项目文章丨中山六院＆东南大学: 来自微流体的益生元和后生元协同递送微胶囊治疗结肠炎（国人佳作）

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编译：微科盟听雪斋，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   细菌代谢物对肠道微生物群的操纵对结肠炎有保护作用，但其疗效受到口服给药效率差和单一药物使用的严格限制。本研究提出了一种通过微流控电喷雾制备的由吲哚-3-丙酸(IPA)后生元和海藻酸钠、抗性淀粉(RS)以及壳聚糖组成的新型益生元和后生元协同递送微胶囊，用于预防和治疗结肠炎。研究发现，小鼠口服IPA微胶囊(IPA@MC)对结肠炎具有显著的保护作用，表明益生元与后生元之间存在协同治疗作用。此外，IPA@MC的机制在调节肠道微生物群中得到了揭示，显著增加了肠道微生物的整体丰富度和产生短链脂肪酸(SCFA)的细菌（如Faecalibacterium和Roseburia）的丰度。这些结果表明，益生元和后生元协同递送微胶囊是治疗结肠炎的理想候选药物。    

论文ID

原名：Prebiotics and Postbiotics Synergistic Delivery Microcapsules from Microfluidics for Treating Colitis

译名：来自微流体的益生元和后生元协同递送微胶囊治疗结肠炎

期刊：Advanced Science

IF：17.521

发表时间：2022.4

第一作者：杨科力

通讯作者：黄榕康，王辉，兰平；赵远锦

通讯作者单位：中山大学附属第六医院；东南大学生物科学与医学工程学院

DOI号：10.1002/advs.202104089

实验设计

结果与讨论

总体上来说，IPA@MC是通过毛细管微流控电喷雾法制备，然后在壳聚糖浴中增加涂层。首先将IPA均匀分散在海藻酸盐/RS溶液中，然后转移到静电驱动的毛细管微流控芯片中生成液滴。接下来，将液滴收集在含有2.0%氯化钙的酸性收集液中。Ca2+与海藻酸盐的快速交联使微胶囊快速固化，将IPA分子牢牢限制在海藻酸盐/RS网络内，几乎没有泄漏。此外，与海藻酸盐混合的额外RS可以与藻酸盐产生双网络，从而进一步减缓IPA的释放。此外，IPA@海藻酸盐/RS微胶囊通过与藻酸盐自发静电相互作用进一步包被壳聚糖，以减少酸条件下IPA的释放。如图2a所示，得到的IPA微胶囊(IPA@MC）和空微胶囊(MC)均呈现高度单分散的球形形态。共聚焦荧光成像进一步证实了微胶囊的核壳结构，红色为Alg/RS核和绿色为壳聚糖壳(图2b)。结果发现，壳聚糖涂层微胶囊的直径明显小于未涂层微胶囊(图S1和S2)。这一现象可以归因于壳聚糖带负电荷的氨基与海藻酸钠带正电荷的羧基之间静电相互作用形成致密的大分子化合物。通过改变微流体流量和电喷雾电压等实验参数，可以很好地控制壳聚糖涂层和未涂层微胶囊的球形形状和尺寸(图S3)。通过扫描电子显微镜(SEM)进一步表征了微胶囊的形态（图2c、d）。有趣的是，IPA@MC呈现出褶皱的球形形态，表面极其粗糙，这与未负载IPA的MC光滑表面形成鲜明对比。IPA@MC出现这种褶皱形态的一个可能原因是IPA部分在酸收集凝胶浴中沉淀出来，导致Alg/RS球变形。为了验证这一假设，我们探索了不同IPA负载量下IPA@MC的褶皱水平，随着IPA浓度从1.0%上升到3.0%，褶皱水平显示出明显的上升趋势(图S4)。

图1. 预防和治疗结肠炎的益生元胶囊(IPA@MC)示意图。a)微流控电喷雾法制备进一步由壳聚糖涂层的IPA封装Alg/RS微胶囊。b)双pH敏感的核壳结构使药物在上消化道酸性条件下缓慢释放，在下消化道中性条件下快速释放，通过调节肠道菌群发挥抗结肠炎的保护作用。Alg：海藻酸盐；RS：抗性淀粉；CS：壳聚糖；IPA：吲哚-3-丙酸。

图2. 微胶囊的形态表征。Alg/RS、Alg/RS/CS、IPA@Alg/RS和IPA@Alg/RS/CS微胶囊a）光学；b）荧光；c、d）扫描电子显微镜（SEM）图像。比例尺分别为：a）200 µm；b）50 µm；c）20 µm和d）2 µm。Alg：海藻酸盐；RS：抗性淀粉；CS：壳聚糖；IPA：吲哚-3-丙酸。 理论上，IPA是一种小分子，在微流控电喷雾过程中，IPA会快速从微胶囊的水凝胶网络中逃逸。为了减少制备过程中的IPA泄漏，进一步对IPA@alginate/RS微胶囊进行壳聚糖涂层。初始IPA浓度为2.0%的IPA@MC经壳聚糖涂层后，实际载药率(DLR)从9.2±2.3%增加到18.0±2.5%(w/v)（图S5）。此外随着IPA@MC IPA浓度从0.5%增加到3.0%（w/v），DLR从2.86±0.4%增加到26.8±1.1%（w/v）（图3a），表明最终DLR与初始IPA浓度之间存在正相关关系。此外，IPA@MC的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)显示，C═O键和O–H键的特征吸收峰分别位于1700 cm−1和3440 cm−1左右，证实了IPA分子在微胶囊中的成功封装（图S6）。 在pH敏感的药物递送系统中，pH值的变化是控制药物从上消化道向下消化道释放的关键因素。海藻酸盐是一种粘性膳食益生元，由古洛糖醛酸和甘露糖醛酸组成，在低pH下形成凝胶（如在胃中），因此，海藻酸盐微胶囊在胃液中稳定（pH约1-2），但在肠道中容易分解（pH≥ 7)。为了验证由海藻酸盐、RS和壳聚糖组成的IPA@MC的双pH敏感性药物释放特性，我们进一步研究了IPA@MC在具有不同pH值的模拟缓冲液中的药物释放率和溶胀率。如图3b所示，在所有缓冲液中，8 h后获得了IPA@MC的最大药物释放（>70%）。在模拟胃液（SGF）的酸性条件下，我们观察到前2小时IPA的初始释放速度较慢（<50.0%），随后在2-6 h之间释放速度缓慢增加；最终在8 h时达到75.0%的累积药物释放。相比之下，在模拟肠液（SIF）和模拟结肠液（SCF）的中性条件下，前2 h IPA释放速度更快，为60.0%。在4-6 h，药物累积释放为75.0%。与药物释放规律一致，IPA@MC浸泡在SIF（10.5±0.4）和SCF（11.1±0.8）中8 h后的溶胀率显著高于SGF（4.4±0.4）（图3c和图S7）。上述结果表明，所获得的IPA@MC具有pH敏感性药物释放能力，这使得IPA在上消化道酸性条件下比在下消化道中性条件下释放更慢，IPA@MC溶胀更稳定。由于估计食物在上消化道中的过渡时间约为1-2 h，因此IPA@MC可作为通过口服给药将后生元递送至下消化道的优良药物载体。

此外，由于褶皱微胶囊的粘附能力强于光滑微胶囊，与光滑MC相比，表面褶皱IPA@MC在消化道的停留时间可以延长，这有望提高IPA@MC在胃肠道的药物递送效率。如图3d所示，通过体内成像系统(IVIS)实时监测小鼠体内光滑(MC)和褶皱(IPA@MC)微胶囊在胃肠道中的停留时间。口服给药后，MC组和IPA@MC组的微胶囊大多位于胃内。4 h后，位于小肠的MC信号明显强于IPA@MC信号，这表明光滑微胶囊的胃排空速率更快。12 h时IPA@MC组胃、小肠和盲肠的微胶囊荧光信号较强。相比之下，MC组在整个胃肠道检测到的荧光信号要弱得多。这些结果表明，与表面光滑的MC相比，褶皱IPA@MC经口服后在胃肠道的停留时间延长至12 h。因此，这种益生元包封药物载体可以延长其益生元成分的发酵时间，进一步提高其治疗效果。

图3. IPA@MC的双pH敏感药物释放和口服肠道靶向给药。a）PA@MC在不同初始IPA浓度下的载药效率I。b）IPA@MC在不同pH条件下IPA的累积释放量，包括SGF（pH=1.2）、SIF（pH=6.8）和SCF（pH=7.4）。释放实验采用2.0% IPA负载IP@MC。c）IPA@MC在不同pH条件下的溶胀率，包括SGF（pH=1.2）、SIF（pH=6.8）和SCF（pH=7.4）。d） IVIS图像显示，与具有光滑球体的MC相比，具有褶皱球体的IPA@MC在胃肠道中的停留时间延长。SGF：模拟胃液；SIF：模拟肠液；SCF：模拟结肠液。MC：空微胶囊。IPA@MC：IPA微胶囊。 随后，在体内实验之前，通过与NIH 3T3细胞共培养来检测IPA与药物载体的细胞相容性。如图S8所示，当与IPA在0.05-1.0×10-3M的梯度浓度下培养2天时，所有细胞均存活良好，表明IPA具有良好的细胞相容性。此外，与对照组和其他IPA处理组相比，0.05×10-3M IPA处理组的细胞增殖显著增加。因此，选择0.05×10−3M IPA作为后续细胞实验的阳性对照。接下来，用IPA@MC、MC和0.05×10−3M IPA处理3T3细胞。如图S9a所示，我们发现各组细胞形态正常且健康，表明微胶囊的毒性较低。此外，CCK-8分析进一步证实了与未经IPA处理的组相比，IPA@MC和IPA组的细胞增殖显著增加（图S9b）。这与先前的研究一致，即色氨酸代谢物可以在体外加速细胞增殖并保护细胞免受辐射毒性。因此IPA@MC优异的细胞相容性使其在口服给药和结肠炎治疗方面具有广阔的应用前景。

为了探索IPA@MC在体内对结肠炎的保护作用，小鼠连续5天口服IPA@MC、IPA和MC，然后在饮用水中添加葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎7天，如图4a所示。与健康组相比，观察到DSS处理后DSS组的体重显著下降。然而，服用IPA@MC的小鼠和健康小鼠之间的体重没有显著差异，这表明IPA@MC显著保护小鼠免受DSS诱导的体重减轻的影响（图4b和图S10a）。此外，IPA@MC组的疾病活动指数（DAI）趋势明显低于其他DSS处理组（图4c和图S10b）。除体重下降外，DSS诱导的结肠炎通常表现为结肠缩短和脾脏/体重比增加。在本研究中，IPA@MC组的结肠长度与健康对照组相当，显著长于IPA、MC和DSS组（p<0.05，图4d和图S10c）。此外，与IPA组和DSS组相比，IPA@MC组小鼠的脾脏/体重比显著降低（p<0.05，图4e），进一步证实了IPA@MC在小鼠中的预防结肠炎的作用。通过苏木精-伊红（H&E）和促炎细胞因子（包括白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（INF-α））的免疫组织化学染色检测结肠组织的炎症水平。结果发现，健康对照组和IPA@MC组之间的H&E染色图像没有显著差异，这与其他DSS处理组结肠隐窝结构丧失、上皮损伤和免疫细胞浸润所反映的严重炎症反应形成明显对比（图4f）。此外，IPA@MC组IL-6和INF-α的表达水平低于IPA、MC和DSS处理组，表明IPA@MC组炎症得到炎症（图S11）。综上所述，这些结果表明，与单独使用IPA或MC相比，IPA@MC对DSS诱导的结肠炎显示出强烈的预防和疗效。

图4. IPA@MC对小鼠DSS诱导结肠炎的保护作用（每组n = 6）。a）动物实验设计示意图。IPA@MC有望对DSS诱导的小鼠结肠炎产生较强的保护作用。b）第0天至第7天的体重变化。c）第0天到第7天疾病活动指数（DAI）变化。第7天小鼠的结肠长度（d）和脾脏/体重比（e）。f）第7天结肠组织的代表性H&E染色图像。箭头表示炎性细胞浸润和上皮糜烂。组间显著性检验采用Student’s t 检验。误差条表示SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，NS代表无显著性差异（*p<0.05）。f）比例尺为100 µm。将小鼠随机分为5组（对照组：PBS+正常水；IPA@MC：IPA微胶囊+DSS水；IPA：IPA+DSS水；MC：空微胶囊+DSS水；DSS：PBS+DSS水）。 鉴于膳食中添加益生元有助于调节结肠炎患者的肠道健康，本研究选择海藻酸盐、RS和壳聚糖等益生元作为后生元载体。虽然IPA组和MC组的结肠炎趋势均低于DSS组，但这些组之间无统计学差异（图4b、c和图S10），表明单一益生元或后生元的治疗效果不足。相比之下，IPA@MC组的体重减轻、DAI、结肠长度和脾脏/体重比均与其他DSS处理组存在显著差异，表明IPA@MC中益生元和后生元的协同作用为预防和治疗结肠炎提供了一种更有效的治疗策略。这一结果可能归因于IPA@MC中益生元和后生元之间的协同作用。益生元主要是可被特定有益细菌利用的不易消化的低聚糖。因此，肠道细菌代谢这些膳食成分，产生有益的代谢物（后生元），以维持健康的肠道菌群。相反，也有研究表明，后生元可以增加有益细菌并抑制有害细菌的生长，从而进一步增加益生元在肠道中的发酵。然后，益生元喂养的有益细菌的丰度增加可以产生更高水平的后生元，以维持肠道健康。 新出现的证据表明，肠道菌群的生态失调与结肠炎密切相关，包括减少微生物群多样性和有益细菌类群的丧失。因此，我们研究了IPA@MC治疗是否可调节DSS-结肠炎小鼠的肠道微生物特征。在DSS诱导7天后，对小鼠粪便样本进行16S rRNA基因测序。根据Chao1的丰富度估计，与IPA、MC或DSS处理组相比，IPA@MC处理显著增加了结肠炎小鼠的肠道微生物多样性，如通过Chao1丰富度估计的（图5a）。值得一提的是，IPA@MC组的Chao1指数与健康小鼠相当。此外，基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）表明IPA@MC处理组的肠道微生物特征与健康小鼠相似，与使用IPA、MC和DSS处理的小鼠显著不同（p=0.004，图5b）。然而，在MC和DSS组中观察到的分散表明，处理后复杂的微生物变化存在更大的未知。进一步扩大实验样本量并使用更深入的鸟枪法宏基因组测序来探索肠道微生物组（而非16s rRNA测序）可能有助于改善组内观察的矩心。

随后，在门、目和属水平上检查肠道细菌组成，以研究不同处理后结肠炎小鼠的分类学变化。如图5c所示，拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）是所有组中检测到的优势菌门。特别是，与DSS组相比，IPA@MC组的拟杆菌与厚壁菌的比例与健康组相似，厚壁菌门丰度增加，拟杆菌门丰度减少（图5d）。此外，与健康对照组相比，DSS组在分类水平上发生了改变，包括拟杆菌目增加，弯曲菌目、梭菌目和丹毒丝菌目减少。与门水平的变化相一致，IPA@MC组小鼠在细菌目水平上与健康小鼠相似，而与DSS组相比，经IPA或MC处理的DSS诱导小鼠几乎没有变化（图5e）。接下来，在属水平上测量肠道细菌谱的进一步变化（图5f）。我们只观察到组间顶部细菌属的轻微变化；这一结果与先前的研究一致，即丰度较低的细菌分类群可能在疾病发生中起重要作用。

图5. 使用IPA@MC调节结肠炎小鼠肠道微生物群（每组n＝6）。a）各组的Chao1丰富度。组间显著性检验采用Student’s t检验。b）基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示IPA@MC和DSS-结肠炎组的健康对照组的肠道微生物群分层情况。PERMANOVA确定统计显著性。各组c）门水平的肠道细菌相对丰度。d）各组中拟杆菌门和厚壁菌门的比例。各组中e)目和f)属水平的肠道细菌相对丰度。* p < 0.05。将小鼠随机分为5组（对照组：PBS+正常水；IPA@MC：IPA微胶囊+DSS水；IPA:IPA+DSS水；MC：空微胶囊+DSS水；DSS：PBS+DSS水）。 产生SCFA的细菌类群的减少也与DSS诱导的结肠炎和其他肠道疾病有关。我们进一步探讨了IPA@MC是否可以增加口服给药后益生元产生菌的丰度。通过线性判别分析效应大小（LEfSe）比较各组间差异肠道细菌属。在所有组中共观察到17种差异肠道细菌属（图6a）。在差异分类群中，与健康小鼠相比，DSS组的SCFA产生菌相对丰度降低，包括Faecalibacterium和Roseburia（图6b，c）。有趣的是，IPA@MC处理可显著增加结肠炎小鼠中产生SCFA的细菌的相对丰度。然而，在DSS组和单一IPA或MC处理组之间，未观察到这些属的丰度存在显著差异。这一结果证实，与仅接受益生元的MC组或仅接受后生元的IPA组相比，IPA@MC提供的益生元和后生元之间的协同作用可以增强健康肠道微生物群的恢复。

与IPA@MC处理后产生SCFA的细菌属的丰度变化一致，我们发现IPA@MC组的盲肠样本中总SCFA水平较DSS组有所提高（图6d）。然而，SCFA水平与Faecalibacterium和Roseburia丰度之间的相关性未达到统计学显著水平（图S12）。进一步的大样本研究和更深入的宏基因组学分析可能为IPA@MC处理后SCFA表达和SCFA产生分类群之间的关系提供证据。此外，我们还分析了这些细菌属之间的相关性，以了解所有处理组之间的生态变化。结果发现，DSS诱导的结肠炎小鼠的细菌属间相关性数量少于健康小鼠（p=0.006，图6e，f）。相比之下，IPA@MC组的显著相关数高于DSS组，表明IPA@MC有利于结肠中肠道菌群的健康生态群落的重建。以上结果表明IPA@MC可以逆转肠道菌群失调，从而对结肠炎发挥显著的治疗效果。

图6. 通过IPA@MC改变肠道细菌和重建健康的生态群落（每组n=6）。a）IPA@MC处理小鼠的肠道细菌属发生改变，与健康小鼠的肠道微生物谱高度相似。b、c）IPA@MC处理小鼠中产生短链脂肪酸(SCFA)的细菌属(Faecalibacterium和Roseburia菌)的相对丰度增加。通过LEfSe分析确定差异分类群。d）与DSS组小鼠相比，IPA@MC处理小鼠的盲肠样品中总SCFA水平增加。组间显著性检验采用Student’s t检验。e）肠道细菌属之间的相关性数量。通过卡方检验确定统计学差异。f）IPA@MC组肠道细菌属之间的生态相关性高于DSS组。*p<0.05，**p<0.01，NS表示无显著性差异（p>0.05）。将小鼠随机分为5组（对照组：PBS+正常水；IPA@MC：IPA微胶囊+DSS水；IPA：IPA+DSS水；MC：空微胶囊+DSS水；DSS：PBS+DSS水）。

结论

综上所述，我们通过微流控电喷雾技术成功制备了预防和治疗结肠炎的益生元和后生元微胶囊IPA@MC。得益于益生元和后生元之间的协同作用，IPA@MC对小鼠的结肠炎具有显著保护作用，并显著重塑了健康小鼠的肠道微生物群。这些理想的特征使得这种益生元和后生元协同递送微胶囊在预防或治疗结肠炎中具有潜在的应用。 原文链接： https://doi.org/10.1002/advs.202104089

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