综述丨中国农科院牧医所: 利用宏基因组数据培养未培养微生物的机遇与挑战(国人佳作)

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编译：微科盟小木，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   虽然现在通过独立于培养的宏基因组DNA序列分析对地球上微生物生命的多样性有了广泛的了解，但微生物的分离和培养对于直接研究它们并确定它们的代谢和生理功能以及它们的生态作用仍然至关重要。然而，大多数环境微生物尚未培养；因此，将这些稀有或特征不佳的群体引入培养是进一步了解微生物组功能的首要任务。此外，培养的菌株可以在一系列应用中找到用途，例如新的益生菌、生物防治剂和工业加工剂。来自广泛环境的宏基因组和宏转录组序列信息日益丰富，为指导感兴趣的微生物的分离和培养提供了更多的机会。本综述讨论了一系列成功的方法和应用，这些方法和应用支持了最近宏基因组指导的微生物分离和培养工作。这些方法包括确定特定的培养条件以富集感兴趣的分类群，以及通过抗体工程和基因组编辑策略专门针对微生物物种捕获的更复杂策略。随着从未培养成员获得的基因组信息越来越多(如通过宏基因组组装基因组)，对其培养需求的理论理解将使捕获这些信息的可能性更大，并最终获得对微生物组的更全面理解。    

论文ID

原名：Opportunities and challenges of using metagenomic data to bring uncultured microbes into cultivation

译名：利用宏基因组数据培养未培养微生物的机遇与挑战

期刊：Microbiome

IF：16.837

发表时间：2022.5

通讯作者：王加启，赵圣国

通讯作者单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

DOI号：10.1186/s40168-022-01272-5

综述目录

1 前言

2 未培养微生物

3 组学时代培养的重要性

4 从宏基因组数据预测和重建代谢通路

5 宏基因组数据引导微生物分离策略

5.1培养基优化

5.2抗生素耐药基因应用

5.3稳定同位素探测引导的RACS

5.4反向基因组学引导分离

5.5基因靶向分离

6 宏基因组引导微生物分离的挑战和局限性

7 结论

主要内容

1 前言

微生物是地球上已知最早的生命形式，它们存在的化石证据可以追溯到30多亿年前。随后，微生物的生命变得多样化和适应，几乎在所有研究的环境中都能发现。这些环境包括土壤和海洋，以及与宿主相关的环境，如动物肠道系统或植物的根际，它们与宿主共同进化并成为宿主健康和功能的依赖。微生物具有巨大的代谢和生理多功能性，对几乎所有生物地球化学循环过程都至关重要。此外，微生物-宿主关联在自然界中广泛存在，宿主可以通过不同的方式从这种关联中受益。微生物可以帮助同化或合成必需的营养物质，分解代谢原本难以消化的底物或充当宿主自身的营养来源。它们还能保护宿主免受病原体和有毒物质的侵害，或调节宿主免疫、发育、社会行为等生理机能。DNA测序技术的进步改变了我们对地球上微生物生命多样性程度的认识，特别是原核细菌和古菌。然而，此类研究也强调了包括主要微生物谱系在内的大多数物种尚未达到进行培养的程度。因此，我们对微生物世界的大部分了解要么来自少数培养物种，要么来自与培养无关的研究产生的数据。尽管测序技术为微生物多样性和功能提供了重要的新见解，但获取关键非培养谱系的培养代表对于直接评估其代谢和生理功能至关重要。从而更深入地了解它们在自然环境中的生物学和生态作用。

随着培养物在后组学时代的价值日益得到认可，将未培养微生物“暗物质”引入培养的努力在过去十年中越来越受欢迎。传统的非靶向和新的高通量培养方法，如依赖于使用多种培养基和高通量筛选方法的培养组学平台，已经导致许多新的和以前未培养的谱系被带入培养。这种方法通常是劳动和资源密集型的，而且不一定能捕获群落中重要的特定目标微生物群。因此，我们感兴趣的未培养生物的遗传数据对于帮助它们的培养具有重要意义。事实上，与培养无关的数据(例如来自宏基因组测序和单细胞基因组学研究的数据)，通过确定基于目标生物独特属性的定制策略来有效分离目标微生物，从而扩大了靶向微生物分离的潜力。这种方法在挖掘未培养微生物所代表的丰富生物和遗传资源方面有着巨大的前景。本文综述了宏基因组引导的微生物分离方法的进展，以进一步表征新的微生物物种。

2 未培养微生物

关于估计地球上微生物的全球多样性的尝试引起了许多争议。虽然对细菌和古菌的多样性进行了各种各样的估计，但基于全球16S rRNA基因序列数据集的最新估计预测存在220-430万个原核操作分类单元(OTUs;以97%的相似性聚类)，类似于物种水平的分类群。由于此类调查中未捕获的基因组和表型多样性数据，全球原核生态类型的数量可能大大超过这些估计值。此外，重要的微生物类群如真菌、原生动物和其他单细胞真核生物在多样性评估中常常被忽视，但它们对微生物生态系统的功能有重要贡献。与微生物多样性相比，许多培养中的细菌种类来自4个细菌门(拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门和放线菌门)。这些门在肠道微生物群落中占主导地位，这可能反映了与不同环境相比，对人类肠道微生物群研究的浓厚兴趣。此外，据估计，未培养的属和门在整个地球微生物组中分别占7.3×1029(81%)和2.2×1029(25%)。在不同的非人类环境中，未培养物种是存在的最具优势的生物之一，被认为具有关键的生态作用，因此了解它们的生物学特性对于理解它们对这些生态系统的贡献很重要。在过去的10年中，从各种环境中分离和培养微生物的进展缓慢，因为有许多复杂的因素尚未被很好地理解，这些因素对实验室的培养构成了障碍。微生物生长的自然环境通常很复杂，并且在pH、温度和压力等参数上有所不同。也很难模拟严格的营养需求，所需的生长因子是未知的。此外，一些微生物在厌氧和其他极端条件下生长，需要专门的设备在实验室条件下进行复制。微生物也可能在自然界处于休眠状态，这需要克服才能使其在实验室中生长。在某些情况下，微生物需要与其他宿主或其他群落成员交叉喂养或密切互动。还有一些在环境中丰度很低的细菌或一些稀有物种，需要选择或富集策略来捕获，或需要强大的筛选分析来识别。这对于生长缓慢的细菌更具挑战性，因为它们在体外分离时可能无法与快速生长的物种竞争，因此它们的富集是一项更具挑战性的工作。

3 组学时代培养的重要性

稳定的纯微生物培养物是实验研究微生物性状的宝贵资源，通过功能表征研究确定新基因的活性，从而提高基因注释的准确性。培养物也可用于生成参考基因组数据，这些数据可进一步用于通过宏基因组和宏转录组分析来解释微生物群落功能。此外，培养物的可用性为各种结果的应用提供了新的可能性，包括健康和工业应用。

培养物能够在生化水平上研究微生物代谢，并揭示不同生长条件下未知的生理特征。这些特征很难从基因组数据中推断出来，因为不知道哪些基因被表达、它们的基因产物之间的相互作用，以及在不同环境条件下如何受到影响。通过对培养的微生物进行实验分析，发现了新的生化途径和酶促反应，这在单独的基因组分析中并不明显，而是通过培养和分析发现的。尽管元组学无疑可以为大多数未培养微生物的生物学提供相当多的见解，并能够产生新的假设，但活体培养物是实验检验这些假设和实现表型和生态学实验验证的宝贵资源，因此，人们正在努力培养更多的微生物物种。此外，多物种间相互作用、进化原理、种群动态和致病性只有在分离株可用时才能通过实验来验证。此外，培养物的可用性使其在工业过程、益生菌、种子接种剂等方面的应用潜力得到利用。菌种保藏代表生物存储库，使资源得以共享，并用于生物技术发现。

培养物的可用性将有助于丰富参考数据库和分类框架，这将进一步帮助生态系统中微生物功能的生物学解释。目前在KEGG等基因数据库中，存在的基因几乎有一半是功能不确定的基因，并且认识到许多注释并不准确。通过实验数据对微生物基因进行功能验证，将极大地提高注释的范围和准确性，从而进一步提高将更多未培养微生物引入培养的能力。此外，对生物进行分类是改进描述生物多样性的分类框架的核心。目前，国际原核生物命名规则只承认培养物为类型材料，因此无法正式命名未培养的生物。虽然群落研究正在努力改变这一立场，以将DNA序列识别为类型材料，但如果没有培养的代表，新物种就无法在分类学上进行正式描述。这导致了分类框架和对未培养生物的识别之间的差异，因此，有人建议开发一个未培养原核生物的命名代码，以将未培养生物的分类整合到现有框架中。

获得稳定的纯微生物培养物并不总是可行的，而富集培养和稳定的确定共培养对于获得对未培养生物的生物学见解也很有价值。富集培养提高了样本总微生物群中特定微生物群的种群密度。这是通过控制生长条件优先刺激目标微生物的生长来实现的。如果目标微生物的生长依赖于另一种微生物，例如通过交叉喂养一种微生物的代谢底物作为另一种微生物的底物，则可能需要两种或两种以上菌株的共培养。富集和共培养可用于进一步开发分离菌株的最佳生长条件，或用于常规培养维持。

4 从宏基因组数据预测和重建代谢通路

宏基因组学是对微生物群落成员的集体基因组的研究，可以为环境中未培养微生物提供有价值的见解。宏基因组测序通常使用鸟枪法测序进行，该方法是非区分性的，可以将分类和生物量化分配到物种水平，并允许对已识别的基因进行功能分配。宏基因组序列组装是分析的关键步骤，即单个DNA序列的拼接。宏基因组组装基因组(MAGs)是通过将具有相似特征的组装重叠群进行分箱和质量过滤而产生的。因此，MAGs可能代表高度相似的微生物菌株的微生物基因组。

短读长(如100-150 bp)下一代测序(NGS)技术，如Illumina测序，因其高通量和成本效益而广受欢迎。微生物基因组可以通过短读长测序数据进行组装，但这些宏基因组组装基因组的组装连续性受到重复元件的限制，这可以通过长配对末端方法在一定程度上克服这种限制。此外，密切相关菌株的存在阻碍了MAGs的恢复。相比之下，长序列reads可以跨越整个常见重复元件，如16S rRNA基因、微型反向重复转座元件、转座子、基因重复和原噬菌体序列，并且可以显著提高组装MAG的质量。测序技术的进步，其中长读长测序方法，如单管长片段测序技术(stLFR)、PacBio和Nanopore已被应用。这些技术使得从土壤、淡水湖和人类粪便样本中重建完整或单个循环基因组成为可能。虽然MAGs已经成为宏基因组数据集的一种流行且接近标准的分析方法，但它们因解决16S rRNA基因和生物合成基因簇(BGCs)、潜在污染、嵌合体、共线性和基因缺失、缺乏区分多染色体和染色体外成分的能力而受到批评。然而，通过使用长读长测序技术以及新的分箱算法可以提高MAG的质量，这些算法可以产生完全环化MAGs，从而提高其在功能解释和代谢重建中的价值。

虽然不是基于宏基因组测序，但单细胞基因组学，即从环境样本中的单细胞扩增的基因组信息的恢复，在本篇综述中也值得一提，因为它是另一种独立于培养的方法，可以对大多数未培养微生物产生遗传学见解。该技术已达到成熟阶段，目前可以以高通量方式快速获得数百个中、高质量的微生物单细胞扩增基因组(SAGs)。对这些基因组数据的分析还可以指导尚未培养的生物的培养。

MAGs和SAGs的功能注释对于代谢途径的重建和了解生物的功能潜力至关重要，以帮助它们的培养。宏基因组功能注释一般包括两个步骤：基因预测和基因注释。编码序列功能可以根据其与参考数据库中基因的相似性或通过功能域的隐马尔可夫模型(HMMs)来推断，如Pfam。KEGG通路、EggNOG、dbCAN、RGI、Gene Ontology(GO)术语、COG、MetaCyc、BioCyc、Brenda、Rhea、EcoCyc等数据库可用于揭示未培养生物的功能类别、蛋白结构域、代谢潜力和性状。

基于公共存储库中可用的参考途径，通过序列同源性来映射蛋白质序列，有助于预测和重建代谢途径。目前重建代谢途径的方法有BlastKOALA、KAAS、GhostKOALA和RAST。然而，仍有许多代谢途径未被确定或在某些成分未被识别的情况下不完整。此外，这些方法无法预测参考途径中不存在的新反应或酶。为了克服上述方法的不足，需要有基因组背景关联的强有力证据，如基因-基因相互作用、基于功能和系统发育图谱的分类和聚类。对这些数据进行解释，以确定营养或条件需求，以帮助分离和培养未培养的生物，这是一项重大任务，也是一项重大挑战。

根据其他与培养无关的基因组信息，可以采取多种策略以有针对性的方式将未培养的生物引入培养，如下所述。这些策略对比和补充了许多非靶向和高通量的微生物培养方法，如培养组学、原位培养、单细胞分离、iChip，这些方法在不同环境中获得了许多培养成功。宏基因组数据分析方法和新的培养策略的进展为识别感兴趣的微生物/功能并确定分离这些微生物/功能的靶向方法提供了新的机会。

5 宏基因组数据引导微生物分离策略 5.1 培养基优化

了解营养需求和代谢特征对未培养微生物的分离和稳定培养很重要。宏基因组序列数据提供了有价值的信息，如初级代谢、底物利用、氧需求、抗生素耐药性，甚至通过真核样蛋白与宿主的潜在相互作用，这为定义挑剔微生物的培养基和生长条件提供了机会(图1)。然而，转化基因组数据以了解目标生物的生理机能并非易事。这通常需要对相关代谢途径和生理学有深入的了解才能进行解释。尽管如此，这些方法已经成功应用于在不同环境(包括海洋和肠道)中分离和培养新微生物。

在Tyson等人的一项开创性研究中，利用酸性矿山排水生物膜的宏基因组数据，通过改进培养基设计，成功分离出一株参与固氮的Leptospirillum菌株。根据16S rRNA基因分析，Leptospirillum被分为I、II和III类。然而，在这项研究之前，已经确定了I类和II类的代表，但尚未获得II单个nif基因操纵子，II类Leptospirillum中缺乏该操纵子。他们推断，同样存在于生物膜中的II类Leptospirillum缺乏固氮基因。因此，对生长培养基进行了改良，使其缺氮，并根据固氮能力成功分离出III类Leptospirillum的第一个培养代表。

草食性塔马尔沙袋鼠(Macropus eugenii)的前肠每单位能量摄入产生的甲烷量明显少于反刍动物，且具有独特的肠道微生物群，其中未培养的琥珀酸弧菌科(Succinovibrionaceae)OTUs是变形菌门的主要成员。Pope等人利用分箱宏基因组组装数据，得到了大约2 Mbp(基因组大小接近3 Mbp)的数据，部分重建了琥珀酸弧菌科优势类群WG-1的氮和碳利用途径以及抗生素耐药性。WG-1被预测使用淀粉作为碳水化合物来源，该组合包括一个脲酶基因簇，编码尿素运输和分解代谢所需的所有13个基因。利用这一知识，他们开发了一种特定的培养基，其中淀粉和尿素分别作为唯一的碳水化合物和氮源。由于在WG-1组装中发现了一个假定的杆菌肽抗性基因，因此培养基中也提供了抗生素杆菌肽。采用这一策略，从沙袋鼠食糜样品中成功富集了WG-1，并将其在富集培养基上进行稀释和电镀，产生无菌培养物。这项研究提供了WG-1底物利用和培养发酵的详细特征，以进一步了解其对降低甲烷排放的贡献。

宏基因组测序可以鉴定推定的新物种的特定底物，然后利用这些底物通过培养方法分离新物种。Lugli等人利用该方法从动物粪便样本中分离出新型双歧杆菌。首先，组装宏基因组数据，然后将预测基因与糖基水解酶(GH)数据库进行比较，以评估双歧杆菌物种的糖生物组。作者预测，由阿拉伯半乳聚糖、支链淀粉、淀粉和木聚糖组成的聚糖是这些假定的新双歧杆菌物种的碳源。因此，使用各种化学成分确定的培养基进行培养实验，这些培养基含有如上所述的特定聚糖作为其唯一碳源。结果培养出13株表型不同的双歧杆菌分离株，它们能够代谢选定的聚糖，其中2株为双歧杆菌新物种。Karnachuk等人从深部含水层中培养出一种嗜热螺旋菌，其代表菌株BY33来自Brevinematales的一个新科。首先，从深部地下含水层的宏基因组中识别出一种新的MAG。该基因组信息表明，存在编码淀粉利用酶的基因，以及用于摄取胞外淀粉水解产物的麦芽糖/麦芽糊精ABC转运系统。最后，利用改良的麦芽糖和淀粉螺旋体培养基进行了富集培养实验，成功分离出BY33。Renesto等人的研究显示，病原菌Tropheryma whipplei的基因组揭示了其氨基酸生物合成的代谢缺陷。基因组中缺少9种氨基酸合成途径(组氨酸、色氨酸、亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和天冬酰胺)，这表明T. whipplei从外部环境中获取氨基酸或其前体。利用这一信息，开发了一种综合性细胞培养基，该培养基提供了缺失的氨基酸，并分离出先前从人类细胞中培养的3种T. whipplei菌株和来自临床样本的一种新菌株。虽然这个例子来源于基因组序列数据，但这种方法同样适用于来自未培养样本的SAG和MAG数据。

了解最佳生长条件也是细菌分离和培养的重要因素。David等人报道了一种有价值的工具，可以根据基因组信息预测最佳生长温度。作者认为，同样的原理可以很容易地应用于其他因素，如温度、pH值、盐度、渗透压或氧浓度。了解这些因素对于从极端环境中分离微生物(如嗜冷菌、嗜热菌和耐盐菌)至关重要。

图1 分离目标微生物群的特殊培养基设计方法。 5.2 抗生素耐药基因应用

微生物群中的抗生素耐药表型可以直接与特定的分类群相关联，并提供有用的表型信息，而这些信息不能轻易地从与培养无关的研究中获得。宏基因组学和网络分析能够分析抗生素耐药基因(ARGs)及其在微生物组中的共现模式(图1)。通过这种方式，可以检测和评估各种分类群的抗生素耐药表型的系统发育分布。绘制微生物之间的抗生素耐受性图谱可以有针对性地恢复以前未培养菌株的特定分类群。Rettedel等人使用这种方法确定了人类肠道微生物群中16种抗生素耐药表型的系统发育分布。使用这些抗生素的组合，他们鉴定出了4个分离株，其中2个是新物种，属于颤杆菌克属(Oscillibacter)。在上文Pope等人的示例中，杆菌肽被用于帮助选择WG-1，因为在WG-1组装中发现了一个假定的杆菌肽抗性基因。因此，抗生素耐受表型在培养应用中提供了有用的信息。

5.3 稳定同位素探测引导的RACS

另一种分离新微生物细胞的方法是稳定同位素探测引导的拉曼激活微生物细胞分选(RACS)，可产生适合培养的活细胞(图1)。宏基因组序列数据提供了有关初级代谢、底物利用、氧需求、抗生素耐药性等性状的宝贵信息，这为确定微生物的培养基和生长条件提供了机会。氘同位素探测(DIP)的拉曼显微镜已被证明可以识别特定培养基中具有代谢活性的目标细菌。因此，基于在重水(D2O)孵育期间使用稳定同位素氘标记，可以通过MAG或SAG设计的确定培养基分离目标细菌，包括但不限于特定底物或抗生素。D2O是一种有效的DIP探针，用于拉曼检测从2000-2300 cm−1的C-H带偏移的底物。当样品在含有特定代谢底物和D2O的设计培养基中孵育时，代谢激活的细菌会在单细胞拉曼光谱(SCRS)中产生C-D带。然后，RACS有助于根据SCRS分离这些目标细菌。

Yi等人利用RACS原位检测人体肠道微生物群中代谢激活的抗生素耐药细菌。粪便样本在补充有D2O 40% (v/v)和抗生素(阿莫西林、头孢氨苄、氟苯尼考、四环素、万古霉素)的PBS中在37°C培养24小时。他们成功对6个样本进行了分类，包括2个阿莫西林耐药细菌、2个头孢氨苄耐药细菌(CephR)和2个头孢菌素敏感细菌(CephS)。Kang等人应用这种方法对小鼠结肠中参与黏蛋白降解的细菌进行分类。将结肠内容物悬浮在含有50% D2O的PBS和猪胃黏蛋白中，并进行厌氧培养。RACS鉴定出了一个多样化的细菌菌群，包括未充分探索的鼠杆菌科(Muribaculaceae)的几个成员。

如果微生物细胞的拉曼光谱中有足够大的峰，RACS平台可以很容易地定制，以便根据其他参数(如储存化合物、色素和其他化合物)对细胞进行分类。例如，Yun等人根据13C和15N对从口腔分离的5种不同类型的细菌进行了分类。这些研究强调了拉曼激活细胞分选在组学时代识别和分离靶向过程中关键参与者的潜力。

5.4 反向基因组学引导分离

Cross等人描述了一种基因组信息抗体工程方法，用于从复杂群落中捕获之前未培养的感兴趣微生物，他们称之为反向基因组学。与其他标记技术不同，使用特异性抗体能够有效地标记靶细胞，同时保持其培养活力(图2)。简而言之，未培养的相关微生物的基因组数据可能来自Cross等人使用的单细胞基因组学，但也可能来自组装的宏基因组数据，挖掘用于预测编码膜蛋白的基因，这些膜蛋白具有特定于目标微生物的细胞外表位。抗原肽被合成并用于提高抗体，然后对其进行荧光标记。然后，让抗体与复杂的微生物群样本结合，使用荧光激活细胞分选(FACS)从群落中检索荧光标记的靶细胞。靶细胞在整个过程中都保持活力，并被用作成功建立新培养物的接种物，尽管人们承认，只有在确定目标微生物的良好培养条件时才能实现培养。

Cross等人利用这种方法从人类唾液样本中培养了Saccharibacteria(TM7)，属于候选门级辐射类群细菌，代表了3个不同物种水平的Saccharibacteria谱系。利用反向基因组学方法首次对人类口腔样本中丰度较低的SR1/Absconditabacteria进行了培养。这些成功突显了反向基因组学在加速培养其他感兴趣的未培养微生物方面的潜力，包括古菌，特别是那些生长缓慢、丰度低和/或稀有的微生物物种。

图2 流程图展示了基因组信息抗体工程反向基因组学靶向分离和培养微生物的方法。 5.5 基因靶向分离

宏基因组序列数据可用于识别用于靶向分离微生物的基因。这些基因可能包括感兴趣的功能基因，通过宏基因组测序可以揭示这些功能基因的特定变异。鸟枪法宏基因组测序reads也有可能揭示罕见的16S核糖体RNA基因序列，这些序列可能不易在扩增子测序数据集中检测到，因为质量过滤步骤会去除低丰度reads。Ma等人描述了一种直接方法，该方法以有针对性的方式培养携带宏基因组数据中确定的感兴趣基因的微生物。该方法使用带有纳升孔的微流体装置进行，该装置允许来自单个细胞的微菌落生长，包括两个主要步骤：确定目标生物的培养条件和分离目标。样品在生长培养基中稀释，因此微流控芯片中每个孔最多只有一个细胞，尽管大多数孔是空的，以尽量减少一个孔中出现多个细胞。培养后，该芯片允许每个微菌落分裂为两个，从其中一个微菌落上对感兴趣的基因进行PCR，以确定允许靶细胞生长的培养条件。一旦确定了培养条件，将细胞进一步应用于芯片并生长，然后对微菌落进行单独PCR筛选，以确定含有靶标的隔室，然后可以从芯片另一半的相应孔中提取活细胞进行扩大培养(图3)。Ma等人通过从人类盲肠活组织培养一种细菌来验证这种方法，并培养出了以前未鉴定的瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)属的代表。这种方法克服了不同微生物生长动力学的采样偏差，并且芯片的小尺寸使得只能使用少量的生长刺激物，并用于厌氧环境中，以分离严格的厌氧菌，例如肠道环境中的厌氧菌。小体积培养方法的难点在于气态底物的供应。然而，增强和提供液滴微流体均匀供氧的新方法可应用于微孔板。

荧光原位杂交(FISH)标记的样本可以通过荧光激活细胞分选(FACS)进行分选，以富集属于选定分类群的细胞，这种方法有望利用从宏基因组序列数据衍生的探针序列捕获感兴趣的靶细胞。宏基因组序列数据可用于设计FISH探针，以对携带感兴趣基因的目标微生物群进行分类。然而，标准的FISH程序需要固定细胞样本，使细胞无法存活；因此，标记细胞的培养是不可能的。最近取得了一些进展，通过去除固定步骤(live-FISH)来改进FISH程序，这使得能够对特定的细菌分类群进行分类，并随后对其进行培养。Tan等人展示了直接从宏基因组鸟枪法测序数据集(R-probes)获得的短序列reads设计FISH探针的使用，这些探针用于污水处理厂样本。R-probes是根据ribotags设计的，其中V6高变区标签序列(默认长度为33 bp)用作FISH探针设计的模板，并通过FISH-FACS程序使用Ribo_Unk1029_17成功富集了一个新的细菌分类群(UPWRP_1)，该分类群被分配给Sphingobacteriales。在某些情况下，高变区的探针设计允许分化到物种水平。这种方法与live-FISH相结合，可以培养目标物种。

一些抗生素通过直接结合特定的细菌表面结构发挥作用，从而提供了将这些药物用作细菌探针的机会。保留细菌结合能力的荧光团衍生抗生素探针已成为分离细菌的便捷工具，并已被用于在体外和体内追踪不同的细菌种类。

此外，基因组编辑还可以用于分离新的目标微生物。基于MAGs序列信息对特定基因进行编辑，可以方便设计含有选择性抗生素或底物的培养基，从而能够正向选择已编辑的微生物细胞，而对未编辑的细胞进行负向选择(图3)。

Rubin等人描述并验证了编辑微生物群落中特定生物基因组的一般策略。他们利用VcDART转座子设计了密歇根克雷伯氏菌(Klebsiella michiganensis)和猴假单胞菌(Pseudomonas simiae)中pyrF基因的功能缺失突变。突变的转座子携带两种抗生素耐药标记，使其对链霉素、大观霉素和羧苄青霉素产生耐药性。这些微生物被成功地富集到＞99%的丰度。此外，对目标细菌的乳糖同化基因进行基因编辑，并在生长培养基中提供乳糖作为唯一碳源，成功地将目标细菌的丰度提高到~95%。基因编辑引导富集的方法也具有高分辨率，可以区分同一物种中的不同菌株，如大肠杆菌亚种2和3。

图3 微生物基因靶向分离方法综述。 6 宏基因组引导微生物分离的挑战和局限性

虽然已经有许多研究成功地使用宏基因组序列数据来指导微生物的分离和培养，但要获得更广泛的成功，仍有一些挑战和局限性有待克服。

基因组信息抗体工程为微生物的靶向培养提供了一个令人兴奋的新机会，但存在一些局限性。首先，可能无法识别合适的表面暴露表位，因为来自近缘物种的同源物的结构数据可能会改善对这些区域的预测，但并不总是可用。其次，目标膜蛋白的原位表达水平也可能过低而无法捕获抗体。然而，基因表达或蛋白质组学数据可用于鉴定高表达的膜蛋白。最后，目标表位的翻译后修饰(如糖基化)可能会在空间上阻碍抗体对其表位的识别。为了克服这些挑战，可以选择几个表位作为抗原，或者使用整个蛋白结构域，但这可能会以牺牲特异性为代价。

厌氧微生物的靶向分离可能对某些靶向分离方法(例如涉及细胞分选仪的方法)构成额外的技术挑战。由于其尺寸，在标准厌氧室中使用细胞分选仪通常受到限制。在这方面，开发可在厌氧条件下使用的基于荧光的细胞分选仪将是有价值的。

一旦分离出目标生物，为了使其持续生长，必须找到合适的生长培养基和物理化学条件。然而，由于自然环境的化学成分通常是未知的，单靠基因组序列往往不能提供足够的信息来准确地确定成功培养特定微生物的所有必需条件。例如，Lavy等人根据Candidatus Poribacteria sp. WGA-4E的基因组数据设计了一种培养基。虽然从基因组数据中推断出了该门的代谢特性，如可能利用尿素作为氮源和同化硫酸盐还原代谢，但在所使用的条件下，这种特定的培养基并没有导致在培养物中捕获Poribacteria。培养基成分的浓度对于Poribacteria来说可能不是最理想的，或者可能需要添加信号分子。通过阶乘试错法将宏基因组学方法与其他经验方法(如培养组学、原位培养、单细胞分离)相结合，可能有助于研究人员实现培养。

从感兴趣的目标生物中恢复基因组数据以深入了解培养策略，在很大程度上依赖于DNA提取方法的代表性和有效性，这些方法常见的问题是细胞提取不完整、细胞裂解或DNA降解。这些可能会影响某些物种在宏基因组数据中的代表性。单细胞基因组学是重建目标微生物基因组草案的另一种选择，但这需要专业技术知识。

结论

DNA测序技术的快速发展揭示了自然界中大量尚未培养的微生物。现在，挑战在于使用这些数据来支持培养和探索有关微生物和微生物群落在其自然栖息地中的作用的生态问题。宏基因组测序不仅为微生物组的功能提供了新的见解，还为微生物的分离和培养带来了新的机会，而且对于后者具有更大的潜力。特别是，长读长DNA测序技术、更深的测序深度和先进的生物信息学方法可以通过MAGs提高个体和物种基因组数据的质量，使代谢解释更加准确。这些数据支持新型培养基的开发、基因组信息抗体工程和基因靶向培养，并已成功从不同环境中分离出多种微生物。由宏基因组和与培养无关的序列数据指导的微生物分离的可能性很大，并且可以显著增加成功培养感兴趣的目标生物的机会。但人们认识到靶向培养的过程很复杂，目前需要很好的理解基因组数据来预测培养要求，或者是所有微生物实验室都不容易获得的先进技术；但这种靶向方法可以减少分离特定目标微生物并将其带入培养的总时间。现在面临的挑战是利用大量独立于培养的基因数据进行高通量靶向培养，再加上培养方法的进步，可能会在捕获大多数未培养微生物方面取得新的突破。 原文链接：https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-022-01272-5 获取此篇微文原文pdf请扫描下方二维码联系微科盟多组学老师即可。

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