李拥军 | 基因治疗性血管生成在下肢缺血性疾病中的研究进展

基因治疗性血管生成在下肢缺血性

疾病中的研究进展

桂亮, 李拥军. 基因治疗性血管生成在下肢缺血性疾病中的研究进展. 中国普外基础与临床杂志, 2022, 29(8): 1083-1089. doi: 10.7507/1007-9424.202111071

摘  要

目的　总结基因治疗性血管生成在下肢缺血性疾病治疗中的研究进展，旨在为下肢缺血性疾病的无创治疗提供新的方法。方法　收集近年来关于基因治疗性血管生成在下肢缺血性疾病治疗中研究的相关文献并加以综述。结果　外周动脉疾病发病率逐年升高，如何有效降低严重下肢缺血患者的截肢率与病死率，仍是当前亟需解决的临床问题。大量国内外基础与临床研究结果表明，基因治疗性血管生成能够有效诱使下肢缺血组织内的血管新生与侧支循环建立，从而改善缺血区域的血流灌注。此外，多种类的新型非病毒类基因递送载体的构建也能在一定程度上提高基因治疗的安全性与有效性。结论　基因治疗性血管生成已经取得了十分不错的成果，为下肢缺血性疾病的治疗带来了新的思路与策略，但是仍存有部分问题尚未解决。

随着我国人口老龄化不断加速，外周动脉疾病（peripheral arterial disease，PAD）发病率逐年升高，60岁以上人群中发病率为 19.8%[1]，50岁以上的糖尿病人群中其发病率高达 24.1%[2]；此外，约10%的 PAD患者甚至进一步发展为严重的下肢缺血（critical limb ischemia，CLI），临床表现为静息痛（持续2周以上）、溃疡或者坏疽。CLI患者的生活质量指数与晚期癌症患者相似，且在最初诊断后5年内，其病死率超过50%[3]。传统外科手术或血管腔内治疗是目前CLI患者的临床首选治疗方法，但是仍有约30%的患者因严重的并发症不适合行手术或腔内治疗[4]。所以，通过非手术治疗改善CLI患者肢体血流灌注与相关临床症状，降低截肢率和病死率，是当前亟需解决的临床问题[5]。 

1  治疗性血管生成

Isner等[6]在 1999年首次提出治疗性血管生成（therapeutic angiogenesis，TA）的概念，即一种全新的治疗性手段，通过应用细胞因子或成血管细胞转入缺血组织，转化局部微环境来提供血管生成的环境以促进缺血组织毛细血管网络生成和侧支循环的建立，包括血管生成、动脉形成与血管发生。近 10年来，有研究[5, 7]表明，TA能够有效诱使 CLI组织内的血管新生与侧支循环建立，从而改善缺血区域的血流灌注，为 CLI的治疗带来新的思路与策略。 

1.1 血管生成

血管生成是指从已经存在的毛细血管芽生出新的以毛细血管为主的血管系统（直径 8～12 μm），延伸并扩展原有毛细血管网的过程[8]；常见于缺血组织、伤口愈合、肿瘤及心肌梗死后，缺血缺氧是其主要诱因。组织内缺氧激活缺氧诱导因子 -1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α），通过复杂的链级反应导致血管生成[9]；血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是此过程中最重要的细胞因子，其在毛细血管床的初始形成期发挥主导性作用[10]。 

1.2 动脉形成

动脉形成发生于动脉水平，指已存在的血管通过结构重塑以扩大管腔直径，形成直径 20～100 μm、富含成熟中膜的新侧支动脉[11]。研究[9]表明，1条侧支动脉的建立能使远端缺血区域内的血流灌注增加 20～30倍，效果远优于单纯毛细血管网的增加。有效建立新的侧支动脉是 TA的主要目标。已知血管剪切压力改变和炎症反应是其主要诱因[12]。剪切压力增加能激活内皮细胞释放细胞因子以募集单核细胞，进而引发炎症反应，这种炎症环境恰好是血管侧支化信号传递的重要因素之一。 

1.3 血管发生

血管发生是指内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）分化为血管内皮细胞形成原始血管的过程。过去该过程被认为仅发生于胚胎期[13]。有研究[14]报道在成人血循环中成功分离出 EPCs，从而证实成年机体内存在 EPCs分化为原始血管的过程。

2  细胞因子与基因治疗

血管生成需要多种功能性细胞因子参与。目前，国内外关于 VEGF、HIF-1α、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）和成纤维生长因子（fibroblast growth factor，FGF）的研究最为广泛。基础研究和Ⅰ期临床试验结果证实了直接使用细胞因子的促血管生长作用[15]。但大型对照研究显示其不能有效改善 CLI患者的临床症状。而且，直接使用功能性细胞因子往往难以达到有效治疗浓度，且细胞因子价格昂贵、半衰期短，需频繁使用[16]。此外，最佳剂量、给药浓度、持续给药时间及给药方式也是细胞因子疗法尚未明确与克服的难题。基因治疗可避免上述弊端，即运用载体将外源性核酸序列递送至缺血组织的靶细胞，致目的基因在局部持续表达，合成所需的细胞因子。鉴于基因治疗的诸多优势，其已成为 CLI性疾病的研究热点之一。有关基因 TA治疗 PAD的临床试验总结见表1。

表1　基因 TA治疗 PAD患者的临床试验总结

ABI：踝-肱指数（ankle brachial index）

2.1 VEGF 

VEGF是目前研究最广泛的血管生成因子，共包含 A、B、C、D、E、F和胎盘生长因子 7个家族成员；其中，VEGF-A的功能性最强、含量最为丰富，是最常见的研究对象，包含 VEGF-121、VEGF-145、 VEGF-165、VEGF-183、VEGF-189和 VEGF-206共 6个亚型[28]。目前为止，研究人员主要针对 VEGF-165开展相关基础实验与临床研究。M.kinen等[18]研究报道，通过动脉内注射腺病毒或质粒携带的 VEGF-165基因后，数字减影血管造影证实两种方法均可致缺血部位的侧支显著增多，但临床效果与对照组比较无明显差异；此外，腺病毒组患者体内的抗腺病毒抗体增加了 61%。2006年，Kusumanto等[20]报道，对 54例由糖尿病引发的严重 CLI 患者肌肉注射 VEGF-165裸质粒，结果显示 VEGF-165裸质粒能够改善患者的皮肤溃疡与 ABI（溃疡改善率方面试验组与安慰剂组对比：25.9% 比 0%，P=0.01），但无法有效降低截肢率（试验组与安慰剂组对比：13.6% 比 22.2%，P>0.05）。Ehrbar等[29]报道了一种新型 VEGF121基因递送系统，其能够长期低剂量释放 VEGF，有效诱导并改善血管形成。迄今为止，PAD 患者的 VEGF 基因治疗在Ⅲ期临床试验中未能显示出受益的证据。另外，接受 VEGF基因治疗的患者中，约 60%发生剂量依赖性下肢水肿。值得注意的是，尚无证据明确证实 VEGF与血管生成间的直接关系。与此说法相反的是，配体的浓度决定着其是起促血管生成作用还是抗血管生成作用[30]。另外，相关计算模型表明， VEGF及其受体的基因表达及活动度与其浓度存在相关性[31]。 

2.2 HGF 

HGF是一种多功能性细胞因子，其能够在抑制炎症、水肿和细胞衰老的同时发挥促血管生成的作用[32 -33]。而且， HGF能够同时诱导内皮细胞（endothelial cells，ECs）和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）迁移，但是仅促进 ECs分裂增殖而不引起 VSMCs增殖，从而防止内膜增生导致的管腔狭窄、闭塞。国内外学者进行的大量基础研究与临床试验证实了 HGF基因治疗的安全性与有效性。2001年，Taniyama等[34]通过建立糖尿病大鼠后肢缺血模型，并肌肉注射给予人 HGF质粒，结果显示 HGF基因治疗能够显著升高缺血区域内毛细血管密度。Morishita等[35]开展了Ⅰ期临床试验，对 6例 CLI患者给予肌肉注射 HGF质粒，所有受试者临床症状明显改善，且均未出现与基因转染相关的不良反应如水肿、血管瘤和肿瘤形成。随后，Morishita等[24]进一步开展Ⅱa期临床试验，结果显示 HGF质粒能够有效加速 CLI患者的溃疡愈合，缺血性溃疡最大径试验前后对比为（3.08±1.54） cm 比（ 2.32±1.88）cm， P=0.007，并缓解静息痛。2015年，Cui等[36]招募 21例 CLI受试者进行表达 HGF的裸质粒 DNA的Ⅰ期临床试验，结果同样肯定了 HGF基因治疗的安全性与有效性。此外， 2010年 Shigematsu等[27]开展了一项多中心、随机、双盲与安慰剂对照的Ⅲ期临床试验，以期评估多点肌肉注射 HGF基因质粒治疗 CLI的安全性与有效性，该试验共纳入 44例 CLI患者，最终研究结果表明，相较于对照组，HGF质粒治疗组患者的皮肤溃疡面积明显缩小、静息痛显著缓解，差异均具有统计学意义（静息痛缓解率试验组与安慰剂组对比为 70.4% 比 30.8%，P=0.014）；而且试验组患者的生活质量也得到了较大的提高。此外，尚无研究显示 HGF基因治疗会引起下肢水肿和存在其他不良副作用。凭借生物学功能多样性的优势，在众多细胞因子的基因治疗中，HGF基因治疗目前最有希望成功进行临床转化。在日本，HGF基因治疗已经被批准用于无法进行血运重建的下肢严重缺血患者。在国内，北京诺思兰德生物技术股份有限公司开发的基因治疗药物 pCK-HGF-X7，也正在由北京协和医院牵头，在包括本中心在内的全国 17家研究单位共同参与下开展针对 CLI的Ⅲ期临床试验。

2.3 FGF

研究[37]表明，组织缺血后局部内源性 FGF表达量增加，促进血管再生以适应缺血的变化，但增加的量不足以完全改善组织缺血状态。FGF有 23个亚型，但只有 FGF-1已被用于外周动脉疾病的研究。基础研究和早期临床研究均显示了 FGF-1裸质粒-NV1FGF在缺血区诱导功能性动脉的积极作用[38]。Comerota等[21]进行的Ⅰ期临床试验共纳入 51例组织坏死和静息痛的 CLI患者，他们接受了肌肉注射 NV1FGF治疗。结果显示，NV1FGF 耐受性良好，患者在 ABI、跛行、经皮组织氧分压和溃疡大小方面均有显著改善（P<0.001）。因此，NV1FGF对终末期肢体缺血患者的治疗可能有效。2008年， Nikol 等[22]共招募了 125例无法进行手术血运重建的 CLI患者，随机分配至 NV1FGF组与安慰剂对照组，NV1FGF组患者在第 1天、第 15天、第 30天和第 45天接受 4次 NV1FGF的肌肉注射（每次 4 mg，总共 16 mg），其研究结果显示，对 CLI患者肌肉注射 NV1FGF质粒无法促进溃疡愈合，但使用 NV1FGF能显著降低所有截肢（P=0.015）和大截肢（P=0.015）的风险，而且 NV1FGF能够降低 CLI患者的死亡风险。基于上述研究，研究人员又开展了Ⅲ期临床研究—TAMARIS试验[23]，共纳入 525例无法进行手术行血运重建的 CLI患者，但 TAMARIS试验没能提供任何证据表明 NV1FGF可有效减少 CLI患者的截肢率或死亡率。 

2.4 HIF-1α 

HIF-1α 是一种诱导性转录调节因子，通过对 VEGF、促血管生成素等多种血管生长因子基因的编码调控，在胞内氧稳态调节中起重要作用[39]。在缺氧条件下，HIF-1α表达并对多种转录因子进行调节，来控制血管生成。动物实验 [40]表明，HIF-1α能够有效增加毛细血管密度与侧支血管的数量。2011年，Creager等[41]报道了唯一一项 HIF-1α基因治疗间歇性跛行患者的Ⅱ期临床试验，结果显示 HIF-1α基因治疗并不能改善患者的最大步行距离。

3  新型非病毒类基因载体

基因治疗需要安全高效的基因载体来保护核酸分子，提高其体内稳定性并实现高效转染，最大限度地发挥目的基因的治疗作用。基因载体通常分为病毒和非病毒两类。凭借高转染效率和长半衰期，病毒成为了常用的基因治疗载体，但病毒载体导致的细胞毒性、免疫原性和致癌作用严重限制了它们在临床的应用[42-43]。2020 年 1 月 6 日，Science期刊在基于大型成年犬 A 型血友病基因治疗的一篇报道中再次指出，腺相关病毒作为基因载体存在潜在致癌性[44]。裸质粒作为最常用的非病毒类载体，虽然有着良好的生物安全性，但较低的基因转染效率也大大限制了其的临床应用[45]。所以，开发安全可靠、具有高基因转染效率的非病毒类基因递送载体，是当前基因治疗需要克服的一大难点。下面，笔者就对当下主要的新型非病毒类基因递送载体进行归纳与总结。 

3.1 阳离子脂质体

阳离子脂质是带正电荷的两亲分子，由 3个基本的化学官能域组成：亲水头基、疏水结构域和连接键，连接阳离子头基和疏水尾结构域[46]。通过静电与疏水相互作用，带正电的脂质体极性头部能够高效结合带负电荷的核酸磷酸基团而形成阳离子脂质体-DNA复合物，从而有效防止核酸被血液中的核酸酶降解[47]。脂质体有着良好的生物降解性，免疫原性低，但是其潜在的细胞毒性不容忽视。近年来，国内外研究者通过结构修饰和表面改性来尽可能地减少阳离子脂质体的不良反应，例如在脂质体外修饰聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG），可以减少它们与带负电荷的细胞表面的相互作用，以提高其在血液循环中作为载体的稳定性及作用时间[48]。2017年，Fisher等[49]报道将携带小分子干扰核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）的细胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）修饰的中性 PEG化的脂质体通过注射的方法来治疗心血管疾病，研究结果显示， CPPs修饰的中性 PEG化的脂质体兼具低细胞毒性与高 siRNA转染效率。上述研究结果均表明，结构修饰能够有效提高脂质体作为基因载体的治疗效果，其有望成为潜在的血管性疾病基因治疗的纳米载体之一。 

3.2 阳离子聚合物

作为非病毒类基因治疗载体之一，阳离子聚合物载体如聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）、聚氨基胺和聚氨基酯，具有较好的临床应用前景[50]。在生物 pH环境下，阳离子聚合物能够与 DNA结合形成复合物，并将 DNA压缩到一个较小的尺寸。阳离子聚合物特有的正电性使得靶细胞能够对基因纳米粒进行有效的细胞吞噬，但其易与生物体内的负电结合而不利于体内转运；同时，还存有潜在的细胞毒性。凭借较小的粒径，阳离子聚合物的改性相对容易进行。对于阳离子聚合物基因载体的改造，可以对其进行结构修饰，主要策略集中在对伯胺、仲胺和叔胺基的修饰；另一方面可以对其进行靶向修饰，例如采用生物活性基团特异性配体来修饰基因载体。通过对伯胺、仲胺和叔胺基的修饰或采用生物活性基团特异性配体对阳离子聚合物进行修饰，能够有效降低其细胞毒性[51]。此外，通过引入阴性成分或者降解性基团，可在降低阳离子聚合物潜在细胞毒性的基础上，有效提高其基因转染效率，从而提高基因纳米粒的生物利用度[52]。Liu等[53]研究发现，经羧甲基壳聚糖改性后的 PEI（carboxymethyl chitosan-PEI，CMCS-PEI）对 DNA有着较强的络合作用；体外结果表明，与传统 PEI相比，CMCS-PEI有着更好的生物相容性和基因转染效率。 

3.3 聚合物胶束

聚合物胶束是一类由两亲性表面活性剂分子构成的球形聚集体。在水溶液中分散时，其亲水性“头部”位于表面，疏水性 “尾部”位于内核。聚合物胶束具有很好的稳定性和较高的载药率，且可实现药物的可控释放。聚合物胶束最重要的特性之一，是能够增加难溶性药物的溶解度和生物利用率，水溶性差的药物可被包载在胶束的疏水核中。聚合物胶束多为由两亲性的嵌段共聚物组成的自组装颗粒，如聚乙二醇-b-聚乳酸、聚乙二醇-b-聚 ε-己内酯等。良好的生物相容性与生物可降解性是聚合物胶束的优点，但是也有着细胞摄取率低、体内稳定性差的缺点。通过受体介导、化学改性或物理改性，能够改变聚合物胶束的稳定性、释放曲线与基因包载能力。Huo等[54]尝试运用狂犬病病毒糖蛋白肽标记的 PEG化的聚天冬氨酸组成的聚离子胶束衍生物—聚乙二醇化聚天冬氨酰肼（pegylated polyasparthydrazide，PAHy）作为 siRNA递送载体，研究结果显示，相较于未修饰的胶束，PAHy有着更高的细胞吞噬与基因转染效率；动物实验结果也证实了其良好的脑靶向性。 

3.4 金纳米粒子（gold nanoparticles，AuNPs） 

AuNPs 是指直径为 1～200 nm的金单质聚合体。AuNPs有良好的分散性与形态可控性，表面修饰易于进行，适合作为基因递送载体。但其高化学稳定性使得其容易在细胞内累积，进而产生细胞毒性。研究人员通过对 AuNPs进行聚合物表面修饰，提高 AuNPs的水溶性，减少聚集，进而降低其细胞毒性。一般地， AuNPs的基因递送方式主要是与带正电荷的合成高分子结合成复合物载体而进行基因递送，或将 DNA硫醇化使其能够靶向运输至细胞质。Encabo-Berzosa等[55]研究报道， PEG修饰的聚乙酰亚胺-金纳米粒有着高基因转染效率与低细胞毒性的特点。Tian等[56]将 PEG修饰的 AuNPs作为基因递送载体，结果表明，此基因纳米粒主要分布于梗死区域，其能够有效减小心肌梗死范围，并在一定程度上提高心肌收缩力。 

3.5 硅纳米粒子（silica nanoparticles，SiNPs）

已知的是，单纯的 SiNPs无法进行基因包载，大部分研究者采用氨基硅烷修饰后再进行基因递送。通过表面改性后，SiNPs可显示出不同的细胞毒性和生物分布，阳性 SiNPs因与细胞膜作用强烈而表现为高细胞毒性[57]，中性 SiNPs则显示出良好的被动靶向能力。Sun等[58]合成了含大小介孔的、有核-壳结构的二氧化硅/有机硅纳米系统进行 siRNA与阿霉素共递送，结果表明从有机二氧化硅壳释放的 siRNA通过降低癌细胞的多重耐药性，增强了二氧化硅核心后释放阿霉素的治疗效果。 

4  结论与展望

综上所述，大量基础研究与临床试验的结果均表明，基因 TA治疗已经取得了很大的进展， HGF基因治疗在日本也已经成功应用于临床，但仍有部分问题未得到解决：①仍然需要更大样本量的循证医学证据来明确基因疗法的安全性与远期疗效；②仍然缺少完全安全可靠且具有高转染效率的基因递送载体；③体内血管生成涉及多种细胞因子的协同作用，但现有研究往往局限于单因子或者双因子，仍需要深入探究多种细胞因子间的协同作用。此外，较少的研究表明基因治疗结合干细胞治疗的效果优于单独基因治疗和单独干细胞治疗，有可能成为 CLI患者最佳的无创治疗方法，具有良好的研究价值与应用前景。

重要声明和参考文献略。

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