Safire2， Tecan，Mannedorf，瑞士），电感耦合等离子体原子发射光谱仪（Optima 2000DV，PerkinElmer Inc.，Waltham，MA，USA）和原子力显微镜（AutoProbe CP，Thermomicroscopes，Veeco，Plainview，NY，USA）。

实验方法

纳米COM、COD晶体的合成与表征

根据我们之前的研究，21合成了纳米COM和COD晶体。用于合成纳米 COM、氯化钙2（300 毫摩尔/升）和 K2在水中制备Ox（300 mmol/L）溶液。将每种溶液的50mL等分试样在25°C反应温度下直接混合。用磁力搅拌器（1，250rpm）搅拌反应混合物，然后在超声下用无水乙醇洗涤两次。通过抽滤收集晶体并在干燥箱中干燥24小时。用于合成纳米COD，氯化钙2将溶液（192 mmol/L）加入缓冲溶液（pH = 6.8），然后加入K2Ox 溶液 （50 mmol/L） 在 25°C 下加入反应混合物。用磁力搅拌器（1，250rpm）搅拌反应混合物，然后在超声下用无水乙醇洗涤两次。通过抽滤收集晶体并在干燥箱中干燥24小时。采用扫描电子显微镜（SEM）和X射线粉末衍射对样品的形貌和晶相进行了表征.

细胞培养

我们实验中的非洲绿猴肾上皮（Vero）细胞是从上海细胞库研究所（上海，中华人民共和国）获得的。由于本研究没有进行体内实验，因此不需要伦理同意使用这些细胞系，正如暨南大学伦理委员会批准的那样，广州，中华人民共和国。Vero细胞在Dulbecco的Modified Eagle的Medium-F12培养基中培养，并补充了10%的胎牛血清。将细胞在5%CO的气氛中孵育2空气在37°C和饱和湿度。胰蛋白酶消化细胞后，100μL细胞悬浮液（1×105将细胞/ mL）接种在96孔板中并培养24小时。通过抽吸除去培养基，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞两次。将实验模型分为三组：a）正常对照组：仅加入无血清培养基;b）损伤对照组：将细胞暴露于含有0.3，0.5和1.0 mmol/ L H的无血清培养基中2O21小时;c）晶体处理组：用0.3，0.5和1.0 mmol / L H处理细胞2O21小时，之后通过抽吸除去培养基，用PBS洗涤两次，然后与含有nano-COM或COD的100μg/ mL无血清培养基一起孵育6小时。 我们在以下细胞实验中选择了6小时的孵育时间，因为尿液晶体在肾脏上的传输时间仅为几分钟;1这个周期太短，晶体变得足够大而被困住。晶体固定在肾小管上皮细胞表面后，游离的尿晶体可以生长并形成结石。这些粘附的晶体可以长时间固定在上皮细胞表面上，甚至可以长到足以阻断肾小管。本研究中6小时的治疗时间与以前关于肾结石的研究中描述的时间一致。22,23 我们选择了H的浓度2O2和晶体基于以下原因。常用的 H2O2诱导细胞损伤的浓度范围为10至1，000 μmol/L。24,25我们还在预实验中设置了一系列晶体浓度（50，100，200和400μg/ mL）;在这些浓度中，100μg/ mL产生中等结果。该浓度不会诱发严重的细胞损伤或轻微的细胞损伤;这种状态可以很容易地在粘附行为和再损伤能力的差异方面进行比较。几项研究中使用的CaOx浓度也是100μg/ mL，这是常用剂量。

细胞活力、SOD 活性和 MDA 含量检测

100μL细胞悬浮液（1×105将cells / mL）每孔接种在96孔板中，并在含有10%胎牛血清的Dulbective Eagle培养基培养基中孵育24小时。之后，根据“细胞培养”部分将细胞分为三组，然后使用CCK-8测试方法进行细胞活力测定。同时，分别使用SOD和MDA试剂盒测量SOD活性和MDA含量。 PI 

染色

PI染色测定根据“细胞培养”部分对每组的细胞进行。处理时间后，通过抽吸除去上清液并用PBS洗涤细胞三次，然后加入5μLPI染色溶液并将细胞在4°C下孵育20-30分钟。再次用PBS洗涤细胞三次，然后在荧光显微镜下观察死细胞。 PI定量分析：将100μL细胞悬浮液接种在96孔板中，浓度为1×105使用酶标仪根据先前的操作直接测量细胞/ mL，PI荧光强度。

H&E 染色

1 mL细胞悬液量（1×105细胞/ mL）每孔接种在12孔板中，并按照“细胞培养”部分中讨论的分组。处理时间后，通过抽吸除去上清液并用PBS洗涤三次。之后，用4%多聚甲醛在室温下固定细胞15分钟。用PBS洗涤细胞三次。固定后，用苏木精染色细胞并孵育15分钟。然后用蒸馏水洗涤细胞2分钟以除去多余的污渍。之后，用曙红染色液对细胞进行染色5分钟。将细胞用蒸馏水洗涤2分钟以除去多余的曙红。处理后，在显微镜下观察细胞，细胞核被染成紫色或蓝色，细胞质被染成粉红色或红色。

原子力显微镜分析

1 mL细胞悬浮液的量，细胞密度为1×105将细胞/ mL每孔接种在12孔板中。之后，用0，0.3和1.0 mmol / L H处理细胞2O2并孵育1小时。然后，利用原子力显微镜（AFM）观察细胞形态和细胞表面结构变化。AFM在软件IP 2.1下自动获得细胞表面粗糙度、平均高度和颗粒尺寸在细胞表面的分布。（Thermomicroscopes， Veeco， Plainview， NY， USA）核区域的扫描范围为5×5 μm。细胞表面颗粒的直方图也是通过AFM自动获得的。通过以下方程获得细胞表面的均方根粗糙度和平均粗糙度：  Rq:root-mean-square roughness,Rq=∑n=1N(Zn−Z¯¯¯)2N−1−−−−−−−−⎷ (1) 其中 N 表示指定区域内数据点的总数， Zn 是第 n个点的高度，  Z 是平均高度。

ROS 生成

根据我们之前的研究，测量了每组的ROS产量。19简而言之，2 mL细胞悬浮液，细胞浓度为1×105在六孔板中每孔接种细胞/ mL。同步后，根据“细胞培养”部分将细胞分为三组。通过在微量离心管中加入500mL PBS来重悬细胞。然后用2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯染色样品。在荧光显微镜下观察ROS分布;用酶标仪定量检测细胞内ROS的荧光强度。

线粒体膜电位的测量 （Δψm）

浓度为1×10的细胞悬浮液（2 mL）5将细胞/ mL在六孔板中每孔接种24小时。同步后，根据“细胞培养”部分将细胞分为三组。在浓度为100μg/ mL的纳米COD和COM晶体孵育6小时后，吸出上清液，用PBS洗涤细胞两次并用0.25%胰蛋白酶消化。通过移液将细胞悬浮，然后离心（1，000rpm，5分钟）。抽取上清液，用PBS洗涤细胞并再次离心以获得细胞沉淀。通过在微量离心管中加入并彻底混合500μLPBS来重悬细胞。最后，对样品进行5，5'，6，6'-四氯-1，1'，3，3'-四乙基咪唑菁碘化物染色，然后用流式细胞仪定量检测。

透明质酸 （HA） 检测

如前所述，在介质中分析HA检测。28简而言之，1 mL细胞悬浮液，细胞浓度为1×105在12孔板中每孔接种细胞/ mL。同步后，对单元格进行分组;0.3、0.5 和 1.0 毫摩尔/升 H2O2用于破坏Vero细胞。然后将100μg/ mL纳米COM或COD晶体添加到受损细胞中。孵育6小时后，吸出上清液，用PBS洗涤细胞两次。之后，用固定剂（由5%冰醋酸，10%福尔马林和70%乙醇组成）固定细胞，并用PBS洗涤三次。然后将100μL的5mg / mL bHABP溶液加入细胞中并在4°C下孵育过夜。用PBS洗涤三次后，将100μL荧光素异硫氰酸酯 - 亲和素加入细胞中，孵育1小时。将制备的样品用防褪色荧光安装介质进行安装，并使用共聚焦显微镜进行观察。 定量分析：使用Axiovision软件（Carl Zeiss Meditec AG）分析HA荧光强度。对每组100个细胞中的HA表达进行定量检测。

晶体对细胞表面附着力的扫描电镜观察

根据“细胞培养”部分对细胞进行分组;用100μg/mL纳米COM和COD晶体孵育6小时后，抽吸除去上清液，用PBS洗涤细胞3次，在2.5%戊二醛中4°C下固定24小时，然后用1%OsO固定4，用PBS再次洗涤三次，在梯度乙醇（分别为30%，50%，70%，90%和100%）中脱水，在CO临界点下干燥2，用金溅射处理，最后在SEM下观察到。

晶体附着力的定量测定

1 mL细胞悬浮液的量，细胞浓度为1×105将细胞/ mL接种在12孔板中每孔并孵育12小时。根据“细胞培养”部分对细胞进行分组。孵育6小时后，吸出上清液，并用PBS洗涤细胞三次以除去未结合的晶体。然后将样品转移到25 mL烧杯中，并与4.0 mL浓缩HNO混合3和 1.0 mL 盐酸4消化溶液。一个单独的 HClO4溶液加热直至冒烟;剩余的热量用于干燥溶液。冷却后，3 mL 2% HNO3已添加。电感耦合等离子体原子发射光谱仪测量Ca的浓度2+离子，然后将其转化以确定晶体的粘附量。对照组使用相同的方法治疗以确定细胞内Ca的干扰2+在维罗细胞中。

统计分析 

实验数据表示为均值±标准差。使用SPSS 13.0软件（SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）对实验结果进行了统计分析。 转到(G)：

结果

纳米COM和COD的表征

大约100nm的COM和COD晶体是根据我们以前的研究制备的。21通过SEM和X射线粉末衍射检测其形貌特征，晶粒尺寸和晶相;所有制备的晶体均被确认为目标产品（ 图 1 ).制备的晶体呈现出近乎球形的形态，并带有一些不规则性。通过X射线粉末衍射检测晶相。制备的样品为纯相COM或COD晶体，未观察到其他不纯衍射峰。

图 1 纳米COM和COD晶体的表征。 笔记：纳米COM和COD晶体的SEM图像（A，B）和XRD光谱（C，D）。（一、丙）COM晶体;（乙、德）鳕鱼晶体。比例尺：200 nm。 缩写：扫描电镜，扫描电子显微镜;X射线，X射线粉末衍射;COM，草酸钙一水合物;COD，草酸钙二水合物;au，任意单位。

细胞活力、SOD 活性和 MDA 含量的变化

H处理后Vero细胞氧化应激的程度2O2并用纳米COM和COD晶体进一步处理适用于 图2 .细胞活力下降（ 图 2A ）和抗氧化活性（SOD; 图 2B ），以及增加的脂质过氧化产物（MDA含量; 图2C ），反映氧化应激和细胞损伤。当Vero细胞用H处理时2O2，细胞活力和SOD活性降低，而MDA含量增加。此外，c（H）2O2） 范围为 0–1.0 mmol/L，对所有参数均表现出浓度依赖性影响。Nano-COM或COD晶体加重了细胞损伤，从而进一步降低了细胞活力和SOD活性，同时增加了MDA含量。在相同条件下，nano-COM对细胞的损伤效果比nano-COD更强。  

图2 细胞活力、SOD 活性和 MDA 含量检测。 笔记：暴露于100μg/ mL纳米COM或COD晶体6小时后受损Vero细胞的细胞活力（A），SOD活性（B）和MDA含量（C）的变化。受伤的Vero细胞是通过不同浓度的H获得的2O2治疗（0毫摩尔/升，0.3毫摩尔/升，0.5毫摩尔/升，1.0毫摩尔/升）。数据表示为三个独立实验的平均±标准偏差。 缩写：COM，草酸钙一水合物;COD，草酸钙二水合物;SOD，超氧化物歧化酶;MDA，丙二醛。

通过PI染色检测细胞死亡

在不同损伤水平下以及与nano-COM和COD相互作用6小时后，Vero细胞PI染色结果显示在 图 3A 和 B .当 c（H）2O2）从0.3 mmol/L增加到0.5 mmol/L和1.0 mmol/L，PI染色细胞核的数量和相对荧光强度（ 图 3B ）在对照组中，nano-COM和nano-COD组均逐渐增加，从而表明整体细胞死亡率逐渐增加。29Nano-COM和COD晶体会使受伤的Vero细胞再次受损，这进一步增加了PI染色细胞核的数量。PI染色的细胞核更多，纳米COM组的相对荧光强度比纳米COD组强（ 图 3B ），从而表明纳米COM晶体比纳米COD晶体诱导更高的细胞死亡。

图 3 暴露于纳米COM和COD晶体后受伤的Vero细胞的PI染色检测。 笔记：在暴露于100μg/ mL纳米COM或COD晶体6小时后，通过荧光显微镜（A）检测PI染色和通过酶标仪（B）检测受损的Vero细胞的相对荧光强度。受伤的Vero细胞是通过不同浓度的H获得的2O2治疗（0，0.3，0.5，1.0毫摩尔/升）。数据表示为三个独立实验的平均±标准偏差。放大倍率：×600。 缩写：COM，草酸钙一水合物;COD，草酸钙二水合物;PI，碘化丙啶。

通过H&E染色进行细胞形态学观察

为了观察Vero细胞的损伤，用H&E染色细胞，这证明了细胞的整体形态。苏木精是一种碱性染料，用蓝紫色染色质染色质。而曙红是一种酸性染料，可染色细胞质红色或粉红色。30,31 随着 H 的增加2O2浓度，细胞损伤程度增加，这主要表现为细胞数量减少和细胞形态紊乱（ 图 4 ).纳米COM和COD处理组的细胞数量少于对照组的细胞数，对照组仅用H处理2O2.晶体处理组的细胞核缩小并染成蓝黑色。同时，细胞被松散地排列，细胞间连接被进一步破坏。用0.5毫摩尔/升和1.0毫摩尔/升H处理后2O2纳米COM治疗组细胞的形态障碍异常明显。

图 4 通过H&E染色损伤的Vero细胞在暴露于100μg/ mL nano-COM或COD晶体6小时后进行形态学观察。 笔记：细胞核被染成蓝色或紫色，细胞质是粉红色或红色。H 的受伤时间2O2：1小时;放大倍率：×400。 缩写：COM，草酸钙一水合物;COD，草酸钙二水合物;H&E，苏木精-曙红。

细胞形态和细胞膜表面结构的AFM检测

细胞膜是阻止细胞外物质自由进入细胞的屏障。细胞损伤后，细胞膜的组成和性质发生变化。因此，我们研究了用0.3 mmol / L和1.0 mmol / L H处理的正常和受损Vero细胞表面结构的变化2O2作者：AFM （ 图 5 ).这种方法确定表面粗糙度，细胞的平均高度，细胞表面的颗粒大小（ 表 1 ），以及细胞表面的超微结构（ 图 5 ). 

图 5 AFM检测细胞形态和细胞膜表面结构。 笔记：Vero细胞（A-C）的AFM图像以及细胞损伤前后细胞表面颗粒的大小分布（D-F）。（A， D）正常细胞;（B，D）用0.3毫摩尔/升H处理的细胞2O2; (C，F）用1.0毫摩尔/升H处理的细胞2O2.（A-C）中的缩略图是相应细胞的细胞核区域。扫描范围为5×5 μm。 缩写：原子力显微镜，原子力显微镜。

表 1

不同损伤程度维罗细胞参数的比较 电池片类型 c（H2O2） （毫摩尔/升） 均方根粗糙度Rq（海里） 平均粗糙度R一个（海里） 平均高度 z（nm） 细胞表面的粒径（纳米）

在单独的窗口中打开 笔记： Rq：均方根粗糙度，    Rq; R一个：平均粗糙度，    Ra，其中 表示指定区域内数据点的总数，Zn是第 n个点的高度，    Z 是平均高度。Rq,R一个由配备IP 2.1软件的原子力显微镜直接产生，10 Rq,R一个作为统计的基本参数，以反映细胞表面的粗糙度。细胞表面越粗糙，值越大R一个和Rq.对核区域范围的扫描为5×5μm。 正常Vero细胞的表面光滑（ 图 5A ），粗糙度较低（11.3纳米）;细胞周边无突起，细胞表面粒径~20-80nm（ 图 5B ).当用0.3毫摩尔/升H处理细胞时2O2，细胞表面粗糙度增加到39.3nm并变得更加复杂（ 图5C );粒径分布在50-250 nm处。因此，细胞表面分泌更多的蛋白质，脂肪，糖和其他物质，颗粒物覆盖表面。32此外，细胞开始萎缩;单元格边缘显示为碎片 图5C ，并且细胞的平均高度增加到166.1nm（ 图 5D ).当Vero细胞用1.0毫摩尔/升H处理时2O2，细胞收缩率增加（ 图 5E ).同样，细胞表面粗糙度增加到73.36 nm，粒径增加到~200-500 nm（ 图 5F ).因此，当Vero细胞受到严重损伤时，细胞表面蛋白质，脂肪，糖和其他物质的量增加。

细胞损伤后细胞内ROS的产生

ROS可与细胞大分子迅速反应，从而损害正常细胞功能，最终导致细胞死亡;细胞损伤过程中的氧化可以促进CaOx晶体在肾脏中的沉积。33用2'，7'-二氯荧光素二乙酸荧光探针测量COD和COM晶体产生的ROS。与对照组相比，H2O2COM或COD纳米晶体可以刺激细胞产生ROS（ 图 6A 和 B ).较高的 c（H2O2）从细胞内ROS产生更强的绿色荧光强度。加入纳米COD和COM晶体后，细胞内ROS的荧光强度进一步增强。COM处理组的荧光强度略高于COD处理的组（ 图 6B ），这表明COM产生更高的细胞毒性并产生更多的ROS。

图 6 暴露于100μg/ mL纳米COM或COD晶体6小时后受伤的Vero细胞的ROS水平。 笔记：在荧光显微镜下观察到ROS分布（A）;用酶标仪（B）定量检测细胞内ROS的荧光强度。H 的受伤时间2O2：1小时;晶体浓度：200微克/毫升;比例尺：50 μm;放大倍率：×400。 缩写：COM，草酸钙一水合物;COD，草酸钙二水合物;ROS，活性氧。

纳米COM和COD引起的线粒体膜电位降低

细胞凋亡和坏死之前通常有线粒体功能障碍，特别是线粒体膜电位（Δψm）的丧失。5，5'，6，6'-四氯-1，1'，3，3'-四乙基咪唑菁碘化物通过形成分别发出橙红光或绿光的J-聚集体或单体，以高Δψm差分标记线粒体。34 我们用线粒体膜电位测定试剂盒（ 图 7 ).与对照组相比，H2O2纳米COM或COD晶体导致Δψm降低。较高的 H2O2浓度导致Vero细胞中Δψm降低。添加纳米COD和COM晶体后，Δψm的降低程度进一步增强。COM治疗组Δψm的降低略高于COD处理组，表明COM产生更高的细胞毒性并引起更多的线粒体功能障碍。

图 7 纳米COM或COD暴露对H损伤Vero细胞线粒体膜电位（Δψm）的影响2O2. 注：（A）与纳米COM或COD孵育后Δψm的点图;（二）Δψm的定量直方图。H 的受伤时间2O2：1小时;晶体浓度：100微克/毫升。 缩写：COM，草酸钙一水合物;COD，草酸钙二水合物;JC-1， 5，5'，6，6'-四氯-1，1'，3，3'-四乙基咪唑菁碘化物。

受损细胞表面的透明质酸 （HA） 表达

HA作为晶体粘附分子，在细胞损伤后表达。因此，HA表达可以间接反映受损细胞的状况。35因此，我们研究了细胞损伤后由改变的HA表达介导的晶体粘附。 如 图 8 ，在不同的损伤水平下用nano-COM和COD处理6小时，以浓度依赖性的方式增加了细胞表面的HA表达（绿色），如共聚焦显微镜下所见。随着 c（H） 的增加2O2），绿色荧光逐渐增强，表明HA表达逐渐增加。与纳米COD晶体相比，nano-COM晶体引起的绿色荧光强度明显更强。因此，纳米COM诱导了较高的HA表达，并且细胞损伤程度较高。

图 8 暴露于100μg/ mL纳米COM或COD晶体6小时后受损Vero细胞的HA表达。 注：（A）通过激光共聚焦显微镜观察HA表达和（B）定量荧光强度直方图。晶体浓度：100微克/毫升;H 的受伤时间2O2：1小时。比例尺：20 μm。放大倍率：×10，000。 缩写：COM，草酸钙一水合物;COD，草酸钙二水合物;HA，透明质酸。

晶体结合的扫描电镜

扫描电镜显微照片 图 9 和 10 分别显示用nano-COM和COD晶体孵育6小时后Vero细胞损伤程度不同。结果表明，随着Vero损伤程度的增加，细胞表面的晶体结合逐渐增加。当细胞被0.5毫摩尔/升和1.0毫摩尔/升H损伤时2O2，整个细胞表面几乎被晶体覆盖。在暴露于纳米晶体6小时后，在相同条件下，纳米COM晶体可以比纳米COD更容易与Vero细胞结合。我们的结果还表明，受伤的细胞具有促进晶体聚集的能力。随着细胞损伤程度的增加，粘附晶体的聚集性也随之增加，尤其是纳米COM晶体。

图 9 纳米COM晶体对H的粘附的扫描电镜观察2O2-处理过的维罗细胞表面。 笔记：Vero细胞用（A）0毫摩尔/升（B）0.3毫摩尔/升（C）0.5毫摩尔/升，或（D）1.0毫摩尔/升H处理2O21小时，然后与100μg/ mL纳米COM一起孵育6小时。比例尺：5 μm。 缩写：COM，草酸钙一水合物;扫描电镜，扫描电子显微镜。

图 10 纳米COD晶体与H的粘附的SEM观察2O2-处理过的维罗细胞表面。 笔记：Vero细胞用（A）0毫摩尔/升（B）0.3毫摩尔/升（C）0.5毫摩尔/升，或（D）1.0毫摩尔/升H处理2O21小时，然后与100μg/ mL纳米COD一起孵育6小时。比例尺：5 μm。 缩写：COD，草酸钙二水合物;扫描电镜，扫描电子显微镜。

通过电感耦合等离子体发射光谱法定量测定晶体结合

通过电感耦合等离子体发射光谱法定量测定每组电池表面条件下的晶体粘附量，如下所示 图 11 .用不同浓度的H处理2O2增加了Vero细胞损伤的程度，增加了粘附在细胞表面的nano-COM和COD晶体的数量。粘附量与H引起的损伤程度呈正相关2O2.在相同条件下，纳米COM晶体的晶体附着力大于纳米COD。

图 11 纳米COM、COD晶体对H的附着力2O2-经处理的Vero电池通过电感耦合等离子体发射光谱法测定。 笔记：晶体浓度：100微克/毫升;受伤时间：1小时;附着时间：6小时。 缩写：COM，草酸钙一水合物;COD，草酸钙二水合物。 转到(G)：

讨论

本研究表明，纳米CaOx晶体诱导肾上皮细胞氧化损伤。这种损伤可能导致CaOx晶体粘附和肾结石的发展。在这项研究中，我们使用了H2O2-诱导维罗细胞的氧化损伤模型。 H2O2是一种重要的ROS，因为它在几个组织中大量产生;在炎症部位检测到高水平的氧化剂。36H2O2引起肾上皮细胞的各种变化，如自由基生成增加，脂质过氧化增加，细胞抗氧化状态降低，从而诱导细胞损伤和最终细胞死亡。37,38H2O2可能通过与过渡金属反应引起氧化应激，从而破坏细胞成分，如蛋白质，脂质和DNA，并导致细胞死亡。39H的毒性作用2O2有人认为羟基自由基是通过羟基自由基发生的，羟基自由基是由芬顿或哈伯-韦斯反应产生的。这些自由基似乎通过过氧化反应诱导细胞膜完整性和功能的变化。40,41 当用不同浓度的H处理Vero细胞时2O2在这项研究中，细胞活力（ 图 2A 和 3 ），SOD活性（ 图 2B ），细胞内Δψm降低，而MDA含量同时增加（ 图2C ） 浓度为 H2O2，从而指示 H2O2抗氧化能力下降，脂质过氧化增加，并损害细胞。脂质过氧化代表自由基的氧化损伤，导致细胞膜结构改变（ 表 1 ),40这已被AFM分析的结果证明（ 图 5 ).H2O2可通过脂质过氧化引起膜病变，促进几种氨基酸的改变，并导致酶失活。42几种抗氧化酶如SOD，GPx和过氧化氢酶限制了细胞损伤的程度;然而，暴露于高浓度的H2O2可以产生ROS（ 图 6 ），这会降低抗氧化酶活性，导致细胞损伤。 COM是在大多数CaOx肾结石中最常观察到的主要结晶成分;其晶体已被证明由于氧化应激而对肾小管上皮细胞产生毒性作用。以前的研究报告了COM在近端小管细胞中的细胞毒性作用，14人肾上皮HK-2细胞，43,44犬远端肾小管MDCK细胞，45,46和LLC-PK1细胞。8COM晶体可以改变膜结构和功能，激活ROS，引起氧化剂/抗氧化剂失衡，导致线粒体功能障碍，增加脂质过氧化，19诱导肾上皮细胞凋亡或坏死细胞死亡。9,47–49COD是CaOx肾结石的第二常见成分，尽管目前关于COD晶体对肾上皮细胞毒性作用的研究不足。我们之前的研究表明，与微粒尺寸晶体相比，纳米COD对Vero细胞的毒性更高。纳米COD晶体还增加了LDH的释放，ROS水平，细胞凋亡速率和粘附分子的表达。28因此，肾上皮细胞损伤发生在CaOx晶体粘附期间。9 细胞活力（ 图 2A ），SOD活性（ 图 2B ），MDA内容（ 图2C ），PI染色（ 图 3A 和 B ）和细胞内Δψm（ 图 7 ）证明纳米COM和COD晶体通过产生氧化应激损伤了Vero细胞。在晶体和Vero细胞之间的相互作用过程中自由基的产生已经通过ROS产生（ 图 6A 和 B ).当细胞暴露于更大量的纳米COM和COD晶体时，ROS的产生更高。纳米级晶体比较大的晶体具有更大的比表面积和更多的活性位点;21这些活性位点可以捕获氧分子并产生超氧自由基，从而破坏抗氧化系统并增强Vero细胞中的脂质过氧化。50H&E染色表明，当用纳米CaOx晶体处理细胞时，细胞间接触出现拉伸并且细胞间空间变宽，而与正常对照组相比，细胞数量减少（ 图 4 ).因此，纳米CaOx晶体会损伤肾上皮细胞。Nano-COM和COD可以被Vero细胞内化，因为它们的尺寸很小。内化的纳米晶体可以直接影响线粒体，从而扰乱代谢平衡，导致线粒体膜去极化和Δψm降低（ 图 7 ).此外，HA表达随着纳米COM和COD晶体（ 图 8 ).伤口愈合过程中细胞表面的HA表达也间接反映了细胞损伤的程度。35纳米COM晶体诱导的细胞损伤和细胞死亡高于纳米COD晶体，因为纳米COM引起的ROS产生量高于纳米COD。 一些研究人员报告说，肾小管细胞损伤与晶体 - 细胞相互作用过程有关。CaOx晶体可引起细胞损伤并改变细胞组成，从而影响晶体粘附。另一方面，另一项研究表明，当肾上皮细胞被任何其他形式的损伤损伤时，晶体的粘附增加。51 我们的研究结果确定了细胞损伤后纳米晶体附着在Vero细胞上的两个明显原因。首先，由于细胞损伤，粘附分子在细胞表面的表达有利于晶体附着。当Vero细胞被不同浓度的H损伤时2O2，细胞分泌的透明质酸（ 图 8 ）修复上皮伤口。52受损的肾小管上皮细胞对HA的表达最有可能旨在恢复肾功能;然而，HA含有羧基和大量负电荷，从而将非晶体结合的上皮变成晶体结合位点。47这些趋势可能归因于损伤程度随着c（H）的增加而增加的事实2O2），从而导致COM和COD晶体在电池表面的粘附（ 图 9 和 10 ).此外，粘附的晶体不断增加晶体随后附着的活性位点。因此，粘附在细胞表面的晶体数量逐渐增加（ 图 10 ).这种趋势显着增加了形成肾结石的风险。晶体对Vero细胞表面的粘附在SEM显微照片中说明（ 图 9 和 10 ).之前的一项研究还表明，损伤的机制增加了损伤后和伤口修复过程中晶体的粘附。51另一项实验表明，当细胞受伤和/或在损伤后的再生过程中，晶体结合位点暴露在细胞表面。53 二、AFM观察显示，维罗细胞损伤H2O2导致细胞膜破裂并释放细胞内有机物（ 图 5 ），从而增加细胞表面的晶体结合位点。这些位点可以与CaOx晶体形成离子键，氢键或静电力，从而促进晶体粘附。附着的晶体引起进一步的膜损伤，从而增加了CaOx晶体的结合。AFM结果提供细胞表面的表面粗糙度，平均高度和粒径;这些参数可以解释H后细胞膜的结构变化。2O2治疗（ 表 1 ).正常细胞的细胞表面相对光滑，粘附力低。相比之下，在用H处理的Vero细胞中2O2，细胞表面被细胞膜超微结构（ 图 5B 和 C ).此外，分泌的细胞内有机物质增加了细胞表面的粒径（ 图 5E 和 F ).同时，这些分泌的分子增加了粘附力并允许晶体 - 细胞粘附。先前对AFM的研究已经证实，肾细胞表面介导了COM晶体特定面的粘附力。54对COD晶体附着力的SEM观察也产生了类似的结果。55顶端细胞表面的贴壁晶体可以作为更多晶体聚集的位点。56 此外，H诱导的细胞损伤2O2CaOx晶体可以破坏细胞膜的紧密连接和极性，其将基底外侧或紧密连接区域组分转移到细胞的顶端表面。53,57这些成分，如磷脂酰丝氨酸，53和 Na/K-ATP 酶-α1 蛋白，++57含有对CaOx晶体具有高亲和力的酸性基团，特别是对于COM。因此，这些分子暴露在膜表面上有助于晶体粘附到受损细胞上。先前的一项研究表明，损伤细胞诱导膜脂质不对称的丧失，这也导致磷脂酰丝氨酸暴露在细胞表面，从而促进晶体附着。58 我们的研究结果认识到，nano-COM对细胞表面的附着程度大于nano-COD（ 图 11 ).COM晶体表面具有比COD更高的正电荷密度;59因此，受损细胞表面带负电荷的分子与COM的相互作用比COD更强。因此，电荷可以介导COM晶体对细胞的粘附力升高。之前的一项研究还表明，COM对肾小管细胞表面的亲和力可能高于COD。60此外，毒性结果证实，与COD相比，纳米COM晶体对Vero细胞的损伤作用更高，增加了纳米COM（ 图 9 ).Wesson等人的一项研究支持了我们的结果;61他们的小组证实，与COD相比，COM培养物对肾小管细胞的粘附率更高。

结论

我们的研究表明，Vero细胞损伤增强了晶体结合分子HA的细胞表面表达，并改变了细胞膜的结构和功能。这些机制促进了纳米CaOx晶体对细胞表面的附着。附着的纳米COM和COD晶体对上皮细胞产生毒性作用。同时，附着的晶体进一步损害了受伤的Vero细胞。因此，晶体粘附和聚集加剧。该研究比较了不同程度的纳米晶体粘附与肾上皮细胞不同程度的损伤，以揭示健康受试者和肾创伤患者肾结石的不同发病率。