前列腺癌患者的Circulating RNAs

Circulating RNAs in prostate cancer patients

Mugoni V, Ciani Y, Nardella C, Demichelis F. Circulating RNAs in prostate cancer patients. Cancer Lett. 2022 Jan 1;524:57-69. doi: 10.1016/j.canlet.2021.10.011. Epub 2021 Oct 14. PMID: 34656688.

前列腺癌患者的循环 RNA

• •细胞外 RNA 分子 (exRNA) 在与蛋白质复合物结合或封装在细胞外囊泡 (EV) 内的生物体液（即尿液、血液）中循环。大多数文献报道了 EV 相关 RNA (EV-RNA)。

• •EV 相关 RNA (EV-RNA) 包含多种物种，包括 miRNA、circRNA、lncRNA 和 mRNA。

• •正在研究 EV-RNA，以通过液体活检最终确定与癌症相关的改变。

• •目前正在研究从尿液、血浆或血清中分离的 EV-RNA，以识别潜在的前列腺癌生物标志物。值得注意的是，EV-RNA 已成功用于开发多种检测方法（例如 FDA 批准的 Progensa 前列腺癌抗原 3（PCA3 检测）），以改善前列腺癌的检测。

• •目前，研究 EV-RNA 的主要挑战之一是癌症患者中的循环 EV 包括大量不同的群体，这些群体由来自不同组织的癌细胞和正常细胞释放。

• •这里总结的研究集中在已经被认为是前列腺癌潜在生物标志物的 EV-RNA 种类上。

• •最后，我们在此强调迫切需要改进旨在区分特定电动汽车群体及其相关 RNA 货物的技术和计算方法。

越来越多的证据表明，在患者的血液和尿液中鉴定前列腺癌 (PCa) 生物标志物可以显着改善 PCa 的诊断 和进展监测。在多种癌症衍生的循环材料中，细胞外 RNA 分子 (exRNA) 是研究癌症相关改变的重要组成部分。一旦离开细胞内环境，exRNAs 在生物流体中循环，或者与 蛋白质复合物结合 ，或者封装在细胞外囊泡 (EV) 内。值得注意的是，EV 相关 RNA (EV-RNA) 被用于开发几种检测方法（例如 FDA 批准的 Progensa 前列腺癌 抗原 3（PCA3 检测），旨在改善早期 PCa 检测。EV-RNA 包含多种物种，包括小的非编码 RNA（例如 miRNA 和 circRNA）、lncRNA 和 mRNA。已经提出了几种方法来分离 EV 和相关 RNA，并进行 RNA-Seq 研究以识别潜在 的癌症生物标志物 . 然而，癌症患者循环中的 EV 包括大量不同的群体，这些群体由来自不同组织的癌细胞和正常细胞释放，从而导致异质的 EV-RNA 相关转录信号。解密这种复合信号的复杂性是当今识别特定肿瘤相关 RNA 所面临的主要挑战。到目前为止，已经提出了多种反卷积算法来从基因表达数据中推断癌症特异性信号的富集。然而，对与单个 EVs 群体相关的 RNA 进行 EVs 分类和测序的新策略将显着促进癌症相关分子的识别。总之，此处总结的研究证明了在 PCa 中使用 EV-RNA 生物标志物的巨大潜力，并强调迫切需要改进技术和计算方法来表征特定 EV 群体及其相关 RNA 货物。大规模人群筛查和早期发现 PCa 是针对男性癌症相关死亡最常见原因之一的主要防御措施 [  1  ]。早期诊断和疾病监测将极大地受益于临床相关生物标志物（即与侵袭性疾病相关的生物标志物）的鉴定，这些生物标志物很容易在血液或尿液样本中检测到 [  2  ]。

用于评估 PSA（前列腺特异性抗原）升高的血液检测是当今最广泛使用的检测 PCa 的方法 [   3   ]。然而，PSA 检测在区分前列腺上皮的良性改变（例如  前列腺炎  或  良性前列腺增生  (BPH)）与 PCa 方面的能力有限 [   2   ]。因此，目前正在探索由  癌细胞  在生物体液中释放的其他循环物质，例如  循环肿瘤细胞(CTC)、无细胞 DNA (cfDNA) 和 RNA (cfRNA)，以及细胞外囊泡 (EV)，作为潜在的来源。   PCa 生物标志物  [   4  ]。循环材料的收集和分析，通常称为“液体活检”，与实体癌特别相关，因为它原则上提供了通过抽血评估恶性组织存在的机会，同时限制侵入性程序（即针活检）或用于身体扫描的高分辨率成像方式（即PET ：  正电子发射断层扫描  ；CT ：  计算机断层扫描  ，MRI：磁共振成像）[   5   ]。与组织活检相比，液体活检不仅代表了一种侵入性较小且痛苦最小的方法，而且还具有更好地捕获肿瘤块的分子异质性的潜力 [   6   ,  7 ] 并检测  可能难以活检的转移灶（例如骨骼中的  转移灶  ）的分子信号。基于液体活检的检测将与  PCa 诊断  特别相关，以提高当前 PSA 检测的有限特异性 [   4   ]，同时理想地专注于高风险 PCa 的检测，并提供在治疗期间跟踪潜在独立克隆的方法的转移患者。

最近的几项研究证明了通过下一代测序 (NGS) 方法研究 cfDNA 以识别晚期 PCa 患者的分子改变的实用性 [   8   ,   9   ]。例如，通过分析连续血浆样本中的 cfDNA，可以发现在接受  抗雄激素治疗  的去势抵抗性 PCa   (CRPC) 患者中出现了特定的基因组异常（例如 AR 扩增）。类似地，从转移性 CRPC (mCRPC) 中分离 CTC 以及随后通过 NGS 技术对其进行计数和基因组表征有助于在特定临床环境中识别生物标志物，例如对  阿比特龙  和恩杂鲁  胺  的耐药性[   12   ]。特别是，CTC 不仅是研究癌症相关基因组改变的重要来源，而且是评估突变变体（例如 AR-V7 和  TMPRSS2  ：ERG）以及前列腺特异性 mRNA（例如  KLK2  、KLK3）的表达的重要来源。

研究 cfDNA 和/或 CTC 作为晚期 PCa 中诊断和预测生物标志物的来源，为临床应用提供了潜在的有用工具 [   15   ,   16   ]。  然而，这些循环物质经常对早期癌症检测  和相关诊断构成限制[   16   ]。在这种情况下，目前正在努力开发基于检测从血液或尿液中提取的循环 RNA 的早期诊断测试 [   17   ]。例如，FDA 批准了一项名为 Progensa Prostate Cancer Antigen 3 (PCA3) 的测试，该测试基于尿液中 PSA 和 PCA3 mRNA 的检测 [   18  ]。此外，以下测试目前正在验证过程中：i) ExoDx 测试（前列腺 IntelliScore 测试），该测试基于检测从尿液分离的  外泌体  中提取的 ERG 和 PCA3 mRNA [   19   ]；ii) SelectMDX 检测将尿液提取的 HOX6 和 DLX1 mRNA 水平与其他风险因素结合在一起 [   20   ]。值得注意的是，最近将循环 RNA 的分析与其他循环材料相结合，以开发癌症中的多分析物液体活检。例如，循环 RNA 与 CTC 和 cfDNA 的分析已被研究用于mCRPC 患者的癌症  分子谱分析  。总之，这些最近开发的基于液体活检的测试突出了探索癌症相关循环转录信息的重要性和有希望的潜力。

在这里，我们总结了血液中循环的 exRNA 的类型和相关功能，它们可能作为有用的 PCa 生物标志物，用于未来在临床中实施液体活检。  此外，我们强调了目前在 EV-RNA转录组学  分析中面临的挑战，主要是由于难以区分与癌症与正常细胞释放的 RNA 分子相关的 RNA 信号。

2 . 细胞外 RNA (exRNA) 涵盖种类繁多的物种

在过去十年中，多项研究表明存在释放到细胞外的 RNA 种类，统称为“细胞外 RNA (exRNA)”。ExRNA 在血液、尿液和唾液中被检测到，它们代表了潜在的高度有用的生物标志物，可用于开发基于液体活检的检测方法。ExRNA 通过以下方式免受普遍存在的  核糖核酸  酶介导的降解：i)与屏蔽载体的结合，例如  脂蛋白  （例如高密度 (HDL) 和低密度 (LDL) 脂蛋白）和  蛋白质复合物  （导致形成  核糖核蛋白  ）复合物）[   23   ]，或ii) EV 内的  封装  。循环 EV 是由所有类型的细胞自然分泌到  细胞外空间  和生物体液中的脂质双层膜分隔的  纳米颗粒  [ 25   ]。EV 包含多种亚型，包括  外泌体  (50-200 nm)、  微泡  (100 nm-1000 nm)、凋亡小体 (1000 nm-5000 nm) [   26   ] 和称为“肿瘤体”的微米级颗粒 (1-10 μm ) [   27   ]。蛋白质、代谢物、脂质和  核酸等多种分子  由 EV 携带并可能在细胞之间转移，并且 EV 货物确实被提议用于将恶性改变追溯到组织。由于重叠的物理特征（尺寸和密度），细胞释放的 EV 很难与生物体液中循环的其他脂质成分区分开来，例如 HDL、LDL、  乳糜微粒  和脂蛋白的聚集体 [   26   ]。为此，需要使用  超速离心  和尺寸排阻色谱 (SEC) 等特定方法将 EV 从流体中分离出来，然后再从其核心中  纯化  分子成分 [ 28  ]。循环 EV 与其他循环肿瘤衍生材料（如  CTC   ）的单独存在已被证明可预测 CRPC、  转移性结直肠癌  (mCRC)、  转移性乳腺癌  (MBC) 和非小细胞的总生存期 (OS)肺癌 (NSCLC) [   29   ]。

除了与蛋白质或 EV 的关联外，exRNA 通常通常被称为“循环 RNA”或 cfRNA。最初，循环 RNA 主要作为无细胞核酸进行研究 [   30   ]，而 EV 分离方法和 EV RNA 货物直到最近才出现在  生物医学研究  中。当不从生物体液中分离 EV 或外泌体用于 RNA 检测时，循环 RNA 通常称为 cfRNA [   31   ]。在回顾文献时，检查研究方法始终是一个好习惯，因为对 exRNA 命名法的一些混淆并不少见。观察到血浆中 cfRNA 的水平稳定，自然昼夜循环和膳食消耗几乎没有变化 [   32 ]，这表明 cfRNA 是  液体活检  的理想循环材料[   24   ]。尽管 cfRNA 仍然缺乏提取、检测和验证协议的标准化 [   32   ,   33   ]，但已经确定并提出了多种 cfRNA 作为潜在的候选生物标志物。事实上，cfRNA 已被证明是几种生物体液和癌症类型中肿瘤相关生物标志物的潜在来源，例如：1) 已在头颈癌患者的血浆和唾液中鉴定出非编码 cfRNA [   36   ]；2) 尿 UBE2C cfRNA 水平被提议用于区分  膀胱癌  和健康对照 [   37   ]；  3) 在肾细胞癌  患者的尿液样本中检测到 VEGF mRNA 的片段，并将其作为潜在的诊断分子标记物进行研究 [   38   ]。cfRNA 作为检测循环肿瘤生物标志物的材料也被报道用于  雄激素受体的 mCRPC 患者  在血浆 cfRNA [   39   ]上检测到畸变（AR 突变变体，如 ARV7、ARV9、  拷贝数变异、体细胞突变）。

自 2007 年以来，进行了多项研究，例如 Valadi H. 等人进行的研究。和 Skog J. 等人。证明了EV 内部存在 mRNA 和  miRNA   [ 40   ,   41   ]。从那时起，EV 及其 RNA 货物在正常和病理条件下成为有吸引力的 exRNA 循环来源。

几个方面迅速使 EVs 成为表征 exRNAs 的一个有吸引力的目标，包括：1) EVs 脂质  双层膜  构成了安全运输多种 RNAs 的理想载体单元；2) 封装在 EV 中的 exRNA 与体液中循环的其他物质分离；3) EVs 由所有细胞类型释放，它们的 RNA 货物代表总细胞 RNA 的信息部分；4)   NGS  技术的发展允许对最少量的 EV 衍生 RNA (EV-RNA) 进行测序和分析；5) exRNAs 可能在许多细胞间通讯过程中发挥作用的新兴假设，例如  癌症转移  [   42   ,   43  ]。最后，关于 EV 的各种研究表明，受包括  PCa  在内的恶性疾病影响的患者的血液和尿液中循环 EV 的数量增加。总之，这导致了 exRNA 与 EV 携带的 RNA (EV-RNA) 的共同关联，特别是在液体活检领域 。  已经付出  了许多努力来建立和不断改进与不同类别的 EV 相关的 exRNA 的纯化和测序方法 [ 47、48   ]  。

重要的是，最近关于循环 EV 携带的转录信息的文献表明，几种 RNA 嵌入在 EV 中。EV-RNA 货物由不同尺寸的 RNA 片段（通常是峰值大小约为 200 bp 的小片段）组成，包括：mRNA、前体 pre-miRNA 和成熟 miRNA、snoRNA、rRNA、tRNA、lncRNA、pi-RNA、 Y-RNA、vtRNA 和  线粒体 RNA   [   46   ]。在这里，我们回顾了与 PCa 中的肿瘤进展、转移和对治疗的抵抗最广泛相关的 EV 相关 mRNA、miRNA、lncRNA 和 circRNA。

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• mRNA

据报道，片段或全长 mRNA 与  癌细胞  释放的 EV 相关，包括来自 PCa 的 EV [   46   ]。从尿液或血液中分离出的 EV 的 mRNA 货物已被验证为前列腺特异性 mRNA 的来源，例如编码原癌基因 ERG（EXO106 评分）[   19   ] 或致癌融合基因  TMPRSS2  的转录本：ERG [   49   ,   50  ]。在这方面，Leyten GH 等人。显示 TMPRSS2:ERG 转录物存在于尿外泌体中，并报告了与 ERSPC（欧洲前列腺癌筛查随机研究）风险计算器结合的显着 PCa 检测预测值，从而证明了 TMPRSS2:ERG 转录物的预后价值及其潜力用于限制不需要的  前列腺活检  的数量[   51   ]。进一步的研究证明了将尿 TMPRSS2:ERG 转录物与其他标志物（如 PCA3 和  PSA  评分）相结合的价值 [   52   ]。

在血流循环的 EV 中发现了额外的 mRNA，例如与 PCa 的神经内分泌 (NE) 特征（例如 BRN2 和 BRN4）相关的那些 [   53   ]。Bhagirath D.等人。证明血清衍生的 EV 携带 NE 标志物，如 BRN4 和 BRN2，与具有腺癌特征的 CRPC 患者相比，具有 NE 表型的 CRPC 患者的 PCR 分析显示其水平升高 [   53   ]。此外，血液衍生的 EV 可用于检测转移性患者中剪接变体 AR-V7 的表达，以预测激素治疗耐药机制的出现 [   54   ,   55  ]。AR 和 AR-V7 的血液 cfRNA 水平最近已被用于多参数液体活检，以跟踪 mCRPC 在使用特定治疗（如 PARP 抑制剂）后的时间和进展[   56   ]。在另一项研究中，Fettke 等人。在接受 AR 通路抑制剂或化疗治疗的 mCRPC 患者队列中，循环 AR 及其变体（AR-V7 和 AR-V9）的综合表达将 AR（和/或其分析的变体）的存在与不良结果联系起来 [   39   ]。此外，在从 CRPC 患者收集的尿液 EV 中检测到 AR 全长和 AR-V7 mRNA，从而证明了在尿液和血液液体活检中检测此类转录物的具体可能性 [   57   ]。

尽管循环 mRNA 可能在受体细胞或生物体液中发挥功能活性，但所有这些众多发现都证实了 EV 的 mRNA 货物是前列腺  癌生物标志物  的重要来源。

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• miRNA。

miRNA 家族代表了与 EV 相关的最常观察到的 RNA 类别之一，这可能是因为 miRNA 是转录分析更频繁地描述的 RNA 类型之一 [   58   ]。细胞外miRNA （即 miR-18a、miR-21、miR-155、miR-221  和  miR-   375) 与包括 PCa 在内的许多癌症类型相关的失调 [   61   ]。

在 PCa 患者中，已在尿液、血浆或血清中鉴定出特定的 miRNA，尽管此类循环 miRNA 的生物发生尚未完全阐明 [   62   ,   63   ]。迄今为止，很少有人提出将 miRNA 分类为 EV 的潜在机制，包括：1）涉及神经  鞘磷脂酶  2（nSMase2）的途径；2）与miRISC（miRNA诱导沉默复合物）相关的途径；3) 一个特定的 miRNA 基序（3' 中的 GGAG），它被 sumoylated 异质核核糖核蛋白 (hnRNP) 识别；4) 其他特定的 miRNAs 序列 [   64   ]。将 miRNA 分选成外泌体可能是一个选择性和主动的过程，其中  RNA 结合蛋白  和膜相关蛋白被认为对特定 miRNA 的主动封装很重要 [   65   ]。

为了探索血液中循环的 miRNA 作为 PCa 的潜在生物标志物，对  计算机  可用 RNA 数据集和/或从血浆和血清等体液中分离的 RNA 进行了研究。例如，Souza MF 等人。[   66   ] 对 TCGA 数据库进行了计算机分析，然后对 102 名未经治疗的 PCa 患者和 50 名对照个体的血浆样本进行了 RT-qPCR 验证，从而将 miR-200b 和 miR-200c 的表达提名为与 PCa 显着相关. 具体而言，miR-200b 与 PSA >10 ng/mL 和  骨转移相关  ，而 miR-200c 表达与  Gleason 评分  相关[   66  ]。相关的是，这两种 miRNA 也被报道为 PRKAR2B 表达的关键调节因子，这是一种与 PCa 进展有关的分子因子 [   67   ]。有趣的是，Gandellini P. 等人最近的研究。[   68   ] 证明了三种 miRNA（miR-511-5p、miR-598-3p、miR-199a-5p）的特征，作为改善低风险 PCa 主动监测的有前途的生物标志物。

miRNA 作为 PCa 患者液体活检中潜在生物标志物的其他证据包括 miR-20a，其特征在于其在 PCa 组织中的作用并在患者循环中进一步检测到。具体而言，发现 miR-20a 在 PCa 组织中上调，并通过靶向 ABL2 被确立为  前列腺细胞  侵袭和迁移的启动子，ABL2 是涉及几种癌症类型的重要因素 [   69   ]。沉J.等。[   70   ] 在晚期 PCa 患者的血浆样本中检测到 miR-20a 的过表达。一致地，Mohammadi Torbati P. 等人。与健康对照组相比，通过 qRT-PCR 对 40 名  前列腺  癌患者的血清样本显示循环 miR-20a 的上调[   71   ]。

另一个被提议作为循环生物标志物的 miRNA 的例子是 miR-145。发现 miR-145 在几种类型的癌症中发生了改变，并且还在 PCa 中研究了它的改变，其中低表达水平被认为是预后不良的预测因子 [   72   ]。最近，关于 PCa 和正常前列腺组织的 qRT-PCR 研究将 miR-145 与一组在低风险 PCa 中表达不足的 miRNA（包括 miR-221 和 let-7c）相关联[   73   ]。  qRT-PCR 报告了循环 miR-145 的证据，该证据来自于从 PCa 尿液样本中分离的外泌体，与BPH  和健康对照相比，其表达水平上调[   74  ]。miR-145 在放射治疗后从 PCa 患者血液样本中分离的外泌体中也有报道，即使与相关对照相比，其在循环中的表达水平没有明显变化 [   75   ]。

在其他 miRNA 中，miR-221 已被研究作为实体癌 [   76   ,   77   ] 包括 PCa [   78   ] 的潜在循环生物标志物。Ibrahim NH 等人提出了 miR-221 的血浆水平与前列腺健康指数 (PHI) 的结合。作为 PCa 的诊断和预后标志物 [   79   ]。鉴定循环中这种特定 miRNA 的重要性在于其在前列腺中作为 onco-miRNA 的非常明确的作用 [   80   ]。  具体而言，前列腺组织  中 miR-221 的下调与高危 PCa 患者的 Gleason 评分、肿瘤进展和复发相关 [   81   ]。体外和体内实验证明 miR-221-5p 是一种肿瘤抑制因子，因此增加的 miR-221 水平可有效限制动物模型中 PCa 细胞的迁移和外渗。相反，与正常前列腺组织相比，下调的水平与转移或原发性肿瘤有关 [   82   ]。

到目前为止，嵌入血液来源的外泌体中的一系列 miRNA 与 PCa 相关，包括 1）在 PCa 患者的血清分离外泌体中观察到 miR-1246 水平升高，并与侵袭性 PCa 相关[   83   ]；2) miR200c-3p 和 miR-21-5p 在 PCa 中的表达高于 BPH（良性前列腺增生）患者，而 Let-7a-5p 根据 Gleason 评分显示出不同的水平 [   84   ]；3) miR-290 和 miR-375 在 CRPC 患者中显示上调，并与总生存率显着相关 [   85   ]；4) 最近致癌的 miR-424 与侵袭性 PCa 相关[   86   ]；5) 血浆外泌体 miR-423-3p 被提议作为 CRPC 的潜在预测生物标志物 [   87  ]; 6) Urabe F. 等人最近使用了 miR-17-3p 和 miR-1185-2-3-p 的组合。建立 PCa 的诊断模型 [   88   ]。

有趣的是，miR-141 和 miR-375（两种最普遍研究的 miRNA）水平升高，通过多项研究在 PCa 患者的尿液和血浆来源的外泌体中发现 [   [89]  、  [90]  、  [91]   ]。Bryzgunova OE 等人以显着的高特异性和灵敏度检测到了另一种 miRNA，miR19b。在 PCa 患者尿液样本中富含外泌体的亚组分中 [   92   ]。

除了特定的单个 onco-miRNA 外，还建议将 miRNA 集作为 PCa 中潜在的循环生物标志物。例如，miR-20a 与 miR-21、miR-145 和 miR-221 组被发现与低风险和高风险 PCa 患者相关 [   70   ]。同样，提出了一种由从血液样本中鉴定的 miR-17、miR-20a、miR-20b 和 miR-106a 组成的四种 miRNA 特征，用于预测前列腺癌根治术后的  风险分层  [   93   ]。检测到一组四种循环 miRNA（miR-141、miR-182、miR-200b 和 miR-375）的血清表达水平变化与总 PSA (TPSA) [   94   ] 相关，并被提议作为诊断生物标志物区分 BPH 和 PCa。

目前的研究工作正在研究循环 miRNA 与其他可在血液或尿液中检测到的肿瘤衍生材料（如 CTC）[   95   ,   96   ]。Cheng HH 等人。报道了转移性激素敏感性 PCa 患者基线血浆中 miR-141、miR-200a、miR-375 和 CTC 之间的正相关性。重要的是，他们证明了 miR-375 和 CTC 计数的水平同样可以预测 28 周 PSA 对单独或与 cituxumumab 联合使用的雄激素剥夺治疗的反应 [   97   ]。

尽管有所有这些证据，但截至今天，临床上还没有基于分子 miRNA 的测定法用于来自 PCa 患者的尿液或血浆样本。

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• lncRNA

PCA3 代表前列腺中研究最多的  lncRNA   [   98   ]。具体来说，该 lnRNA 被用于开发  尿液检测  [   99   ]，该检测已被 FDA 批准用于临床 [   100   ]。除了 PCA3，与 PCa 相关的循环 lncRNA 还包括血浆中的  MALAT1  以及 FR0348383、SCHLAP1 和 lincRNA-p21，它们是从尿液中的 DRE（直肠指检）后分离出来的外泌体 RNA [   101   ]。

据报道，MALAT1 的高血浆丰度对于区分 BPH 和 PCa 至关重要 [   102   ]。此外，10 名患者中有 9 人在手术后 7 天显示 MALAT1 水平下降，从而为其作为晚期 PCa 循环生物标志物的潜在作用提供了支持证据。此外，对尿液样本进行的评估表明，MALAT1 RNA 与 PCa 检测显着相关 [   102   ]。

尽管研究少于 MALAT1，但尿液中的 lncRNA FR0348383 可能是  PCa 诊断  的有吸引力的生物标志物，以避免不必要的组织活检 [   103   ]。然而，在考虑将 lncRNA FR0348383 作为生物标志物之前，仍需要进行额外的分析和临床验证。同样，DRE 后尿液样本中的 SChLAP1 水平与 Gleason 评分相关，但在这种情况下，生物标志物分类也需要进一步表征 [   104   ]。

虽然与 BPH 相比，在 PCa 中显着上调，但 lincRNA-p21 未能作为生物标志物评分，因为其循环水平非常低 [   105   ]。

考虑到 NGS 技术和超灵敏方法（例如 ddPCR）检测少量 RNA 的最新进展，很可能在接下来的液体活检中常规分析 EVs 相关的 lncRNA 以及 mRNA 片段未来。

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• circRNA（环状 RNA）

由于其内在结构，circRNA 被认为是稳健的 RNA 分子。circRNA 缺乏自由末端，因此较少暴露于外切酶介导的降解 [   106   ]。值得注意的是，在 EV 中发现了 circRNA [   107   ,   108   ]。  例如，在鼻咽癌患者  中检测到循环外泌体 circMYC 增加，并与肿瘤大小、转移和总生存期等临床变量相关 [   109   ]。目前，已知 circ-RNAs 作为 microRNAs 海绵发挥作用 [   110  ]，但它们在癌症中的作用（包括它们在 EV 中的功能）尚未完全阐明。最近已经描述了 PCa 中外泌体 circ-SLC19A1 的特定功能机制 [   111   ]。郑永等。报道称，PCa 细胞可以通过 miR-497/septin 2 通路通过装载高水平 circ-SLC19A1 的 EV 来调节细胞生长和侵袭[   112   ]。

尽管 EV 中有大量 circRNA，但这种 RNA 类别在用于 PCa 诊断和预后的液体活检中的临床验证仍有待确定。

3 . exRNAs 转录组学分析的挑战

3.1 . 与各种 EV 隔离方法相关的挑战

过去几年见证了多种 EV 隔离方法的发展，这些方法具有不同的方法、效率和时间要求 [    113    ,    114    ]。几项研究比较了这些方法，但尚未建立黄金标准 [    28    ]。尽管存在所有差异和特殊性，但这些方法允许 EV-RNA 回收和质量，适用于通过测序进行的下游分析 [    115   ]。重要的是，根据使用的 EV 隔离方法，结果可能会发生巨大变化；因此，生物数据解释需要考虑到这一层的复杂性。众所周知，不同的 EV 隔离方法会导致 EV 机械应力，例如在通过   超速离心   分离 EV 时观察到的应力[    116    ]，可能导致错误的数据解释。此外，EVs 分离方法可以直接影响特定 EVs 亚群的富集，每个亚群都包含 RNA 的特征库 [    117    ]。例如，RNA 谱显示 rRNA 主要在凋亡小体中可检测到，而较小的 RNA（不含   核糖体 RNA   峰）更多地存在于外泌体中。相比之下，   微泡   含有很少或不含 RNA [    118    ]。  

3.2 . 与纯化 exRNA 的不同方法和方案相关的挑战

具体来说，在研究 EV 转录货物时，需要仔细考虑EV 和   RNA 分离步骤。   最近的一篇论文比较了五种不同的分离方法及其对基于 miRNA 的生物标志物发现的适用性 [    115    ]。这些数据表明，基于沉淀和膜亲和性的 EVs 分离方法特别适用于小   RNA 测序   和基于 miRNAs 的患者分类。他们的结论仅限于特定 RNA   生物型的比较和差异表达分析   (miRNA) 来自脓毒症患者和健康志愿者的血清衍生 EV。此外，他们证明了特定的分离方法与非 EV 衍生的蛋白质污染（评估为 NTA 颗粒计数和蛋白质浓度之间的比率）和不同的 EV 大小分布有关 [    115    ]，这表明至少部分优先隔离 EV亚人群。  

在另一项工作 [    119    ] 中，使用类似的方法来比较来自 PCa 患者和健康志愿者精液的 EVs-miRNA [    119    ]。在这种情况下，用于 EV 分离的 miRCURY 外泌体试剂盒显示出最高的颗粒回收率，但 RNA 纯度较低。不管后者如何，回收的 RNA 都适用于后续的   miRNA   分析 [    119    ]。有趣的是，在同一项研究中，还报道了 ExoGAG 提取的 EV 中特定 miRNA（例如 miR-663b）的显着过度表达，因此假设通过该 EV 分离试剂盒选择性分离含有 miR-663b 的特定 EV 群体[    119    ]。  

其他研究 [    120    ,    121    ] 表明，通过不同 EV 分离方法获得的 miRNA 之间存在总体相关性，并且在分析特定转录本时存在显着差异。在这种情况下，当观察不同的小 RNA 生物型时，发现分离方法之间存在显着差异，其中 rRNA 或 tRNA 占主导地位取决于所选方法。  

此外，在考虑不同的 RNA 分离方法时，必须考虑 RNA 产量、纯度和大小的显着差异 [    122    ]。  

总体而言，无论 EV 分离方法如何，EV-RNA 都代表了癌症患者液体活检中有价值的信息来源 [    123    ]。在这方面，健康供体和癌症患者的 EV-RNA 衍生   转录   组的直接比较代表了一种可行且有前途的方法。  

3.3 . 与缺乏用于 exRNA 计算分析的标准化管道/协议相关的挑战

不幸的是，缺乏金标准 EVs 分离方法和该领域关于 EVs 亚群 RNA 货物的普遍共识使得来自不同研究的   转录组学数据的比较非常困难。   由于缺乏标准化的计算方法，分析与 EV 无关的循环 RNA 也遇到了类似的困难。一些在线资源旨在收集、组织和同质化来自不同来源的数据（   表 1   ），目的是为与 EV 高通量分析无关的 EV-RNA 和 exRNA 建立共同基础。特定管道（主要集中在短 RNA [    124   ]) 已被提出，但鉴于 EV 和相关 RNA 货物的异质性，一刀切的解决方案可能不是最佳的。最近，一种总 RNA 测序方法已在不同的生物流体 [    47    ] 上进行了测试，突出了不同样本类型的读数分布的显着差异。  

标准化的 EV-RNA 测序数据计算分析将对该领域有益。然而，生物变异性和目前缺乏特定 EV 群体的特征使得 RNA-seq 分析标准化很难实现。这些方面也可能解释了迄今为止观察到的不同研究之间的不一致[    125    ]。  

值得注意的是，最近的一项研究通过使用相同的计算管道分析了来自多个出版物和不同生物流体的 EVs-小 RNA 数据 [    125    ]。该研究报告称，尽管采用统一的计算处理，但 miRNA 表达谱主要按研究聚类。这一观察结果支持了这样的假设，即潜在的变异来源可能表现为不同的 exRNA 载体（即 EV、   脂蛋白   等）的存在，它们中的每一个都具有特征性的货物特征和在特定生物流体中的差异富集 [    125    ]。特别是，该研究确定了与低密度囊泡 (LDV)、脂蛋白和 AGO2-核糖核蛋白不同相关的特定分子簇。  

LDV 和高密度囊泡 (HDV) 相关的 exRNA 先前在肥大细胞中被表征 [    126    ]。据观察，虽然 LD 和 HD 部分都包含 miRNA 和 mRNA，但 HD exRNA 富含   lincRNA   、   反义 RNA    、vault RNA、   snoRNA   和   snRNA    [    126    ]。  

在不同 EV 群体中检测到的 RNA 种类的异质性揭示了选择性分选的可能机制 [    127    ,    128    ]。在这方面，几个小组已经确定了一系列 miRNA 分选机制，例如涉及与 RNA 结合蛋白和   膜蛋白   结合的机制[    65    ]。  

例如，人血浆中循环 Ago2-miRNA 复合物的存在表明 Ago2 可能在稳定分泌的 miRNAs [    129    ] 中发挥作用，并且可能与 miRNAs 通过 KRAS-MEK-ERK   信号通路   结合和分类为 EVs [    130 ] 相关。    ]。活性 miRNA 分选机制的其他潜在候选者是   主要 Vault 蛋白   (MVP) [    131    ]、Y-Box 结合蛋白 1 (YBX-1) [    132    ] 和 Caveolin-1 [    133    ]。  

值得注意的是，转录后修饰（例如 3' 末端尿嘧啶扩张）与通过外泌体分泌小 RNA 相关[    134    ]。  

关于更长的转录本，来自 EVs-mRNAs 的读数显示出跨内含子的测序深度丰富，这表明输出了未加工的未剪接 mRNA 转录本，或者更有可能的是 RNA 片段 [    128    ]。  

最后，尽管 lncRNA 和 circRNA 在细胞中表达水平较低，但一些研究表明，非编码转录本在 EV 中富集，即使它们在亲本细胞中被下调，因此表明选择性分选为 EV [    128   ，   [135]   、   [136]   、   [137]    ]。尽管有大量证据表明 EV 种群与其 RNA 货物相关联，但缺乏对 EV 亚群中特定 RNA 生物型的详细且广泛接受的分类。  

在对癌症患者液体活检的 EV 进行分析后，EV 群体、其细胞来源和特定 RNA 货物的异质性代表了复杂性的一个重要层面。  

具体来说，除了癌症 EV，在每个样本中，大多数 EV 都来自不同组织的正常细胞。此外，一些 EV 可能来源于未转化的细胞，这些细胞在癌症进展和转移形成中起关键作用，例如   肿瘤微环境   细胞、转移微环境和免疫细胞（见第 2 段）。由于尚未报道单 EV 测序方法，如今 EV-RNA 转录组学分析依赖于纯计算方法来解开上述信号的复杂性和异质性。  

由于细胞混合物的基因表达谱是在每种细胞类型中特异性富集的基因的线性组合的结果 [    138    ]，因此已经提出了几种反卷积算法来从基因表达数据中推断细胞类型的富集异质性[138]。    [139]   、   [140]   、   [141]   、   [142]    ]。尽管这些算法已成功用于从组织转录数据中追踪免疫细胞的比例，但它们并不直接适用于 EV 转录组学数据。最近，很少有人尝试从液体活检中去卷积 EV 转录组群 [    143    ,    144   ]。EV-Origin 算法已被用于预测来自 exLR 概况 [    143    ,    144    ] 的造血细胞和实体组织的相对富集，比较不同的疾病状况（在这种特定情况下，   前列腺组织   被排除在外，以避免任何与性别相关的偏见）。在最近一项关于   黑色素瘤   的研究中，研究人员创建了一个贝叶斯概率反卷积模型来估计肿瘤和非肿瘤来源的贡献 [    144   ]。该方法计算量大，可以在单个或几个基因上运行，因此已经提出了简化的多基因版本。然而，这种方法已被证明能够特异性区分肿瘤和免疫成分，但无法剖析导致癌症机制的各种 EV 群体，例如转移形成和肿瘤   微环境   调节（见第 2 段）。  

EV 转录数据中的另一个噪声来源是患者间的变异性。最近的研究将 EV 确定为衰老细胞   分泌   组内的关键参与者，并显示它们直接参与衰老相关分泌表型 (SASP) [    145    ]。此外，EV 与心脏 [    146    ,    147    ] 和   神经退行性疾病   [    148    ,    149 ] 有关   ] 从而表明癌症信号可能会被患者的整体健康状况所掩盖。方便的是，液体活检允许对同一患者进行连续采样。来自同一个体的样本的纵向分析有可能通过减少患者间的变异性来提高灵敏度和重现性（   图 1   ）。  

图 1。循环成分作为血液液体活检中 PCa 生物标志物来源的示意图。  

PCa 的分子和克隆异质性在这里由颜色编码的细胞（蓝色、绿色、黄色）表示。肿瘤细胞在循环中释放多种成分：在血流中循环的 CTC、细胞外 RNA (exRNA) 与屏蔽载体或小型和大型 EV 相关；游离 DNA (cfDNA)。  

A. 血管中包含的肿瘤衍生材料的图例。  

B. 在患者血浆或血清中检测到的临床相关 exRNA 列表  

C. 分析来自同一患者的系列样本的肿瘤衍生材料有可能有助于诊断和监测   疾病进展   。此外，通过限制患者间变异性的影响，使用系列样本可以提高数据分析的灵敏度和可重复性。  

总而言之，对患者循环 EV 的转录组学分析可以提供与起源癌组织（包括转移）相关的有价值的信息，并拦截肿瘤细胞和健康细胞之间的信号交换。迄今为止主要关注小 RNA 的分析将受益于包含长 RNA，因为与 EV 相关的 lncRNA 和 mRNA 研究可能会改善癌症相关转录程序的表征。  

4 . 进一步的方向和机会

    根据国际细胞外囊泡协会 (ISEV) [   48   ] 最近的一项全球调查，  核酸  代表了具有最高生物标志物潜力的 EV 相关分子，尽管它们在 EV 上的负载和向其他细胞的相关传递仍然很差理解 [   46   ,   150   ]。例如，越来越多的证据表明 EVs 转录本直接参与癌症过程，尽管对 EVs 介导的体内通讯机制的描述尚未完全阐明  。  阐明循环 EV 货物的功能将有助于识别癌细胞相关分子，并最终改善 EV 相关核酸（如 mRNA 和 lncRNA）作为可靠癌症生物标志物的使用。  然而，缺乏对循环 EV 在癌症患者中的作用的充分了解并不代表对 EV-RNA 货物的分析的障碍。EVs 目前被认为是体液中提供信息的循环成分 [ 152   ]，并已用于开发癌症液体活检中的多分析物血液检测 [ 153   ]。多种循环成分的分析和整合，例如循环蛋白与 cfDNA [ 154   ] 或 cfDNA 与 CTC，可实现精确和灵敏的癌症检测  。  未来，特定 EV 亚群的分离和表征技术进步将提高区分癌症产生的 EV 与血液或尿液中正常细胞释放的高比例 EV 的能力。虽然据报道，来自 CRPC 患者的大型肿瘤衍生 EV 可以通过用于 CTC 的仪器（例如 CellSearch）进行分析 [ 29   ]，但通过流式细胞术对小型 EV（即外泌体）的特定亚群进行分类仍然具有挑战性 [ 28   ] .

尖端技术将提供越来越多的分析荧光 s-EVS 的机会，例如纳米流式细胞术 [   156   ] 和成像流式细胞术（例如 Imagestream），这些技术已经在大型电动汽车 [   157   ] 和外泌体上进行了测试。   158、159   ]  。_

      从这个角度来看，发现在 EVs 脂质双层  上表达的癌症特异性标志物将有助于识别和量化由原发性肿瘤块或转移灶分泌的 EVs 百分比。例如，Khanna K. 等人。在来自健康男性和 PCa 患者的血浆分离 EV 上鉴定了 STEAP-1（一种先前显示在前列腺组织中富集的蛋白质）[   45   ]。STEAP-1 阳性-EV 在两个队列中被分离和定量，以证明存在 PCa 时 STEAP-1 标记物的增加 [   45   ]。  EV-RNA 货物可能类似于 CTC 相关的细胞内 RNA 进行探索，以获得与癌细胞相关的基因型和表型信息 [ 160   ]。重要的是，基于特定表面标记的 EV 分离方法将有助于将 EV-RNA 货物转录信息与特定组织相关联。  到目前为止，癌症特异性 EV 标记的鉴定已优先在体外进行，正如 Ciardiello C. 等人所证明的那样。在这项研究中，他们表明，从PCa 细胞系  DU145R80 分离的大肿瘤体中 alphaV-整合素的过表达能够诱导受体细胞的侵袭和粘附 [ 161   ]。在这方面，对从 PCa 患者分离的 EV 进行的蛋白质组学  研究将显着有助于 EV 相关标志物的表征和肿瘤相关 EV 群体的表征 [ 162   , 163   ]。  能够通过使用特定标记对特定 EVs 群体进行分类也将改进对特定 exRNAs 类别的 RNA 货物的分析，例如线粒体 RNAs   (mtRNAs)。

事实上，mtRNA 代表了癌细胞特异性代谢标志物的潜在来源，因为它们在控制癌细胞代谢方面具有特殊功能 [   164   ]。据报道，细胞可以将线粒体成分分泌到培养基中 [   165   ]，并且整个线粒体通过 EV 在细胞之间转移 [   166   ]。循环线粒体转录本的分析可能代表了一种测试 PCa 改变的创新方法，PCa 是一种已知  代谢酶  基因（如 IDH1/2）突变会驱动癌症进展的癌症  。

    总之，此处总结的研究证明了在 PCa 中使用 EV-RNA 生物标志物的具体可能性，并强调了改进技术和计算方法以更好地表征特定 EV 群体及其相关信息的迫切需要。  未来的工作肯定会受益于对单个 EV 群体进行分类和测序的新策略，以促进从 EV 获得的异质转录信号的解开。此外，类似于用于单细胞测序的单EV衍生的RNA测序方法可能会进一步提高转录组学数据分析的敏感性和特异性。