快报｜EmbC介导脓肿分枝杆菌对多种药物天然耐药

Arabinosyltransferase C Mediates Multiple Drugs Intrinsic Resistance by Altering Cell Envelope Permeability in Mycobacterium abscessus.

Wang S, Cai X, Yu W, Zeng S, Zhang J, Guo L, Gao Y, Lu Z, Hameed HMA, Fang C, Tian X, Yusuf B, Chhotaray C, Alam MDS, Zhang B, Ge H, Maslov DA, Cook GM, Peng J, Lin Y, Zhong N, Zhang G, Zhang T.

Microbiol Spectr, 2022 Aug 10:e0276321.

近日，美国微生物协会(ASM)旗下的《微生物谱》（Microbiology Spectrum）杂志在线发表了中国科学院广州生物医药与健康研究院和深圳市第三人民医院、广州医科大学、安徽大学、广州实验室等单位合作的一项关于脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus, Mab）天然耐药的相关研究（Arabinosyltransferase C Mediates Multiple Drugs Intrinsic Resistance by Altering Cell Envelope Permeability in Mycobacterium abscessus）。该研究通过转座子突变技术发现embC基因（编码EmbC，阿拉伯糖基转移酶C）介导Mab对多种药物天然耐药，并阐明其机制。进一步研究发现一线抗结核药物乙胺丁醇是EmbC的抑制剂，在体外可以增强相关药物的敏感性。最后，通过动物模型发现敲除embC基因后Mab在体内对利福布丁、利奈唑胺及亚胺培南变得敏感。中国科学院广州生物医药与健康研究院张天宇研究员和深圳市第三人民医院张国良教授为论文的通信作者，双方联合培养的博士后王帅为第一作者。

背    景

Mab是一种对绝大多数抗菌药物天然耐药的分枝杆菌，临床治疗其感染难度极大。最近已成为囊性纤维化患者和其他慢性肺部疾病患者的主要威胁。有些Mab感染比结核病还要难以治疗，最核心的问题是缺乏有效药物。因此，揭示其天然耐药机制，对药物靶标的发现、新药和治疗方案的研发至关重要。

方    法

首先，筛选Mab中与天然耐药相关的非必需基因。利用转座子突变技术构建转座突变株库。在含有亚抑菌浓度药物的平板上筛选对相关药物变得敏感的转座突变株。通过高通量测序和PCR等方法鉴定被转座子插入破坏的基因。

然后，验证破坏该基因功能是否可导致Mab对相关药物变得敏感。构建embC基因敲除菌株和回补菌株，观察不同菌株对相关药物敏感性变化。用小鼠动物模型验证所选药物对野生菌株、embC基因敲除菌株和回补菌株引起的感染是否有效。

最后，探究基因embC影响Mab天然耐药的机制。检测embC对脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）合成及细胞壁通透性的影响。乙胺丁醇可能通过靶向抑制EmbC、增加细胞壁的通透性来降低Mab对多种药物的天然耐药程度。比较乙胺丁醇单用及其与相关药物组合后的活性，检测乙胺丁醇对LAM合成的抑制作用。

结     果

由图1可知，与野生型Mab相比，转座子插入破坏embC的菌株（MabZ6）及embC敲除株对多种药物变得敏感。回补embC后又恢复耐药。证明embC介导了Mab的天然耐药。

图1  不同Mab菌株对不同药物的敏感性

EmbC负责将阿拉伯糖添加到脂甘露聚糖（LM）上合成LAM。因此，本研究检测了不同菌株中LM和LAM的含量，发现敲除embC后（Mab∆embC），Mab无法合成LAM（图2A）。溴化乙锭积累试验和结晶紫、孔雀绿及SDS的敏感性检测结果（图2 B、2C）均证明敲除embC后Mab的细胞壁通透性增加。

图2  敲除embC导致细胞壁通透性增加。A：SDS-PAGE检测脂甘露聚糖和脂阿拉伯甘露聚糖；B：溴化乙锭积累实验检测细胞壁通透性；C：不同Mab对结晶紫、孔雀绿及SDS的敏感性

通过下表可以发现添加4 μg/ml或8 μg/ml的乙胺丁醇可以使利福平等药物的最小抑菌浓度（MIC）降低到1/2~1/4。并且由图2A可知32 μg/ml的乙胺丁醇可以完全抑制Mab的LAM合成。证明了乙胺丁醇可以通过抑制LAM的合成来增加相关药物的敏感性。

注  S：光滑；R：粗糙

最后根据MIC结果及血药浓度数据，选取6种药物进行体内活性检测。发现敲除embC后Mab在体内对利奈唑胺、头孢西丁及利福布丁变得敏感（图3B）。

图3  采用不同抗菌药及药物组合治疗后小鼠肺部菌载量变化图。A：Mab小鼠肺部感染模型构建与治疗示意图。B：不同抗菌药治疗后小鼠肺部菌载量变化。C：含有乙胺丁醇的药物组合与相关药物单独治疗后小鼠肺部菌载量变化图

结论及展望

本研究首次发现embC可通过影响LAM合成，改变细胞壁通透性来影响Mab对多种药物的天然耐药，且乙胺丁醇在体外可增强多种药物的敏感性。通过小鼠模型发现敲除embC后Mab在体内对利福布丁、利奈唑胺及亚胺培南变得敏感。基于Mab EmbC的结构设计和优化获得新的抑制剂有望增强多种药物活性甚至逆转Mab对多种药物的天然耐药。

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供稿：王    帅

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2022-08-22