蛋白质组学结合机器学习模型筛选酒精性肝病生物标志物

酒精性肝病(ALD)是常见的慢性肝病，常导致肝硬化。随着发病率的上升，酒精性肝病已成为肝移植的主要原因，占因肝病死亡数的50%以上。初期通常表现为酒精性脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。大约75%的酒精性肝病在肝硬化阶段确诊，肝脏功能已严重受损，且不适合酒精使用障碍的药物治疗。无症状阶段早期发现酒精性肝病，可采取对酒精依赖的干预措施和治疗代谢合并征，预防或延缓疾病进展。

2022年6月2日，哥本哈根大学诺和诺德基金会蛋白质研究中心的科学团队、德国马克斯-普朗克研究所Matthias Mann课题组在Nature Medicine上发表题为Noninvasive proteomic biomarkers for alcohol-related liver disease的文章。报道了基于质谱的蛋白质组学检测和机器学习，构建了可用于预测肝纤维化、肝炎和肝脂肪变的蛋白质生物标志物组合。该研究成果被自然杂志"Nature"列为研究热点（Research Highlights）。

该研究团队在2019年曾发表过一篇基于血浆蛋白质组质谱检测与非酒精性脂肪肝病（NAFLD）相关蛋白标志物的文章，对48 例肝硬化或 NAFLD 患者的血浆蛋白质组分析，发现了6个出现显著变化的蛋白质（ALDOB、APOM、LGALS3BP、PIGR、VTN 和 AFM），其中聚合免疫球蛋白受体 (PIGR) 在非酒精性脂肪肝和肝硬化两个队列中有显著变化，分别升高了170%和298%。

因疾病进展缓慢、症状隐匿，给酒精性肝病早期诊断带来一定的挑战。肝炎的明确诊断需要肝活检，作为一种创伤性检查，病人难以接受，且1%的患者会出现并发症。现有无创生物标志物检测对于酒精性肝病的早期诊断准确性有限，导致不能及时发现而错过干预的最佳时机。因此，迫切需要可靠的诊断方法对高危人群进行筛查，如有酗酒史、肥胖史、体力活动较少和糖尿病史。此外，对酒精性肝病的分子病理机制尚不完全了解，目前尚无针对该疾病的特异性干预措施。对肝脏和血浆样本的蛋白组学分析，结合机器学习筛选分子标志物、构建模型，可进一步了解该疾病的发生发展分子机制，为早筛和药物靶点的发现提供参考。

此次发表的酒精性肝病转化研究成果，研究人员利用蛋白质组学和机器学习模型鉴定酒精性肝病生物标志物组合。基于质谱的蛋白质组学评估了596名个体（459个酒精性肝病患者和137个对照个体）的配对血浆样品和肝活检样品。构建的机器学习模型生物标志物组合可检测肝纤维化，肝炎和肝脂肪变。

▲酒精性肝病蛋白质生物标志物发现路径

主要采用数据非依赖性采集模式(data independent acquisition, DIA)，通过液质联用技术(LC-MS/MS)，对459例ALD患者和137例健康对照患者的血浆样品蛋白质酶解肽段进行质谱分析，分析平台为Evosep One+Orbitrap Exploris 480 (Thermo Fisher Scientific)。

研究者选择了9个蛋白标志物组合用于鉴定显著肝纤维化，6个蛋白标志物组合用于鉴定轻度活动性肝炎、12个标志物组合用于鉴定肝脂肪变性。三个标志物组合中共包括22种独特蛋白质，有8种在血浆和肝脏中均发生变化，包括C7、LGALS3BP、TGFBI、ALDOB、CLEC3B、FBLN1、 ATRN 和 SERPINF1。活动性肝炎组的协同调节蛋白比例最高，达到 67%（纤维化组和脂肪变性组分别为33%和42%）。在前期筛选得到的六种NAFLD候选蛋白标志物组合中，还检测到 ALDOB、AFM 和 LGALS3BP三种蛋白。基于所选生物标志物组合的逻辑回归模型的平均交叉验证 ROC-AUC 分别为 0.90、0.85和 0.91，用于预测显著纤维化、轻度活动性肝炎和肝脂肪变性。

▲机器学习筛选得到的蛋白质组标志物组合

▲蛋白质组模型对肝纤维化、肝炎、肝脂肪变的预测性能

与现有Best-in-class（同类最佳）临床检测相比，本研究构建的蛋白质组模型具有更优的性能。显著肝纤维化和轻度炎症的验证队列，进一步重现了蛋白质组学模型的性能，显示出独特的临床优势。例如，与常规用于评价肝纤维化的TE或 ELF血液检测相比，F2 蛋白质组学模型以更优的性能排除显著纤维化。准确地排除疾病可避免过度诊断，基于单一血液样本的综合诊断和预后信息可减少患者反复入院的次数并加快治疗决策。结果表明，血浆蛋白质组学通过同时准确检测酒精性肝病中的肝纤维化、肝炎和肝脂肪变，为临床决策提供指导。

关于该检测技术的临床转化潜力，研究者们提出该技术具有可通过蛋白质定量实现临床转化的优势。与弹性成像相比，在检测显著纤维化（包括F2）方面已经显示独特的竞争力。为提高通量和降低成本，未来可开发靶向蛋白质组学方法，在更短的时间内检测蛋白质标志物组合，类似于当前临床应用较为普遍且成本较低的基于 LC-MS/MS 的维生素D检测。未来，亦可以开发易于维护和操作的定制质谱仪作为临床诊断工具。然而，作者也指出，从商业化和可及性的角度考虑，不排除开发基于免疫法检测蛋白质标志物组合，或将免疫捕获与靶向质谱相结合用于临床诊断的可能性。

该研究成果对酒精性肝病治疗药物开发的靶点提供了参考。例如，20%上调的蛋白与受体酪氨酸激酶等信号转导通路有关，其他潜在的药物靶点如G蛋白偶联受体信号通路。此外，肝组织和血浆中的协同调节蛋白如免疫和炎症反应、细胞粘附、细胞外基质（ECM）和蛋白酶抑制，同样可能是药物开发的潜在靶标。

总之，本研究证实了先前的发现并提供了潜在的蛋白质靶标，这些靶标在酒精性肝病中具有诊断、预后和治疗价值。生物标志物组合可能适用于其他肝病病因，例如具有共同组织学特征的非酒精性脂肪肝病。未来需要在更大规模的临床队列中进行研究。

参考资料

1.Niu L, Geyer PE, Wewer Albrechtsen NJ, et al. Plasma proteome profiling discovers novel proteins associated with non-alcoholic fatty liver disease. Mol Syst Biol. 2019 Mar 1;15(3):e8793.

2.Niu L, Thiele M, Geyer PE, et al. Noninvasive proteomic biomarkers for alcohol-related liver disease. Nat Med. 2022 Jun;28(6):1277-1287. 

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