科研丨基因组所＆云南师大: 根分泌的苦味三萜调节根际微生物群以改善植物适应性(国人佳作)

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编译：微科盟薇薇，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   地下微生物生态系统对植物健康有着深远的影响。近年来，植物特化代谢物在塑造根际微生物群方面显示出重要作用。然而，这些代谢物从根到土壤传递的潜在机制仍有待阐明。葫芦素是葫芦科植物(如甜瓜和西瓜)中特有的苦味三萜类化合物，由类操纵子基因簇合成。在本研究中，我们报告了两种多药和有毒化合物输出(MATE)蛋白参与其各自葫芦素的转运，这一过程与葫芦素的生物合成共同调控。本研究进一步表明，从甜瓜根部进入土壤的葫芦素B通过选择性富集Enterobacter(肠杆菌属)和Bacillus(芽孢杆菌属)来调节根际微生物群，并证明这反过来又会导致甜瓜对土壤传播的枯萎病病原菌Fusarium oxysporum(尖孢镰刀菌)产生抗性。本研究为特化代谢物转运蛋白如何操纵根际微生物群从而影响作物适应性提供了见解。  

论文ID

原名：Root-secreted bitter triterpene modulates the rhizosphere microbiota to improve plant fitness

译名：根分泌的苦味三萜调节根际微生物群以改善植物适应性

期刊：Nature Plants

IF：17.352

发表时间：2022.8.1

通讯作者：马永硕，尚轶

通讯作者单位：中国农业科学院深圳农业基因组研究所；云南师范大学马铃薯科学研究院

DOI号：10.1038/s41477-022-01201-2  

实验设计

结果与讨论

1 葫芦素转运蛋白的系统基因组挖掘

基因组挖掘和比较基因组学策略用于确定潜在的葫芦素转运蛋白。在甜瓜和西瓜之间的一个共线区域，两个预测的多药和有毒化合物输出(MATE)基因(Melo3C002190和Cla008357)与编码参与CuB/CuE生物合成的多功能细胞色素P450(CYP87D20)的基因(Melo3C002192和Cla008355)聚集在一起(图1a)。这两个基因的表达谱与生物合成基因的表达以及葫芦素在甜瓜和西瓜中的积累一致(扩展数据图1)。此外，甜瓜和西瓜苦味的主调节因子能够分别特异性结合Melo3C002190和Cla008357的启动子，并激活它们的转录(扩展数据图2)。这些数据支持了Melo3C002190和Cla008357是甜瓜和西瓜中潜在的CuB和CuE转运蛋白的假设，这些基因分别被命名为CmMATE1和ClMATE1。

图1. 葫芦科植物中苦味转运蛋白的基因组挖掘。a，在MATE与葫芦素生物合成基因聚集的共线区域对两种葫芦科植物进行比较基因组学研究。编码不同酶的基因用不同的颜色表示。不同同线基因座之间的同源关系用虚线表示。DHO，脱氢酶。b，两种葫芦科植物MATEs的亚细胞定位。每个MATE-GFP融合在本氏烟草叶表皮细胞中瞬时表达。CmMATE1-GFP或ClMATE1-GFP与已知的拟南芥质膜标记PIP2A-RFP共定位。从左到右是GFP信号(绿色)、用RFP信号染色的质膜(红色)、差分干涉对比度(DIC)和三种信号的叠加(绿色、红色和DIC)。c-d，CmMATE1(c)和ClMATE1(d)分别在甜瓜和西瓜幼嫩根尖外周细胞中的mRNA原位杂交。显示了根尖的横向(虚线上方)和纵向(虚线下方)截面。比例尺：100 μm。 2 两种葫芦科植物MATEs的亚细胞定位和生化特征 为了研究这两种MATEs的潜在生理作用，我们检查了它们的亚细胞位置。在瞬时表达CmMATE1-GFP或ClMATE1-GFP构建体的烟草和黄瓜叶肉原生质体的表皮细胞中观察到质膜上MATE的清晰定位(图1b和扩展数据图3a)。此外，mRNA原位杂交分析显示，CmMATE1或ClMATE1转录本以及CuB或CuE生物合成基因主要存在于根尖的表皮细胞中(图1c、d和扩展数据图3b、c)。这些发现与燕麦中燕麦根皂苷生物合成基因的表达模式极为相似，因此进一步强化了我们提出的假设，即CmMATE1和ClMATE1分别参与从根向根际分泌CuB和CuE。

接下来，用两种方法研究了这两种MATEs的生化功能。首先使用酵母微粒体囊泡系统测试其各自MATE蛋白的CuB和CuE转运能力，因为在酵母中，两个MATE都定位于液泡膜(扩展数据图3d)。一项时间进程研究显示，与阴性对照相比，从表达CmMATE1和ClMATE1的酵母细胞中分离出的微粒体囊泡中检测到的CuB和CUE水平显著更高(图2a，b)。接下来，我们使用非洲爪蟾卵母细胞系统来评估两个MATEs的功能。与阴性对照相比，CmMATE1和ClMATE1均未显示出将CuB或CuE导入分别注射了CmMATE1或ClMATE1互补RNA(cRNA)的卵母细胞的能力(图2c)我们推测CmMATE1和ClMATE1可能分别作为参与CuB和CuE输出的转运蛋白。为了验证这一观点，我们向表达每种MATE蛋白的卵母细胞注射了葫芦素，并监测葫芦素在水浴培养基中的释放情况。与阴性对照相比，表达CmMATE1或ClMATE1的卵母细胞明显分别具有明显更高的CuB或CuE外排活性(图2d)。此外，CmMATE1和ClMATE1可以输出卵母细胞中的CuB和CuE，但无法输出黄瓜中的主要苦味化合物CuC(补充图2)。这些结果表明，这两种MATEs介导了具有底物特异性的葫芦素转运。

图2. 两种葫芦科植物MATEs的体外和体内功能表征。a和b，从表达CmMATE1(a)或ClMATE1(b)的酵母制备的微粒体囊泡摄取葫芦素的时间依赖性，从携带空载体的酵母中收集的样品，或者在缓冲液中不含ATP培养的样品，作为阴性对照。数据用平均±s.d.表示(n= 3)。c，CmMATE1和ClMATE1未能将CuB/E导入卵母细胞。将表达CmMATE1或ClMATE1的卵母细胞分别置于含有CuB或CuE的培养基中孵育，然后通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析这些卵母细胞中的葫芦素含量。注射无RNase水的卵母细胞作为阴性对照。数据用平均值 ±s.d.表示(n=6)。d，CmMATE1和ClMATE1分别调控CuB和CuE的输出活性。表达CmMATE1或ClMATE1的卵母细胞分别注射CuB或CuE，然后分析缓冲液中存在的葫芦素。数据用平均值 ±s.d.表示(n=8)。e和f，与野生型(WT)相比，ClMATE1突变体植株WCR-1和WCR-2在根和培养基(e)中均显示出CuE含量显著降低以及ClBi表达下调(f)。WCR是ClMATE1 CRISPR编辑的植株。g和h，敲除甜瓜毛状根系中的CmMATE1，导致根和培养基(g)中的CuB水平降低，同时样品中CmBi的表达下调(h)。MCR是CmMATE1 CRISPR编辑的株系。i和j，在甜瓜毛状根系中过表达CmMATE1导致根和培养基中CuB水平的增加(i)，以及CmBi表达增加(j)。OE是CmMATE1过表达株系。在e–j中，数据用平均值 ±s.d.表示(n= 3)。使用双侧t检验分析统计差异***P< 0.001; **P< 0.01; *P< 0.05。 3 两种葫芦科植物MATEs的体内功能 为了进一步探索ClMATE1的体内作用，在筛选了数千个外植体后，我们获得了两个由ClMATE1编辑的西瓜突变体WCR-1(西瓜CRISPR-line1)和WCR-2(补充图3)。这两个突变株在水培培养基和根系中的CuE含量均明显下降(图2e)，同时ClBi表达下调(图2f)。对于CmMATE1，我们无法生成经过CmMATE1编辑的甜瓜品系，因为甜瓜难以进行遗传转化。因此，我们选择利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的毛状根转化来确定CmMATE1的体内功能。与野生型相比，CmMATE1编辑的3个毛状根突变体MCR-1(甜瓜CRISPR-line1)、MCR-2和MCR-3在水培培养基和毛状根中的CuB含量均显著降低(图2g和补充图4)。CmBi在这些突变体中也表达下调(图2h)。当CmMATE1在毛状根中过表达时，得到了相反的结果(图2i，j)。综上所述，这些研究结果表明，CmMATE1和ClMATE1分别在葫芦科植物中扮演着CuB和CuE转运蛋白的角色。 4 CuB的化感活性特征 接下来，我们探究了CmMATE1或ClMATE1分别从甜瓜或西瓜根部排出的CuB或CuE是否能够调节根系微生物群落。由于没有获得CmMATE1编辑的甜瓜植株，而CmMATE1编辑的毛状根突变体也只能在水培培养基中培养(补充图4)，因此我们使用两种根苦味性状对比鲜明的甜瓜株系(无苦味根性状Cm70和具有苦味根性状的Cm104)来验证这一假设，尽管Cm70和Cm104具有不同的遗传背景。根据我们先前的研究，葫芦科植物的非苦味表型通常是由影响葫芦素生物合成的突变引起的。由于Cm70的整株植物都是非苦味的，因此理论上CuB不会在Cm70植株中生物合成，且不会分泌到其根际。与此推测相一致的是，在Cm104植株根际中发现了大量的CuB (69 nmol/g土壤干重)，而在Cm70植株根际中没有观察到CuB积累(扩展数据图4a)。将这些甜瓜品系种植在一种有利于土传病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的连作土壤中，会导致植株枯萎。我们发现，大多数Cm70幼苗表现出萎蔫症状并最终死亡，而大多数Cm104幼苗生长正常(扩展数据图4b，c)，这表明CuB可能在保护幼苗免受尖孢镰刀菌侵害方面发挥作用。 接下来，为了进一步测试CuB是否能提高植物适应性，我们将含有CuB的溶液添加到有利于种植Cm70的土壤中(Cm70+CuB)。与未处理的Cm70植株(Cm70−CuB)相比，CuB处理显著减轻了疾病进展和严重程度(图3a)。鉴于我们已经在体内和体外证明，CmMATE1能够将CuB从甜瓜根部释放到土壤中，这些数据共同提供了强有力的证据，支持CmMATE1是CuB在植物中发挥对抗作用的关键角色的假设。相比之下，CuC和CuE处理均未赋予这些Cm70植株抗病能力(扩展数据图4d)，表明CuB的释放有助于甜瓜抗枯萎病。CuB、CuC和CuE之间的差异可能部分源于结构上的微小差异，异羟肟酸DIMBOA和DIBOA也存在这种现象。与这一结果一致的是，当ClMATE1编辑的突变体(CuE输出受损植株)种植在相同的有利土壤中时，这些植株都表现出正常的野生型生长(扩展数据图4e)。 5 由CuB形成的甜瓜根系相关微生物群

由于CuB不表现出对F. oxysporum的直接抗菌活性(补充图5)，我们推测它可能通过建立一个抑制疾病的根系相关微生物群来间接抑制甜瓜枯萎病。因此，我们收集了Cm70±CuB处理的健康和患病幼苗的根，制备根际样本，用于细菌16S核糖体RNA(rRNA)和真菌内转录间隔区(ITS)基因测序。我们的分析显示，健康株系根际样品中细菌(而非真菌)的Shannon多样性显著低于患病株系(扩展数据图5)。总体而言，与患病株系相比，γ变形菌门(Gammaproteobacteria)在健康株系根际样品中富集，而拟杆菌门(Bacteroidetes)和α变形菌门(Alphaproteobacteria)则减少(图3b)。重要的是，两个共有属芽孢杆菌属(厚壁菌门)(Bacillus(Firmicutes))和肠杆菌属(γ变形菌门)(Enterobacter(Gammaproteobacteria))在健康株系的根际中显著富集(图3c、d和扩展数据图6)。这与许多植物相关的芽孢杆菌和肠杆菌增强植物抗病性的报道相一致。相比之下，镰刀菌(Fusarium)在患病株系中显著富集(图3e)。芽孢杆菌/肠杆菌(Bacillus/Enterobacter)与镰刀菌的相对丰度呈负相关(扩展数据图7)，表明CuB可能通过增强甜瓜植株中芽孢杆菌/肠杆菌的根际定植而赋予甜瓜植株镰刀菌抗性。

图3. CuB在甜瓜根际微生物群形成中的作用。a，种植在有利土壤中的甜瓜枯萎病研究进展。根据植物状态将其从0到4进行排名。用150 ppm的CuB处理后，植株的疾病严重程度和进展均显著减轻。以Cm104为阳性对照。数据用平均±s.d.表示。b，健康和患病幼苗的土壤、根际和内圈细菌群落组成。在健康株系的根际，γ变形菌门富集，而拟杆菌门和α变形菌门减少。c-e，健康和患病幼苗根际细菌群落组成的比较。在c中，显示了健康和患病幼苗根际中所有检测到的操作分类单元(OTUs)的log2转化倍数变化(FC)。log2(FC)阈值 < −1(错误发现率(FDR)校正后的q值，<0.01)和log2(FC) > 1(FDR 校正 后的q值，<0.01)分别定义健康幼苗根际群落中显著减少和富集的OTUs。维恩图显示了健康组和患病组的根际群落中OTUs减少和富集的重叠。d和e分别显示了健康组和患病组根际群落中芽孢杆菌(d)、肠杆菌(d)和镰刀菌(e)的相对丰度。数据用平均值 ±s.d.表示(n= 3)。使用双侧t检验分析统计差异***P < 0.001。 接下来，我们对健康和患病幼苗的根际微生物群进行了鸟枪法测序。与扩增子测序数据一致，尖孢镰刀菌是患病株系中最具优势的菌种，而芽孢杆菌和肠杆菌在健康株系中非常丰富(图4a)。接下来，将在健康幼苗中富集的具有最高相对丰度的芽孢杆菌和肠杆菌作为进一步研究的目标(扩展数据图8)。分离出4株芽孢杆菌(2株B. megaterium和2枯草芽孢杆菌B. subtilis)和4株肠杆菌(阴沟肠杆菌E. cloacae、两株桑肠杆菌E. mori和阿氏肠杆菌E. asburiae)(图4a)。在这些菌株中，两株枯草芽孢杆菌菌株B-3610和B-A抑制了尖孢镰刀菌的生长(补充图6)。有趣的是，CuB抑制了分离的芽孢杆菌菌株的生长(扩展数据图9a)，但能够刺激肠杆菌的生长，特别是阴沟肠杆菌菌株E-159和桑肠杆菌菌株E-99(图4b、c和扩展数据图9b)。

鉴于培养基中的CuB水平在肠杆菌菌株生长后显著降低(扩展数据图10a)，我们推测CuB可能为促进肠杆菌生长提供碳源。我们通过HPLC–q-TOF–MS进一步分析了与CuB共培养的E-159的代谢物谱，并鉴定了两种源自CuB的铵化合物(扩展数据图10b，c)。我们还发现肠杆菌菌株对芽孢杆菌菌株的生长具有积极影响(图4d，e)。总之，这些发现支持了一种模型，即CmMATE1将CuB转运到根际促进了肠杆菌菌株的生长，从而导致其富集，进而提高了拮抗芽孢杆菌菌株的定殖能力并抑制了土传病原菌尖孢镰刀菌的生长，从而促进了植物适应性(图4f)。

图4. CuB对抗甜瓜枯萎病的功能活性特征。a，对健康和患病的Cm70幼苗以及Cm104根际微生物群进行鸟枪法测序。列出了在所有样本根际检测到的芽孢杆菌、肠杆菌和镰刀菌的前十个物种，并用星号表示在健康幼苗中富集但在患病株系中减少的物种。本研究中测试的芽孢杆菌和肠杆菌菌株显示为红色。每个样本包含三个生物重复。所有菌株的相对丰度见补充表2和3。H-Cm70，健康Cm70；D-Cm70，患病Cm70。b和c，在TSB培养基中添加CuB可刺激肠杆菌E-159(b)和E-99(c)的生长。d和e，肠杆菌菌株的肉汤可以促进芽孢杆菌菌株B-3610(d)和B-A(e)的生长。对照组(CK)是在B-3610中添加等体积的TSB培养基代替肠杆菌菌株的肉汤。b-e中的数据用平均±s.d.表示(n= 3)。f，说明CuB及其向根际输出、并与有益微生物菌株和病原体以及植物适应性之间关系的模型(右，健康)。CmMATE1介导的CuB向根际的转运促进了E. cloacae/E. mori的富集，通过CuB的代谢，从而促进枯草芽孢杆菌的积累。富集的枯草芽孢杆菌对枯萎病病原菌尖孢镰刀菌具有拮抗作用。相反，低CuB水平不能使肠杆菌富集，从而不允许芽孢杆菌的积累，因此镰刀菌可以攻击宿主植物(左，患病)。

结论

本研究鉴定了葫芦科植物中两个与生物合成途径基因物理聚集的苦味转运蛋白，并表征了其功能特征。本研究的一个明显缺点是，CmMATE1突变体无法用于研究根际微生物组组装。然而，鉴于CmMATE1执行的根系分泌CuB以及CuB调节微生物群活性方面坚实和全面的数据，我们的研究结果为了解葫芦素转运蛋白在塑造根际微生物群以改善植物适应性中的作用提供了见解。此外，苦味葫芦素生物合成和转运的协调调控可能是一种潜在机制，可以平衡葫芦素输出所赋予的病原体抗性，同时最大限度地减少植物的过度能量损失。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41477-022-01201-2 获取此篇微文原文pdf请扫描下方二维码联系微科盟多组学老师即可。

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