尿液微生物组和尿石症

The Microbiome and Urolithiasis: Current Advancements and Future ChallengesCite this article

Patel, S.R., Ingram, C., Scovell, J.M. et al. The Microbiome and Urolithiasis: Current Advancements and Future Challenges. Curr Urol Rep 23, 47–56 (2022). https://doi.org/10.1007/s11934-022-01088-8

微生物组和尿石症：当前的进展和未来的挑战

本综述的目的是探讨微生物组对尿石症的影响，并探讨尿石症微生物组研究的最新进展和挑战。尿石症的尿液微生物组研究缺乏标准化和研究设计存在缺陷，阻碍了结果的普遍性，削弱了研究结果对临床实践的影响。重要的研究限制包括样本异质性、标本污染、培养产量低以及缺乏用于荟萃分析的共享数据集。与传统教学相反，泌尿生殖道不是无菌环境。这种尿液微生物组可能会影响尿石症的发病机制，尽管目前仍在探索具体机制。成功的调查将取决于研究设计和分析的一致性，以及跨机构共享数据和协议。了解泌尿微生物组与尿石症之间的关系可能会导致降低结石风险的新方法。

在过去的几十年中，尿石症的患病率逐渐增加，在美国人群中的终生患病率为 14% [   1   ]。尿石症的经济负担包括直接和间接成本（例如，生产力下降），每年的医疗保健支出为 50 亿美元 [   2   ]。为了减少尿石症的发病率和经济负担，研究人员试图确定尿路结石形成的易感因素。为此，新一代测序技术的进步揭穿了泌尿系统无菌的传统教义  。在健康个体中，泌尿生殖道内的多种细菌混合物（通常水平较低）被称为泌尿微生物组。  与肠道微生物组的研究相比，尿液微生物组的研究仍然相对不足  。泌尿微生物组的生物多样性可以有很大差异，在任何给定时间存在 1 到 51 个细菌属 [ 3   ]。这种广泛的差异可归因于多种因素，包括性别、种族、合并症、基因组测序技术、尿液收集方案和  污染[   8、9、10 ]  。随着测序技术的改进，尿液样本的形态分析和详细的分类分析更加可行，同时消除了常规尿液培养的假阴性结果  。现在可以通过一种称为 16S rRNA 测序的技术扩增 16S rRNA 的细菌基因以识别细菌。在此过程中，细菌 DNA 被分离并与 rRNA 引物聚合。通过 rRNA 基因的扩增，生物学家可以对细菌属进行分类并进行复杂的生物信息学分析（图 1  ）。

图。1

16S rRNA 测序是用于分析微生物组的最常用方法。( A ) 含有环状 DNA 和由 2 个亚基组成的核糖体的细菌，其中较小的含有 16S rRNA。( B ) 在细菌 DNA 中，编码核糖体中使用的 16S rRNA 的 16S rRNA 基因在整个进化过程中得到了极好的保护，因为它是细菌蛋白质合成的必要性。（C）因为它保存得非常好，16S rRNA基因对细菌物种是特异的。因此，它可以通过 PCR 扩增并测序以确定微生物组中存在的细菌类型。( D ) 有机体分类系统和 ( E ) 分类系统示例。使用 BioRender.com 创建

生态失调是指自然微生物组在受到伤害后发生改变，随后这种改变的微生物组对疾病发展产生负面影响。与各自的无病人群相比，许多泌尿系统疾病，包括尿路上皮癌、间质性膀胱炎、慢性尿路感染和尿石症，都与泌尿系统的明显细菌定植有关 [   6   ,   12   ,   13   ,   14   ]。这种相互作用会通过影响泌尿环境而加剧某些疾病，尤其是尿石症 [   15   ]。一个众所周知的例子是鸟粪石形成与尿道中产生脲酶的细菌之间的关联 [   16  ]。尿液中的细菌作用，即使是低水平的，也可能改变环境并使平衡倾向于钙基和其他非鸟粪石的形成。例如，谢等人。分析了草酸钙结石形成者，并通过 16 s rRNA 测序证明，与对照组相比，结石形成患者泌尿系统中的微生物群多样性显着降低 [   17   ]。利用类似的方法，其他研究表明，尿细菌可能会诱导晶体聚集和非感染性结石沉淀 [   18   ]。虽然没有明确定义，但某些石头类型的生物多样性可能会有所不同。

本综述的目的是总结与尿石症相关的泌尿微生物组研究的最新进展和局限性。我们还旨在提供建议以减轻这些局限性并改进未来的研究设计。我们希望强调方法学在表征尿液微生物组方面的重要性，以便准确推断数据以进一步了解尿石症。

尿路微生物组在尿路结石病中的作用

泌尿微生物组提供了尿路上皮所缺乏的独特的代谢和功能能力，这是被称为互惠关系的一部分。例如，宿主为构成泌尿微生物组的细菌提供营养、pH 调节和氧气，而微生物则有助于在泌尿道中建立强大的免疫系统。常驻微生物组的破坏与宿主健康的损害有关，这些损害表现在各种疾病过程中，例如肿瘤、尿路感染 (UTI)、细菌性阴道病和炎症性肠病 [   19   ,   20   ]。在尿石症的发病机制中，细菌多样性减少可能是生态失调，这可能导致结石形成 [   21   ]。

我们对微生物群在尿石症中的作用的理解始于1985 年在消化系统中发现草酸盐降解细菌 ( Oxalobacter formigenes ) 。O. formigenes是肠道微生物群的定殖者，它利用草酸辅酶 A 脱羧酶在肠腔内将草酸盐分子转化为 ATP，从而限制可吸收的草酸盐的管腔供应 [   22   ]。观察性研究指出，与没有尿石症的患者相比，患有尿石症的患者粪便样本中的草酸杆菌定植率显着降低 [   23   ,   24   ]。此外，大量的草酸杆菌发现定植与 24 小时尿草酸盐水平成反比 [   25   ]。有趣的是，由于草酸杆菌定植的作用，结肠会通过分泌更多的草酸盐来对肠腔中较低水平的草酸盐作出反应，从而提供进一步的高草酸尿保护作用 [   26   ]。

生物多样性——生物群落中生物的多样性和丰富度——可能在确定泌尿道和消化道与尿石症相关的复杂相互作用方面发挥关键作用。唐等人。证明与对照组相比，形成肾结石的患者肠道微生物群的生物多样性减少和促炎细菌水平升高更常见 [   27   ]。同样，在结石形成者中已经注意到尿生物多样性减少导致功能途径改变（例如，某些离子通道的相对表达和功能）[   17  ]。随着生物多样性的增加，尿液中的细菌可能通过多种机制影响尿石症的风险，包括晶体聚集、柠檬酸裂解酶的产生以及细菌与肾小管上皮的相互作用导致结石基质蛋白增殖 [   28   ]。因此，泌尿微生物组的整体生物多样性，而不仅仅是存在的特定生物，可能在尿石症发病机制中起关键作用。

为了研究泌尿生殖系统内不同位置微生物组变异的可能性，我们小组研究了同侧肾单位中的尿液生物多样性，并与对侧未接受过结石的肾单位样本进行了比较。在单侧结石形成者中，与未受影响的肾脏单位相比，结石形成的肾盂中的微生物组发生了变化（未发表的数据）。先前的研究还发现，肾盂样本中最主要的细菌属是显着独特的，这取决于该肾脏中是否形成了结石 [   29   ,   30   ,   31  ]。这种细菌多样性的差异可能在由无定形碳酸钙磷灰石组成的兰德尔斑块-结石界面的形成中发挥作用，这对于“  钙基结石  ”中结石形成的发病机制至关重要（见下文）。证实这一假设需要更大规模的研究。

钙基结石

草酸钙和磷酸盐肾结石是迄今为止最常见的亚型，占尿石症的近 80% [   32   ]。毫不奇怪，大多数评估泌尿微生物组在结石病中作用的研究都集中在钙基结石上。兰德尔的斑块被认为是钙基结石形成的关键步骤。它们由无定形磷酸钙（羟基磷灰石）组成，这种物质曾经被认为是由纳米细菌沉积的（细胞毒性细菌样颗粒，可在肾上皮上产生球形沉积物以引发结石形成）[   33   ]。Randall 的斑块在尿路上皮受损的收集系统区域发展，通过与尿蛋白的相互作用，斑块发生结晶 [   34  ]。Wang 及其同事试图确定特发性草酸钙结石形成物 (ICSF) [   35   ] 的易感泌尿因素。根据经皮肾镜取石术中发现的 Randall 斑块数量——高 (> 5%) 斑块覆盖率与低 (< 5%) 斑块覆盖率，将 42 个 ICSF 分为两组。令人惊讶的是，与高斑块形成者相比，具有低斑块形成的 ICSF 具有更高的阳性结石培养率。这项研究也是第一个证明具有低斑块覆盖率和高斑块覆盖率的肾脏收集系统被不同细菌定植的研究之一（棒状杆菌、大肠杆菌、阴道加德纳菌、肠球菌、假单胞菌) [   35   ]。作者假设低斑块形成者中的微生物群可能间接为结石形成提供病灶。然而，尽管有这些发现，但由于缺乏更具体的测序技术，样本量很小，并且阴性培养率很高（85%）。

在草酸钙结石形成者中，19-32% 的尿液培养物呈阳性，通常是不产脲酶的大肠杆菌。[   35、36   ]  。_ 这些细菌本身是否有助于结石的形成，或者只是在现有结石中定居的旁观者，目前尚不清楚。也许这两种机制都是有效的。在鼠草酸钙模型中，泌尿道中的大肠杆菌表现出选择性聚集在一水草酸钙晶体上和周围，导致沉积增加 [   37   ]。在带有大肠杆菌的结石成型器中与对照组相比，这些细菌的外膜囊泡具有更大的草酸钙结晶促进活性、晶体生长和聚集性 [   38   ]。此外，在体外，用钙结石培养的葡萄球菌和链球菌物种增强了晶体聚集。同样，与对照组相比，肺炎克雷伯菌已被证明可增加钙结石结晶 [   39   ]。目前的数据支持特定物种可能在基于钙的岩石形成中发挥关键作用，尽管导致尿石症的确切细菌特征在现有研究中并不一致。

在一项前瞻性队列研究中，52 名肾结石患者接受了 16S rRNA 测序，对膀胱尿液和结石样本进行了提取 [   40   ]。他们发现葡萄球菌、肠杆菌、大肠杆菌、棒状杆菌和乳杆菌属的细菌群落存在于“  钙基结石  ”中，与膀胱尿液样本相比，结石样本中的丰度增加 [   40  ]。这表明结石与尿液样本存在不同的微生物环境。然而，研究中的受试者在确定结石治疗和样本采集时接受了围手术期抗生素，显着混淆了这一分类数据。在类似的研究设计中，Zampini 等人。对 43 名健康受试者和 24 名患有活性钙基结石的患者进行了 16S rRNA 测序 [   15   ]。他们报告了尿石症患者中抗生素的使用率更高，并报告了抗生素驱动的微生物组从预防尿石症到促进尿石症的转变。具体而言，尿乳酸菌与结石形成减少有关，而肠杆菌科与风险增加有关 [   15   ]。尽管文献中并未一致确定特定细菌会增加或降低尿石症的风险，但肠杆菌科是一个常见的物种家族，在多项里程碑式研究中被确定为促进结石 [   15   ,   35   ,   40   ]。此外，放线菌、葡萄球菌、大肠杆菌和棒状杆菌的水平升高与钙基结石有关 [   40   ]。大量乳酸菌的相关性不太清楚。一项研究报告了保护作用，而其他研究表明对结石形成没有影响 [   15   ,   40   ,   41   ]。方案设计、尿液收集和污染方面的差异很可能导致其中一些差异。唉，这些研究中的大多数都没有适当的能力证明生物学变异的临床显着差异。

有趣的是，高血压可能会影响钙基结石患者的尿微生物组。为了了解高血压对尿石症患者微生物组的作用，Liu 等人。分析了 50 名钙基肾结石患者 [   41   ]。他们进行了膀胱镜膀胱抽吸，以获取肾结石患者的尿液样本。在基因组分析过程中，他们证明高血压患者的尿石症可能具有独特的尿液微生物组谱，其中含有更多的葡萄球菌、酸氧菌、加德纳菌和乳酸杆菌[   41  ]。尽管有必要进行进一步调查，但这一令人兴奋的数据表明，尿石症中的泌尿微生物组可能是一个复杂的系统，与多种疾病过程相互作用并影响着多种疾病过程。

非钙基结石

在非钙基结石中，尿酸结石和鸟粪石分别占所有尿石症的 8-10% 和 8-7% [   1   ]。胱氨酸结石是肾单位内胱氨酸转运蛋白遗传缺陷的结果，占肾结石的 1-2% [   42   ]。对于胱氨酸结石，尽管有明显的遗传因素导致形成，但个别患者有时会出现单侧结石形成多年。尿液微生物组可能会影响单侧胱氨酸结石形成的相对风险。然而，文献中没有数据可以证实或反驳这一令人兴奋的假设。因此，有必要进行进一步调查。

鸟粪石可以表现为鹿角状结石（例如，大的分支肾结石），由磷酸镁铵组成。它们与产生脲酶的微生物（例如变形杆菌、葡萄球菌、克雷伯氏菌、普罗维登斯菌、假单胞菌和脲原体）引起的尿路感染密切相关[   43   ]。这些结石通常有一层厚厚的生物膜，上面密布着不产生脲酶的细菌（通常是大肠杆菌）) 会污染培养物，但似乎不是结石形成的主要原因。为了了解鹿角结石的微生物群与周围尿液之间的关系，Shafi 等人。对来自 45 名受试者的结石和尿液样本进行培养，结果显示阳性生长的结石和尿液样本分别只有 22.3% 和 35.5% [   41   ]。只有 70% 的尿液和结石培养物一致，这表明即使在患有鸟粪石结石的患者中，结石与泌尿道中的微生物环境也可能在同一患者体内有所不同。这项研究的一个显着局限性是缺乏稳健的基因组测序 [   44   ]。同样，在更大的鸟粪石队列中（N = 100），Tavichakorntrakool 等人。旨在表征经皮肾镜取石术期间周围尿液和结石基质中的细菌 [   36   ]。他们报告说，尿液和结石基质中最常见的细菌是大肠杆菌，只有 30% 的培养物对产脲酶细菌呈阳性反应。这项研究的结论也很有限，因为没有使用测序方法并且被手术干预混淆了。此外，感染结石的围手术期抗生素可能会在样本采集之前改变天然微生物组。然而，这些结果表明脲酶阴性物种可能在鸟粪石形成中起作用。需要更多的研究来阐明微生物组在鸟粪石形成中的作用。

关于微生物群对尿酸结石的影响的数据有限。尿酸酶是在人类和微生物中发现的一种酶，可将尿酸转化为尿囊素（例如，嘌呤消除途径）[   45   ]。穆罕默德等人。描述了迄今为止检查尿酸结石形成者（40/100 名患者）的最大系列，并研究了他们的尿液微生物组，以确定尿酸酶分泌细菌的趋势 [   46   ]。作者没有发现尿酸结石形成者和非尿酸结石形成者之间细菌种类的任何趋势（n  = 60）；他们确实注意到克雷伯氏菌表达了最有效的尿酸酶 [   46   ]。

文献中的局限

技术的快速创新极大地促进了我们对泌尿微生物组的理解。然而，即使有了这些进展，也有一些挑战限制了尿液微生物组数据的外推，因为它与尿石症有关（表  1  ）。

表 1 尿石症和微生物组研究综述  

样品异质性

以前的研究已经结合各种结石成分来表征尿石症中的尿液微生物组 [   36   ,   46   ,   47   ,   48   ]。尽管钙基结石是微生物组研究的主要焦点，但结石成分的异质性可能会掩盖有关生物多样性和物种丰度的结论。例如，草酸钙结石的一水合物和二水合物分子的相对组成可能会有所不同，这些差异可能会影响微生物特征的相关性。由于结石成分不同，研究队列之间的测序数据可能会有很大差异，而没有明确的模式来概括结论。例如，沙菲等人。证明大肠埃希菌，葡萄球菌和解脲脲原体是在由三种不同结石成分组成的队列中发现的重要细菌 [   48   ]。在一项包含五种石头成分的研究中，Mohamed 等人。据报道，与对照组相比，普罗维登斯菌属、链球菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、柠檬酸杆菌属和变形杆菌属在结石形成者中 [   46  ]。即使在这两个相似的研究设计之间，考虑到最终队列中存在的不同比例的结石成分，提议的结石形成微生物组也明显不同。此外，鉴于研究队列中发现的较低患病率和异质结石成分，研究非钙基结石带来了额外的挑战。用于测序的大样本量可能有助于缓解分析具有固有异质性的组所固有的一些挑战。

样品采集

研究微生物组参与结石形成的另一个限制涉及样本采集。在我们小组对同侧肾结石形成者的分析中，我们发现膀胱中的微生物组与肾盂中的微生物组存在显着差异（未发表的数据）。因此，来自膀胱的尿液样本可能无法准确描述可能在上尿路结石形成中起作用的那些共生细菌。在未来的多机构合作中，我们建议报告泌尿系结石的位置，并根据结石病的解剖位置将队列分成适当的组。

与微生物组分析相关的尿液样本的收集也存在重要差异。尿液样本可以通过中段排尿、导尿管和内窥镜抽吸来收集。中游尿液样本代表膀胱微生物组，而初始排尿样本更典型的是远端尿道 [   11   ]。然而，排尿样本可能会被皮肤菌群污染，与传统的尿液培养相比，使用敏感的 rRNA 测序技术时，皮肤菌群的数量可能要大得多。尿液样本也经常被泌尿生殖道中可能存在的其他材料污染，例如结石、支架、导管和网状物。这种污染掩盖了基因组分析，阻碍了我们对真正的泌尿微生物组的理解[  49、50   ]  。_

围手术期抗生素会影响尿石症患者的尿液微生物群 [   15   ]。许多研究已经根据各自机构的手术方案收集了积极使用抗生素的患者的尿液样本，这可能会改变培养结果和测序结果 [   36   ,   46   ,   48 ]  ]。在我们的前瞻性研究设计中，近期抗生素暴露或感染性结石病史的患者被排除在最终队列之外，并且在收集尿液样本（膀胱和双侧肾盂）之前不使用围手术期抗生素（未发表的数据）。收集标本后，在围手术期抗生素给药后进一步保持仪器 10 分钟。我们鼓励未来的研究考虑围手术期抗生素对最终微生物组数据的影响，并在可行且患者风险最小的情况下调整我们的研究设计。

当通过手术获得标本时，泌尿系统内的侵入性外科手术（例如输尿管镜检查和经皮肾镜取石术）可能是交叉污染的来源。以较小的碎片提取较大的肾结石可能会增加污染的风险 [   11   ]。毫不奇怪，交叉污染会混淆 RNA 测序研究，尤其是在低生物量样本中，如石头和尿液样本 [   51   ]。此外，用于研究的石头标本的收集落后于为研究其他疾病状态（例如，泌尿系统癌症）而创建的组织库。在腹腔镜手术期间，皮肤菌群可能是细菌污染的来源，而手术器械并非没有 DNA，因此在测序分析期间背景 DNA 是不可避免的。  11   ]。因此，在实施研究设计之前，应仔细探索结石操作的记录和队列纳入标准的考虑。

尽管没有用于微生物组研究的标准尿液收集技术，但研究方案应强调收集最能代表泌尿生殖系统的尿液样本的重要性。应适当教育研究患者使用消毒液收集中游样本以减少污染。使用导管插入而不是中游收集可能有一些好处，以尽量减少污染。应考虑在结石介入前进行内镜下尿液收集，以防止结石菌群污染尿液微生物组。应仔细考虑严格的纳入和排除标准，以优化结果的有效性。

微生物组变异

泌尿生殖菌群的多样性令人印象深刻。因此，文献中提到的尿石症中的尿路微生物群非常多变（表  1  ）并且与尿石症相关的明确细菌特征在研究中并不一致，这不足为奇。尽管这些显着的细菌变异可归因于交叉污染，但泌尿微生物组也会对广泛的生理变化做出反应，包括个体之间的衰老、功能状态、药物、生活方式和免疫系统变化。例如，刘易斯等人。证明无症状个体的尿微生物组随着年龄的增长而变化 [   3  ]。因此，在尿石症中为数不多的尿基因组研究中发现的差异对将泛化数据综合到不同人群提出了独特的挑战。随着更大的样本量和结构化的方案，我们假设微生物多样性的模式可能在尿石症患者中变得更加明显。

技术和测序限制

尽管 RNA 测序是探索各种生态系统中基因分布的最强大工具之一，但它在尿液微生物组研究中的应用存在滞后 [   52   ]。Morand 等人的荟萃分析。注意到 562 个样本中只有 240 个实施了测序分析，而其余样本采用了细菌培养数据 [   53   ]。他们对仅通过培养物鉴定出的微生物的范围表示担忧。通常在临床实验室中，尿液培养物对致病物种进行了区分，而没有有力地记录作为任何微生物组关键元素的共生或机会性物种。事实上，共生细菌可能会在共同资源的竞争中胜过病原体，从而预防泌尿系统疾病和抑制结石形成 [   53   ]。

尽管与标准尿液培养物相比，16S rRNA 测序技术提供了更多的生物多样性信息，但一个显着的限制是它无法区分来自尿液和结石样本中活细菌 DNA 片段和非活细菌 DNA 片段的 rRNA [   8   ]。来自非活细菌的 DNA 可以持续 3 周，这在研究微生物组时具有重要意义 [   54 ]  ]。通常，尿培养显示假阴性结果，表明没有细菌定植或无活性细菌。在 Hilt 等人的一项研究中，92% 的尿液培养显示女性膀胱没有生长。然而，通过利用扩大定量尿培养 (EQUC)，包括在不同条件下铺板更大体积的尿液并延长孵育时间，在 80% 的先前阴性尿培养中分离出活细菌 [   4   ,   20   ]。因此，扩大的定量尿液培养可能会为改善尿液微生物组研究提供额外的好处。

合作

研究人员必须克服几个障碍，才能在研究界的不同研究中综合微生物组数据。在表  1  中提到的 8 项尿液微生物组研究中，只有 2 项 (25%) 具有公开可用的基因组和/或分类数据集。此外，微生物组研究缺乏标准化，导致数据集不完整，包括样本缺失、缺乏对结石细节（成分、位置和大小）的描述，以及测序协议和数据分析技术的差异 [   55   ]。随着微生物组研究技术的发展，与生物信息学科学家合作对于确保对分析的适当解释至关重要。

我们对泌尿微生物组对尿石症影响的理解可以通过共享数据集迅速发展。为 rRNA 测序数据生成一个共享的多机构平台将提供进行汇总分析的选项，同时控制尿液收集方案、结石成分和结石的解剖位置。通过增加统计能力和控制混杂变量（例如，结石成分、位置、临床病理参数），合并数据集可以更深入地了解生物多样性在尿石症中的作用。例如，美国国立卫生研究院 (NIH) 创建了人类微生物组项目，以更好地了解人体中的各种微生物组。在这个平台上，研究人员开发了一个强大的肠道微生物组和测序数据库来进行大型荟萃分析。NIH 最近扩展了微生物组数据库，以包括尿路样本，以期标准化和共享微生物群测序数据。NIH 正在使用的新平台为开展合作研究提供了一个令人兴奋的机会 [  56   ]。

结论

泌尿微生物组是一个多样化且适应性强的生态系统，其意义尚不完全清楚，可能在尿石症中发挥作用。虽然文献越来越多地充斥着有关微生物多样性和结石形成的相关信息，但尚未有任何研究小组进行纵向研究来描述尿石症患者尿液微生物组的变化。同样，标本采集和分析的技术差异，以及不一致的研究设计，限制了我们就尿路微生物组对尿石症的影响得出临床实质性结论的能力。仔细的队列选择，以及更严格和标准化的研究设计，可能会产生更明确和更普遍的结论。此外，很少有公共数据库包含尿石症微生物组数据，  2   )。尽管我们仍处于这一旅程的早期阶段，但尿液微生物组似乎很有可能最终被证明会影响尿石症的风险。更深入地了解泌尿微生物组与结石形成的关系可能会为改变尿石症风险和降低这种常见疾病的严重发病率提供令人兴奋的机会。