Science｜纤毛基体的原位结构揭示了鞭毛内运输复合物的逐步组装机制

纤毛（cilia），又称为鞭毛（flagella），是突起于真核细胞表面的一类重要细胞器，在细胞运动，胚胎发育，信号转导等过程中发挥重要作用【1】。纤毛主要由基体（basal body）、轴丝（axoneme）、纤毛膜（ciliary membrane）和纤毛基质组成，二联管（microtubule doublets, MTDs）作为轴丝从基体中的三联管（microtubule triplets, MTTs）中延伸出来，被纤毛膜所包被（图1）【2】。

在纤毛基体处，一个被称为过渡区（transition zone，TZ）的特化区域可以调节膜结合和可溶纤毛蛋白的进入与离开【3】。在众多门控功能中，TZ被认为是可以调节鞭毛内运输（intraflagellar transport，IFT）——由驱动蛋白和动力蛋白作为马达介导鞭毛基体与顶端之间的双向运输【4】。IFT对于纤毛的组装和稳定至关重要，一系列IFT蛋白和马达残留在纤毛基体等待以进入纤毛【5】。然而，这些蛋白是如何组装成为复杂的IFT复合物从而沿着纤毛轴丝运动是仍待解释的问题。  

图1 纤毛的结构（来自维基百科）

2022年7月29日，来自瑞士巴塞尔大学的Benjamin D. Engel课题组在Science上发表了名为In situ architecture of the ciliary base reveals the stepwise assembly of intraflagellar transport trains的文章，通过结合冷冻电镜断层扫描（cryo-ET）和超分辨结构扩展光学显微镜（U-ExM）技术观察绿藻的纤毛，揭示了原位的TZ结构和IFT复合物在纤毛基体逐步组装的机制。

图2 绿藻纤毛原位TZ的cryo-ET结构

通过cryo-ET技术，作者观察到了不同类型的结构附着在了MTD上（图2A和图2B），断层子图平均如图2C～H所示。近端直径约为180nm的TZ区域被表面的Y-link（图2，绿色部分）和腔内的星状纤维（图2，紫色部分）所占据。星状纤维在横截面中可见组装为9点星（图2E），同时组装为6-螺旋重复的圆柱体，每一循环高度为49.2nm（图2H），与MTD的A3原纤维相结合，纵向周期为8.1nm（图2F）。Y-link将MTD与纤毛膜相连接并且帮助门控转运进入和离开纤毛，结构中揭示了Y-link结合MTDA9、A10、B1～B4原纤维结合，纵向周期为8.3nm（图2F），但是结构中Y-link外部与纤毛膜结合密度可能由于高动态性没有被解析出来。

而在远端区域，有一个不同的螺旋密度包裹在MTD周围（图2G，深蓝色），称之为MTD鞘，由于其在近端缺乏而存在于远端，作者因此做出假设这一结构可能帮助调节轴丝剪切并在此过程中遗失。

图3 结合TZ区域的IFT复合物的cryo-ET结构

IFT蛋白定位于临近纤毛基体，但是其结构组装方式多年来仍然未知。在解析到的cryo-ET结构中，作者观察到像纤维丝一样的粒子，位于过渡纤维之间（图3A），其一个末端与TZ相接触，另外一个末端则伸向细胞质（图3B和图3C）。根据断层子图平均作者得到了粒子复合物的完整结构（图3D），为IFT复合物。作者发现IFT复合物在成熟和组装状态呈现出不同的结构，在成熟状态中（纤毛内部），IFT为延伸的直链状态，由IFT-B（黄色）、IFT-A（橙色）和动力蛋白-1b（红色）组成，而其靠近TZ区域，则组装复合物变得较为柔性，且弯曲率变大，同时可以看见IFT-A和动力蛋白-1b未被组装上来（图3A）。

图4 IFT复合物在组装状态和成熟状态的组成成分分布图

为了更好地分析IFT组装或成熟状态与TZ区域之间的关系，作者通过利用原始的颗粒分子信息勾画了每个IFT复合物在组装状态或成熟状态的组成成分分布图（图4A和图4C），累积曲线展示不同组分非常清晰的分布关系（图4B），IFT-B从头到尾一直存在，而随着从远端（头部）到近端（尾部），动力蛋白-1b及随后的IFT-A逐渐消失。将组装状态与成熟状态做比较，可以看到成熟状态中间部分的IFT-ABD亚基数目更多，而未成熟状态近端（尾部）的IFT-B亚基延伸得则更长（图4D）。

图5. 通过U-ExM来检测IFT复合物的组装方式

驱动蛋白-2由于小分子量和动态性，难以通过cryo-ET进行定位及解析，因此作者转向使用U-ExM来检测驱动蛋白-2在IFT组装状态上的分布情况，通过荧光可以观察到驱动蛋白-2（图5A）、动力蛋白-1b（图5B）、IFT-B（图5C、图5D、图5F和图5G）和IFT-A（图5E）。其分布与cryo-ET的结果较为类似，IFT-B的长度比IFT-A和动力蛋白-1b长，而驱动蛋白-2长度最短，且更靠近IFT的远端（头部）（图5H）。IFT的双组分标记荧光证实了IFT-A比驱动蛋白-2延伸得更长，而IFT-B比IFT-A延伸得更长（图5I和图5J）。同时也可以看到IFT在TZ中呈现出9次重复（图5F和图5G）。

综上，作者通过结合cryo-ET和U-ExM提供了IFT复合物组装的空间时序过程（图5K），IFT-B首先形成骨架，然后从头部到尾部招募IFT-A、动力蛋白-1b并最终结合在驱动蛋白-2上。但是仍有遗留的问题在本篇文章中没有被解决，IFT进入纤毛是如何被调节的，比如组装状态的纤毛的头部是如何被阻止进入纤毛的？作者给出的可能解释是TZ处的调控因子可能调节驱动蛋白-2的载入、MTD鞘作为屏障阻止小的IFT复合物进入或者额外的IFT-B相关的分子作为制动器阻止进入。

参考文献

【1】M. V. Nachury, D. U. Mick, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 20, 389–405 (2019).

【2】D. R. Mitchell, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 9, a028290 (2017).

【3】Q. Hu et al., Science 329, 436–439 (2010).

【4】G. Pigino, Curr. Biol. 31, R530–R536 (2021).

【5】J. V. K. Hibbard, N. Vazquez, R. Satija, J. B. Wallingford, Mol. Biol. Cell 32, 1171–1180 (2021).

供稿 | 朱盎岐

审稿 | 李浩田

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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