尿石症微生物组研究的标准化：一项国际共识协议

Standardization of microbiome studies for urolithiasis: an international consensus agreement

Kachroo N, Lange D, Penniston KL, Stern J, Tasian G, Bajic P, Wolfe AJ, Suryavanshi M, Ticinesi A, Meschi T, Monga M, Miller AW. Standardization of microbiome studies for urolithiasis: an international consensus agreement. Nat Rev Urol. 2021 May;18(5):303-311. doi: 10.1038/s41585-021-00450-8. Epub 2021 Mar 29. PMID: 33782583; PMCID: PMC8105166.

尿石症微生物组研究的标准化：一项国际共识协议

许多关于尿石症的宏基因组关联研究 (MWAS) 已经发表，从而发现了微生物组与尿石症之间的潜在相互作用。然而，由于实验技术的差异和该领域缺乏标准化，这些数据的可重复性、适用性和生理相关性仍然存在问题。解释 MWAS 的一个障碍是，在实验流程的每一步都可能引入实验偏差，包括样本收集、保存、存储、处理、测序、数据分析和验证。因此，迫切需要引入能够保持灵活性以实现特定研究目标的标准化协议。为了解决这个需求，第一个国际泌尿系结石病微生物组联盟——MICROCOSM——成立，共识小组成员被要求参加共识会议，以制定微生物组研究的标准化方案，如果他们发表了关于尿石症的 MWAS。对特定研究方案进行了修订，直到达成共识。该共识小组为典型临床微生物组-尿石症研究流程中的每个步骤生成了标准化协议，这些协议可通过安全的在线服务器公开获得。这种标准化为未来的研究奠定了基准，以促进对结果的一致解释，并共同导致有效的干预措施以预防尿路结石的发作，并且对于对其他泌尿系统疾病微生物组研究感兴趣的研究人员也将很有用。

微生物组在健康和疾病中的作用越来越受到关注和研究。高通量增强培养技术（元培养组学）和培养独立方法（如16S 核糖体 RNA (rRNA) 基因测序和鸟枪法宏基因组测序）的进步只会扩大我们探索这些关联和潜在因果关系的深度。大型项目，例如 American Gut Project 1，受益于对数千人的微生物组进行采样，并包含包括多种疾病状态的大量元数据。然而，此类大型项目因确定的特定疾病信息缺乏细微差别而受到阻碍——例如，在与美国肠道项目相关的 524 个元数据术语中，一个术语指的是肾脏疾病，三个术语与糖尿病相关，以及没有一个与尿石症或其他泌尿系统疾病有关，尽管有大量关于肠道微生物组与泌尿系统健康之间潜在联系的报道2 - 5。尿石症的患病率从 1976 年的 3.2% 上升到 2016 年的 10.1%（参考文献6），在过去 25 年中经历了流行病学的快速转变。发病年龄越来越低，性别差距正在缩小7。这种疾病给美国的医疗保健系统造成了 100 亿美元的负担8。尿石症被认为是一种多因素疾病，具有多种疾病表型，表现为不同的结石类型，包括一水草酸钙、二水草酸钙、磷酸钙、鸟粪石、尿酸、胱氨酸和药物性结石9. 一些环境和代谢风险因素可能导致尿石症的发生，例如饮食、代谢紊乱、尿液成分和体积、尿路感染和遗传易感性9。宿主基因组和宿主肠道或泌尿微生物组的变异性会影响结石是否发育和结石成分10 – 13。鉴于泌尿系结石的复杂性，确定微生物组是否以及如何促成结石的发生需要一种细致入微的方法。

自 2016年以来，已经发表了许多与培养无关的微生物组研究（参考文献 2、3、13-19 ），试图解决微生物组是否有助于尿石症发病的问题。尽管已发表的比较结石患者与健康对照组微生物组的研究有一些相似的结果，但明显的差异是显而易见的20。例如，一些微生物类群，如普氏菌属或拟杆菌属，一直被发现与尿石症有关，但关于肠道微生物群的组成是否与该疾病有关的研究并不一致。因此，关于这些宏基因组关联研究（MWAS）的可重复性、适用性和生理相关性的问题仍然存在。特别是，研究之间的结果差异是由于实验因素（如样本收集、储存、DNA提取、测序或数据分析）还是生物学偏差（如地理、种族、结石表型或其他一些区域因素）造成的。不清楚。为了回答与微生物组在结石病中的作用相关的基本问题，必须尽量减少研究之间的实验偏差，以便进行直接比较，即使研究目标不同21。因此，与尿石症相关的 MWAS 协议必须尽可能标准化，因为协议中的微小差异会极大地影响高通量测序数据的下游分析21。因此，该领域的研究人员需要就实验流程的每个步骤达成共识，以实现研究之间的统一和有意义的比较，同时保持研究特定目标的灵活性。该项目的目标是发展第一个专注于微生物组 - 尿石症研究的国际联盟（MICROCOSM - MICRObiome 对结石基质复杂性的贡献），并在该领域的研究人员之间就推荐的标准化协议达成专家共识。所有未来与尿石症相关的临床 MWAS。MICROCOSM 的成立将促进该协议标准化专家共识协议的实施，以最大限度地减少与微生物组研究相关的实验偏差和障碍，同时实现研究特定目标的灵活性。该共识声明还为相关协议、原始宏基因组数据和与结石病相关的 MWAS 的实时荟萃分析生成了一个中央存储库， 1）。该资源将使研究人员能够比较研究中的数据集，即使研究的目标不同，并且对于目前没有必要设备或专业知识在自己的机构进行此类研究的研究人员特别有用。对于任何研究领域，制定适当的研究方案是进行研究的最大障碍之一。这个集中的存储库将为未来的多机构研究提供坚实的基础，并将促进多个独立研究的结果比较，以回答关键的临床相关问题。因此，本共识声明旨在使合作研究成为可能。通过标准化协议并使其广泛可用，

框 1 链接到尿石症 MWAS 的标准化方案和更新的荟萃分析结果

存放所有协议和当前宏基因组关联研究 (MWAS) 数据的服务器。登录所需的免费帐户：

https://www.lerner.ccf.org/cms/miller/uscd/app/

链接到对尿石症进行 MWAS 的协议：

https://www.lerner.ccf.org/cms/miller/uscd/app/?route=documents/type&protocols

链接到映射文件模板。这些是为 MWAS 收集一致定义的临床元数据所必需的：

https://www.lerner.ccf.org/cms/miller/uscd/app/?route=documents/type&templates

链接到当前可用的尿石症 MWAS 数据的最新荟萃分析：

https://www.lerner.ccf.org/cms/miller/uscd/app/?route=documents/type&results

方法

召集了一个在结石病、微生物学、营养和微生物组分析方面具有丰富经验的专家小组，组成了 MICROCOSM 联盟。该联盟的 12 名成员确定了需要标准化的领域并提出了他们的建议。

共识开发过程

共识过程是使用以下步骤制定的：确定和招募专家小组以创建 MICROCOSM 联盟，确定需要标准化的关键问题和协议，根据最佳可用证据制定协议和声明，以及基于在一个财团小组会议上修改了 Delphi 技术22．

根据微生物组和尿石症研究领域的专业知识和出版物确定了该联盟的成员。具体而言，使用关键词“微生物组”和“尿石症”或“尿路结石病”或“肾结石”对 PubMed 进行了全面的文献检索，以确定 2020 年 7 月之前发表的与尿路结石相关的相关临床微生物组研究。随后联系并邀请出版物参加该联盟。在联系的 12 个人中，有 10 人同意加入该财团。一个人拒绝了邀请，一个人没有回应。

最初的通信旨在确定需要达成共识的关键问题和领域。在收到所有成员对此的反馈后，下一轮通信涉及样本收集、储存和处理（粪便、尿液和结石样本）、DNA提取方法以及测序平台和分析的所有协议的流通。对协议的反馈被收集、处理并重新分发给联合体。对所有协议进行了多轮反馈，直到收到共识协议，超过 80% 的受访者表示强烈同意或同意有一些小的保留意见。

大多数 MICROCOSM 成员的成立会议于 2019 年 12 月 7 日在美国马里兰州 Linthicum 的 StoneLab 科学研讨会上亲自举行，以完善和进一步讨论共识点。选择此会议地点是因为大多数联盟成员都出席了现有的研讨会，但联盟与 StoneLab 研讨会之间不存在其他从属关系。通过电话会议和电子邮件通信与未亲自出席的财团成员会面和讨论。

MICROCOSM 共识小组

组成 MICROCOSM 联盟的专家小组由 12 名专家组成，成员来自北美、欧洲和亚洲的学术机构。成员包括五名泌尿科医师、两名专门研究肾结石疾病的内科医师、四名微生物学家和一名营养师，他们都具有在尿石症和微生物组方面的研究经验。所有包括在内的联盟成员都是本共识声明的共同作者。

专家小组确定了需要标准化的六个类别：元数据收集；样品采集; 样品的保存、储存和处理；DNA提取；高通量测序，包括测序方法、平台和数据分析；和元文化组学。

值得注意的是，这一共识是基于撰写本文时可获得的最佳证据，并且方法可能会随着科学的发展而改变；因此，未来可能需要更新协议。因此，联盟成员将根据需要开会讨论更新协议。

结果

通过上述共识程序，MICROCOSM 专家小组为 MWAS 中的所有实验步骤制定了建议，从元数据和样本收集到样本分析和元培养组学。

元数据收集

收集适当的临床元数据对于使研究实验室结果与不同临床参数相关联并提供复杂疾病（如尿石症）所需的细微差别至关重要。尽管联盟成员认识到收集的元数据部分基于特定的研究目标，但联盟成员确定了应该收集的特定于尿石症的元数据，这些元数据被分组为样本变量、患者变量、结石变量、抗生素变量、过去病史、胃肠道变量、实验室值和饮食史（表 1）。为了促进元数据的收集，MICROCOSM 开发了一个结构化问卷，其中包含从患者病历中不容易获得的大多数变量，并创建了用于记录这些元数据的模板文件，这些文件可供下载（表 1, 补充资料1 )。对于希望开始为其患者收集数据的研究人员而言，这份综合问卷是一个有用的资源，对于临床和研究目的都很有用。提供的元数据类别和问卷旨在用作基线，可以针对特定的研究目标进行修改。

表格1 可用的 MICROCOSM 共识协议协议列表

协议

描述

补充信息或服务器中完整信息的位置

IRB，机构审查委员会；MWAS，宏基因组关联研究。

样品采集

与任何临床研究一样，首先应进行功效分析以确定研究目标所需的样本量——Evident 23和 msWaldHMP 24等统计软件包已专门用于微生物组研究的功效分析。构建并商定了几个样本收集协议，这些协议已在之前的微生物组研究中得到验证。一致同意的协议包括收集中游排尿和粪便样本的技术，这些技术由患者自己执行，以及结石收集和导管或上尿路 (UUT) 尿液收集的协议，这些都是进行的由医生（表 1）。

在泌尿道内，不同的解剖生态位具有不同的微生物群落3、13。这些包括 UUT 利基，可以使用放置在输尿管和肾盂中的开放式输尿管导管进行膀胱镜检查，或通过肾盂内的输尿管镜或一旦获得经皮肾脏通路，使用无菌注射器抽吸尿液25 . 需要来自这个解剖生态位的尿液来获取机械地参与结石形成的微生物。这种细菌存在于结石形成的直接附近，可以直接影响代谢物的成岩潜力或通过生物膜的产生将矿物质结合在一起26. 在 UUT 的下游，可以通过导管插入术或耻骨上抽吸物对膀胱壁进行采样，可以通过拭子（仅远端尿道）对尿道进行采样，并且可以使用拭子对尿道进行采样。在结石微生物组研究中，可能会要求研究参与者提供粪便样本、尿液样本和/或结石样本。粪便样本将由研究对象使用粪便收集套件和方案自行收集（补充信息1，第 18-21 页）。我们建议使用马桶内收集系统（例如 Fisher Science Catalog #2544208）收集粪便，以确保对微生物组进行充分代表的采样。应根据适当的方案从所有研究参与者处采集尿液样本（UUT、导管插入或中流排尿样本），无论是在诊所、术前区域还是使用家用套件（补充信息1，第 11-14 页） ）。对于自行收集的中流排尿，我们建议使用 Peezy Midstream 尿液收集装置 (Forte Medical) 以减少潜在的污染。尽管可以使用替代设备，但 Southworth 等人 2019 年的一项研究。27发现，当用于尿液微生物组分析时，Peezy 系统的污染低于标准尿液收集杯。专家组建议在取石术前和术前或围术期使用抗生素（视情况而定）之前采集粪便和尿液样本（特别是为了消除因结石患者立即使用抗生素而产生的任何假阳性，但在对照组）或在手术过程中由临床医生在 UUT 或结石样本的情况下进行。应在手术过程中收集结石样本以进行移除（输尿管镜检查或经皮肾镜取石术），并将部分样本送去进行临床成分分析。至少应有 500 mg 的石头样本可用于 DNA 提取，以便为下游处理提供足够的生物量3 , 13. 该联盟建议石样应用无菌 PBS 冲洗以去除潜在的宿主细菌污染，在液氮中快速冷冻并用子弹式搅拌器3、13粉碎。粉碎后的石粉可用于 DNA 提取。专家组一致认为，用于科学严谨性研究的尿液质量等级理想情况下是 UUT 尿液，然后是导管插入或抽吸尿液，然后是中流排尿。为了了解泌尿道的机械微生物学，如果可能，必须从 UUT 或导尿管中取样。如果研究人员只能获得无效的尿液样本——例如涉及无法获得 UUT 或导尿管尿液的对照患者的研究——研究人员必须意识到与解释这些数据的机械基础相关的局限性。中游尿液样本通常不是“干净的”，这些样本主要从男性和远端尿道的尿液样本中对远端尿道和尿道周围和其他污染物进行采样，28 - 30。该联盟认识到，从患者之间不同的泌尿解剖壁龛中提取的样本（例如，一名患者的 UUT 与另一名患者的排尿）无法从微生物群分析的角度提供准确的比较。

出于命名目的，该联盟同意来自排尿样本的微生物组数据应称为“泌尿生殖器微生物组”，来自导管尿样的数据应称为“膀胱尿微生物组”，来自 UUT 的数据应称为“肾尿微生物组” .

样品的储存、保存和处理

尿液和结石样本应保存在 4 °C 的防腐剂（计划培养时为硼酸或计划测序时为 AssayAssure 31）中，然后在收集后 24 小时内在 -80 °C 下储存。对于尿液样本，如果尿液样本在室温下储存超过 1 小时31 ，AssayAssure 可以最大限度地减少微生物群落的变化；如果尿液样本在 1 小时内冷冻，则不需要 AssayAssure。值得注意的是，如果计划进行下游代谢组学分析或其他临床分析，例如针对代谢风险因素进行 24 小时尿液收集，则不推荐使用硼酸或 AssayAssure，因为硼酸或其他防腐剂会导致尿液代谢物发生显着变化31，32. 在这些情况下，联盟建议对尿液等分试样进行二次取样并将其放入防腐剂中用于下游微生物组分析，而另一个不含防腐剂的样品用于代谢组学分析。所有样品都应在干冰上转移或与冰袋一起装在聚苯乙烯容器中运输，并在实验室收到后立即储存在 -80°C。应避免重复冷冻和解冻样品，因为它会通过不均匀地裂解样品中的细菌，然后降解 DNA 33来影响微生物群落组成。对于粪便样本，将对收到的样本进行粪便等分吸管技术34. 该技术已经过验证，既可以在下游分析之前最大限度地减少微生物组的变化，又可以为元培养组学或体内研究提供合适的材料。粪便样本必须在收集后 24 小时内达到 4°C，并且没有冻结迹象，以防止反复冻融循环，这可能导致细菌溶解并改变微生物群落。在生物罩内，应在整个粪便样本中插入四根样品吸管，前提是有足够的粪便材料；如果没有足够的材料，应插入尽可能多的吸管。填充后的吸管应速冻并储存在 -80 °C 的 15 毫升无菌试管中（每管两根吸管）。粪便等分吸管技术的好处是，除了保存样本用于宏基因组或其他组学分析外，已经构建了样本收集和处理的协议（补充信息1，框 1）。协议包括临床元数据定义、从患者那里收集相关信息的样本问卷、中流尿液的收集、UUT 尿液的收集、粪便的收集、DNA 样本的处理以及用于生物信息学分析所需的映射文件的模板。

DNA提取

为了确保从所有样本中一致地提取 DNA，共识协议是使用自动化 DNA 提取过程，这减少了用户偏差的数量并提高了微生物组数据的一致性35。对于所有 DNA 提取，包括无菌水和所有提取试剂的阴性对照应与每组样品一起包括在内；阳性对照应包括与每个测序批次一起运行的商业标准化混合微生物群落样本。随后，专家组建议应使用凝胶电泳验证所有提取物，并使用 Nanodrop 分光光度计或 Qubit 荧光计 (Thermo Scientific) 量化浓度。我们建议对所有样品进行测序。任何制备的阴性对照都不应该有任何可量化的 DNA，但它们应该与阳性样本平行测序，以帮助识别测序错误和可能的污染。在阳性对照中以非零丰度存在的任何不属于模拟群落成员的类群都应作为污染物从所有样品中去除36。建议对低生物量样本（例如导管插入的尿液或结石样本）至少进行两次测序，以确保可重复性13。重复样本应使用相异性指数进行比较，例如系统发育UniFrac 37或非系统发育Bray-Curtis38以确定是否存在排序伪影。对于结石和尿液样本，我们建议仅将至少具有 2,000 个读数但理想情况下 >3,000 个读数且与阴性对照不相似的样本用于下游分析。对于粪便样本，仅应使用大于 10,000 个读数的样本。这些读取阈值已在过去的研究中根据经验确定为充分代表石头、尿液和粪便样本3中存在的多样性。

测序和数据分析

测序的建议是配对末端测序，分别使用 16S rRNA 基因的 V4 区域或在 Illumina MiSeq 或 HiSeq 上进行鸟枪法宏基因组测序；对于后者，Illumina 的 NextSeq 或 Novaseq 也是可能的。Illumina 平台产生更长、更准确的读数，比其他当代平台具有更高的吞吐量，并且是最广泛用于微生物组研究的平台39。如果这些平台不可用，则可以使用其他测序平台，因为引物的选择对下游数据的影响大于特定的测序平台。自动化分析管道，可免费获得资源（方框 1)，旨在以一致的方式分析尿石症 MWAS。自动化管道能够处理 16S rRNA 和鸟枪法宏基因组数据。使用此管道，用户上传原始测序数据和带有临床元数据的映射文件作为输入，然后处理数据以生成每个样本的微生物图谱。该管道执行统计比较，以确定哪些分类群（16S rRNA）或基因（鸟枪法宏基因组学）在单向和双向分析中与尿石症正相关或负相关，以确定哪些临床元数据以影响尿石症的方式与微生物组相关联。该管道单独分析新数据集，然后将新数据集与所有以前的数据集合并，以在获取新数据时生成更新的元分析（图 1）。 1, 方框 2 )。已经开发了多种分析程序来处理高通量 16S rRNA 数据，包括 QIIME 41、Mothur 42和 DADA2（参考文献43）。我们的自动化管道中使用了这些管道中的几个脚本。总结管道中的分析步骤（图 1）。 1)，使用 fastq-join 44连接来自每个正在分析的研究的配对末端读数；使用 QIIME 1.9.1（参考文献45）中的默认参数对读数进行质量控制、修剪和解复用。解复用后，使用开放参考策略将读数分配给DADA2 中的扩增子序列变体(ASV)，其中 Silva 138 SSURef 和 NCBI 数据库46用作映射的初始参考。与参考数据库不匹配的读数随后从头开始聚类，每个聚类的代表性序列用于分类。低丰度 ASV（单个数据集中 <10 个读数）、嵌合体和归类为线粒体或叶绿体的 ASV 从进一步分析中移除3. DECONTAM算法用于去除样品中的污染物。使用 QIIME 中的 merge_otu_tables.py 脚本合并数据集，并使用 DESeq2 规范化协议对合并后的表进行规范化，该协议可纠正样本间的测序深度和成分偏差

图。1微生物组数据分析工作流程。

该流程图说明了鸟枪法和 16S 研究数据上传后的分析步骤，这些步骤在上传到安全分析服务器时自动执行。OTU，操作分类单位。Alpha 和 Beta 多样性使用系统发育指标、PD_whole_tree 和加权 UniFrac 距离矩阵50、51进行计算。使用 DESeq2 算法49评估比较研究人群中个体之间 ASV 的差异丰度. 为了确定最失调的分类群，将显着不同的 ASV 减少到最低分配的分类，并将分配给这些分类群的显着不同 ASV 的数量归一化为整个数据集中分配给这些分类群的 ASV 总数。归一化到分类群多样性的值被列为与对照人群中具有较高值的那些分类群更健康相关，或与那些在结石病人群中具有更高值的分类群更相关的尿石症52。对于与肠道和泌尿道微生物组相比多样性较低且没有用于比较的对照群体的结石相关微生物组，通过根据数据集中所有样本的平均相对丰度对每个 ASV 进行排名来确定最可能相关的分类群.对于鸟枪宏基因组数据集，数据在分析服务器上通过并行 meta3 管道进行处理，该管道提供广泛的分析，包括用于 α 和 β 多样性分析的 16S rRNA 基因序列提取，以及多个功能分析和网络分析53级。

方框 2 MICROCOSM 服务器接口

一旦登录到安全的在线服务器，用户就可以访问使用说明、所有一致同意的协议、16S 和鸟枪宏基因组测序所需的映射模板、来自所有以前的宏基因组关联研究的原始数据和结果文件，以实现数据共享，以及上传新数据的方法。MICROCOSM 服务器主页分为许多不同的部分：

指示

• 包括有关如何进行微生物组研究和使用服务器的说明

• 还涵盖有关下载协议、映射模板和结果以及进行微生物组临床研究、如何进行测序和分析以及如何上传数据的信息

• 协议

• 粪便、尿液和肾结石的收集和储存

• DNA提取测序

• 元文化分析

• 用于临床研究的问卷

映射模板

• 包括一个用于 16S rRNA 的映射模板和一个用于鸟枪宏基因组学的映射模板，每个模板都需要不同的格式

• 目前，shotgun 宏基因组学管道仅用于查看与尿石症的关联（而非元数据）

上传的数据文件

• 测序文件将包括映射文件的正向、反向和条形码文件名，如补充信息 1 所示，或解复用读取的文件夹

• 上传数据时，会询问用户文件或目录的名称，映射文件的名称以及数据是16S还是shotgun

结果

• 结果将显示在一系列目录中

• 每项研究将有一个目录和一个附加目录，用于对所有 16S 研究进行荟萃分析

综述

为了交叉验证测序结果，确保检测到的细菌来自结石而不是周围的尿液，并分离细菌以进行机理研究，该联盟建议使用元培养方法（表 2）。已针对尿液和结石样本13开发了扩展的定量尿液培养方案，而针对粪便样本54开发了其他培养组学方法。对于扩展的定量尿液培养方案，将大量样品（10 µl 和 100 µl）置于各种培养基上，包括血琼脂、巧克力琼脂、粘菌素和萘啶酸琼脂以及 CDC 厌氧菌血琼脂。这些板在多种大气条件（需氧、厌氧、5% CO 2）下孵育 48 小时；最低检测阈值为每毫升 10–100 个菌落形成单位13。对于粪便样本，其分类和代谢多样性高于尿液和结石样本3，需要更广泛的条件来充分捕捉存在的多样性。相对于捕获广泛的多样性，最成功的培养条件包括在有或没有瘤胃液、海洋肉汤或胰蛋白酶大豆肉汤的血琼脂中进行需氧和厌氧培养54。使用规定的条件在肉汤中预培养粪便或尿液样本（表 2)，通常会增加分离细菌的多样性，因为预培养会使样品中的所有细菌都处于活跃的代谢状态13、54。值得注意的是，可以通过使用专门的媒体类型和/或条件来定位特定的分类群或代谢功能，并且可能是其他机械研究所必需的。例如，使用以草酸盐作为唯一碳源和能源的培养基，研究人员先前分离出产酸草酸杆菌，这是一种有助于减少吸收到血流中的膳食草酸盐量的细菌55。其他代谢组学分析指出与乳杆菌属相关的特定尿液代谢物。与尿石症呈负相关3 . 需要进行旨在以机械方式验证这些代谢物对成岩作用的影响的研究，以及这些代谢物的来源。

表 2 从尿液和肾结石13或粪便54中分离细菌的培养条件

媒体

温度

气氛

预孵化

潜伏期

为了分离细菌，应将琼脂板上形态不同的菌落划线到相同培养基的新鲜平板上进行分离，然后在 -80 °C 下保存在 10-15% 甘油中，以供将来通过测序或基质辅助激光解吸和/或电离飞行时间和机理研究。

开发集中存储库

所有共识协议、元数据文件模板、进行 MWAS 的说明、每项研究的原始测序数据以及单个研究和荟萃分析的结果文件都放置在安全、加密的服务器中（框 1，补充信息1）。重要的是，尽管所有协议都已通过 MICROCOSM 联盟的验证和标准化，但根据这些协议进行的所有临床微生物组研究都必须在研究人员自己的机构获得机构审查委员会的批准，然后才能开始研究。

未来发展方向

众所周知，许多生物学和实验因素会影响微生物组的组成，例如种族、饮食、性别和药物56。此外，宏基因组研究中的实验方法被广泛接受，对下游数据和解释21有很大影响。样本采集、保存和储存、DNA 提取、文库制备和 DNA 污染都会影响宏基因组的分类和功能组成57 – 64. 因此，对潜在实验偏差的关注为需要尽可能标准化实验方法提供了驱动原理，以便确定以尿石症特异性方式影响微生物组组成的实验和生物和/或环境因素。开发基于微生物组的可行疗法以预防尿路结石的发作和复发将取决于对影响微生物组和尿石症的环境因素的可靠评估。因此，区分与结石病相关的微生物组研究中的实验偏差和生物学偏差将需要整个领域的实验方案标准化。反过来，标准化将能够比较研究之间的结果，并扩大以前没有能力进行 MWAS 的研究人员可以进行的 MWAS 的数量。该共识协议的结果提供了一个急需的框架，可用于实现这一关键目标。然而，值得注意的是，样本采集、储存、DNA 提取、为了超越相关研究并了解微生物组对尿石症的贡献的机制基础，必须从粪便、尿液或结石中分离出细菌。Metaculturomics 采用广泛的培养基类型和培养条件来广泛捕获样品中存在的细菌多样性，已被证明是概括人类来源样品中存在的多样性的有效手段13 , 54。这些方法已被用于成功培养许多以前未被检测到或被认为无法培养的细菌物种，例如来自丹毒梭菌属、迪尔马属和酪球菌属的物种等65，因此，是获得通过不依赖于培养的研究被认为很重要的细菌的有效方法。该共识协议和专家组的建议对于目前没有进行此类研究所需设备或专业知识的研究人员特别有用，因为该协议提供了一种持续收集样本并将其运送到配备有进行 MWAS，并为那些对泌尿外科其他领域微生物组研究感兴趣的人提供指南。

结论

本共识声明描述了第一个国际多机构尿路结石研究微生物组联盟 (MICROCOSM) 的发展和共识协议的制定，该共识协议提供了一种标准化、经过验证的方法和明确的研究方案，以及开发强大的分析平台，将使用独特的安全在线服务器广泛免费提供。这项工作为该领域设定了基准，并为进一步基于微生物组的研究提供了未来资源，并促进了多机构合作推进结石病微生物组研究。