还在做m6A？一起来看看m5C和m1A吧！

导语

m6A/m5C/m1A调节基因在肝细胞癌（HCC）中的预后和在免疫微环境中发挥的功能仍然未知。 

背景介绍 以前发表的  文章  通常只是探究m6A相关基因的预后或使用m6A相关基因构建风险模型，今天小编为大家介绍一  篇使用m6A/m5C/m1A三种甲基化修饰共同确定的风险模型。本章也是成功发表在8分+的  FII，题目为  The m6A/m5C/m1A Regulated Gene   Signature Predicts the Prognosis and Correlates With the Immune Status of Hepatocellular Carcinoma。  

  数据介绍 来自TCGA的公共数据。     分析流程

结果解析 01   m6A/m1A/m5C调控基因的表达水平  

作者首先从文献中鉴定了45个m6A/m5C/m1A调节基因。与正常肝组织相比，在肝细胞癌组织中观察到m6A/m1A/m5C调节基因的表达水平存在差异。在HCC组织中，41个（91.11%）m6A/m1A/m5C调节基因具有统计学意义。IGF2BP1，IGF2BP3，IGF2BP2，DNMT3B，DNMT3A，DNMT1，NSUN7，NSUN5，ALYREF，METTL3，TRMT6和TRMT61A在HCC组织中相对于正常组织过表达（图1）。

图1

02   m6A/m1A/m5C调控基因的功能富集   GO注释表明，m6A/m1A/m5C调控基因参与RNA修饰和甲基化、大分子甲基化、mRNA甲基化和修饰、RNA调控和mRNA稳定性、ncRNA加工、mRNA分解代谢过程调控、RNA剪接、mRNA分解代谢过程、mRNA转运等过程 。KEGG富集涉及癌症，剪接体和RNA转运中的microRNA。 03   主成成分分析  

根据45个m6A/m1A/m5C调控基因的表达数据，以2为最佳k值，将374例肝细胞癌患者分为1组和2组（图2A–C）。PCA显示1组和2组之间存在显著差异（图2D）。K-M生存分析表明，1类患者的OS明显优于2类患者（图2E）。此外，两组组的HCC患者在临床分期，T期，肿瘤分级和fustat状态方面存在统计学显著差异（图2F）。

图2

04   不同亚组差异表达基因的功能富集   与1组相比，2组肿瘤组织显示出371个分组相关的差异表达基因 ，包括315个上调基因和56个下调基因。GO富集显示 m6A/m1A/m5C调节基因亚组参与信号释放，神经递质转运，药物分解代谢过程，蛋白质分泌的正向调节，分泌调节，钙离子调节的胞吐作用，激素转运，蛋白质分泌的调节（图3A-C ）。KEGG富集显示其参与胆汁分泌，神经活性配体 - 受体相互作用， 和PPAR信号通路。

图3

  05   亚组差异表达基因的预后   单因素Cox回归分析显示，127个差异表达基因与HCC患者预后不良相关（P<0.05），37个差异表达基因与HCC患者预后不良相关（P<0.001）。 图3E-F 显示了这37个差异表达基因在HCC组织中的表达水平。 06   基于37个差异表达基因进行聚类和预后  

37个与亚组相关的差异表达基因将374名HCC患者分为1组和2组（图4A-C）。PCA显示1组和2组之间存在显著差异（图4D）。K-M生存分析显示，1组HCC患者的OS明显优于2类患者（图4E）。在1类和2类的HCC患者在临床分期、T期和fustat状态方面存在统计学上显著差异（图4F）。

图4

07   构建m6A/m1A/m5C风险模型  

单因素Cox回归分析显示，YBX1、TRMT6、RRP8、YTHDF2、LRPPRC、NSUN4、YTHDF1、TRMT10C、IGF2BP3、METTL3、DNMT3A、DNMT1、NOP2、TRMT61B、RBM15B、KIAA1429、ALYREF、HNRNPA2B1、TRMT61A、ALKBH1、HNRNPC、RBMX、DNMT3B、BMT2、WTAP、NSUN3、TRDMT1、NSUN2、NSUN5、ZC3H13、IGF2BP1、YTHDC1和IGF2BP2是HCC患者预后的不良影响因素（图5A)。

图5

采用LASSO算法确定最小λ值，基于9个m6A/m1A/m5C调控基因构建风险模型特征（图5B-C）。图5D显示了高危组和低危组YBX1，ZC3H13，YTHDF1，TRMT10C，YTHDF2，RRP8，TRMT6，LRPPRC和IGF2BP3表达水平之间的关系。这9个基因表达水平与风险评分之间显著相关。

作者调查了HCC患者的风险评分与生存时间之间的关系。在基于YBX1、ZC3H13、YTHDF1、TRMT10C、YTHDF2、RRP8、TRMT6、LRPPRC和IGF2BP3表达水平的风险模型中，K-M生存分析显示高危组HCC患者的预后较差（图5F）。此外，作者收集的HCC组织显示出YBX1，ZC3H13，YTHDF1，TRMT10C，YTHDF2，RRP8，TRMT6，LRPPRC和IGF2BP3显著高表达（图6），与TCGA数据库中的基因表达结果基本一致。

因此，最终构建了包含m6A/m1A/m5C调节基因YBX1，ZC3H13，YTHDF1，TRMT10C，YTHDF2，RRP8，TRMT6，LRPPRC和IGF2BP3的列线图（图7）。

图7

08   m6A/m1A/m5C风险模型的临床价值  

根据对高风险组和低风险组HCC患者临床病理特征的分析，风险模型与HCC患者的肿瘤分级，临床分期，T期，远处转移和fustat状态有关（图8A）。单因素Cox回归分析显示，临床分期、T期和风险评分是HCC患者预后异常的危险因素（图8B）。多因素Cox回归分析显示，远处转移和风险评分是HCC患者预后不良的危险因素（图8C）。

图8

09   风险模型高评分亚组的功能富集  

高风险评分与剪接体调控、细胞周期、碱基切除修复、RNA降解、卵母细胞减数分裂、泛素介导的蛋白水解、嘧啶代谢、DNA复制、同源重组、错配修复、核苷酸切除修复、胞质DNA传感途径、内吞作用、神经营养因子信号通路、基础转录因子、癌症通路、WNT信号通路等相关（表1）。

表1

10   风险模型signature的免疫浸润  

在45个m6A/m1A/m5C调节基因中，幼稚B细胞，记忆B细胞，CD4记忆静息T细胞，CD4记忆活化T细胞，M0巨噬细胞，M1巨噬细胞，静息肥大细胞和嗜酸性粒细胞的表达水平存在显著差异（图9A）。幼稚B细胞，记忆B细胞，T细胞CD8，CD4记忆静息T细胞，M0巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的表达水平在37个cluster相关的差异表达基因亚组之间显著差异（图9B）。在高危组和低危组中，基质评分，CD4记忆静息T细胞，滤泡辅助T细胞，活化的NK细胞，单核细胞，M0巨噬细胞，M1巨噬细胞，静息肥大细胞，嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的表达水平存在显著差异（图9C）。风险评分与基质评分、CD4记忆静息T细胞、CD4记忆活化T细胞、滤泡辅助T细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞和静息肥大细胞的水平显著相关（图9D–I）。

图9

相关分析显示，免疫细胞标志物表达水平与HCC中的风险评分水平相关（图10），IRF5、ITGAM、CD86、NRP1、CTLA4、STAT5A、HAVCR2、CSF1R、STAT1、CD19、ITGAX、CD68、TGFB1、CD3D、PDCD1、HLA-DPB1、HLA-DRA、TNF、CCR8、IFNG、VSIG4、BCL6、IL10、HLA-DPA1、STAT5B、MS4A4A、STAT6、LAG3、HLA-DQB1、KIR2DL4、STAT3和IL21 的表达水平在高风险组和低风险组之间差异显著（图11）。

图10

图11

小编总结 本研究探讨了45个m6A/m1A/m5C调节基因在肝细胞癌进展中的作用，观察了m6A/m1A/m5C调节基因亚组间总体生存、临床分期、T期、肿瘤分级等临床特征的显著差异。构建 风险模型的基因YBX1、ZC3H13、YTHDF1、TRMT10C、YTHDF2、RRP8、TRMT6、LRPPRC和IGF2BP3在独立验证数据中肝细胞癌组织中的表达与TCGA数据库中的表达结果一致。 此外，构建的风险模型评分较高与预后不良、肿瘤分级、临床分期、T期、远处转移和发源状态相关，是HCC患者预后不良的独立危险因素。 本文最大的亮点在于使用m6A/m1A/m5C的调节基因共同构建模型，而不像以往文章单独使用m6A，非常新颖。值得学习。

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